✖


Jump to content

протеиновый день

(Перенаправлено с тегов белка )

Белковые метки представляют собой пептидные последовательности, генетически привитые к рекомбинантному белку . Метки прикрепляются к белкам для различных целей. Их можно добавлять к любому концу целевого белка, поэтому они специфичны либо к С-концу, либо к N-концу , либо специфичны как к С-концу, так и к N-концу. Некоторые метки также вставляются в участки интересующего белка; они известны как внутренние теги. [1]

К белкам добавляются метки сродства, чтобы их можно было очистить от сырого биологического источника с помощью метода сродства. Аффинные метки включают хитинсвязывающий белок (CBP), мальтозосвязывающий белок (MBP), Strep-метку. [2] и глутатион-S-трансфераза (GST). Метка поли(His) представляет собой широко используемую белковую метку, которая связывается с матрицами, содержащими иммобилизованные ионы металлов.

Метки солюбилизации используются, особенно для рекомбинантных белков, экспрессируемых в таких видах, как E. coli , чтобы способствовать правильному сворачиванию белков и предотвращать их агрегацию в тельцах включения . Эти метки включают тиоредоксин (TRX) и поли(NANP). Некоторые аффинные метки, такие как MBP и GST, выполняют двойную роль в качестве агента солюбилизации.

Хроматографические метки используются для изменения хроматографических свойств белка, чтобы обеспечить различное разрешение в зависимости от конкретного метода разделения. Часто они состоят из полианионных аминокислот, таких как FLAG-тег или полиглутаматный тег. [3]

Эпитопные метки представляют собой короткие пептидные последовательности, выбранные потому, что антитела с высокой аффинностью можно надежно производить у многих различных видов. Обычно они происходят из вирусных генов, что объясняет их высокую иммунореактивность. Теги эпитопа включают ALFA-тег, V5-тег , Myc-тег , HA-тег , Spot-тег , T7-тег и NE-тег . Эти метки особенно полезны для вестерн-блоттинга , иммунофлуоресценции и экспериментов по иммунопреципитации , хотя они также находят применение при очистке антител.

Флуоресцентные метки используются для визуального определения белка. Зеленый флуоресцентный белок (GFP) и его варианты являются наиболее часто используемыми флуоресцентными метками. [4] Более продвинутые применения GFP включают использование его в качестве складчатого репортера (флуоресцентного в сложенном виде и бесцветного в противном случае).

Белковые метки могут допускать специфическую ферментативную модификацию (например, биотинилирование биотинлигазой) или химическую модификацию (например, связывание с другими белками через SpyCatcher или реакцию с FlAsH-EDT2 для флуоресцентной визуализации). Часто метки комбинируются, чтобы связать белки с несколькими другими компонентами. Однако с добавлением каждой метки возникает риск того, что нативная функция белка может быть нарушена из-за взаимодействия с меткой. Поэтому после очистки метки иногда удаляются путем специфического протеолиза (например, с помощью протеазы TEV , тромбина , фактора Ха или энтеропептидазы ) или интеина сплайсинга .

Список белковых тегов

[ редактировать ]

( см. в разделе «Протеиногенная аминокислота № Химические свойства коды аминокислот AZ »).

Пептидные метки

[ редактировать ]
  • ALFA-tag — спиральная пептидная метка, разработанная de novo (SRLEEELRRRLTE) для биохимических и микроскопических исследований. Метка распознается репертуаром однодоменных антител. [5]
  • AviTag, пептид, обеспечивающий биотинилирование ферментом BirA и позволяющий выделять белок с помощью стрептавидина (GLNDIFEAQKIEWHE).
  • C-tag, пептид, который связывается с однодоменным антителом верблюдовых, разработанным с помощью фагового дисплея (EPEA). [6] [7]
  • Кальмодулин-таг , пептид, связанный с белком кальмодулином (KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL).
  • i CapTag™ ( интеиновая ) метка захвата , самоудаляющаяся метка на основе пептидов (MIKIATRKYLGKQNVYGIGVERDHNFALKNGFIAHN). CapTag i ™ контролируется изменением pH (обычно от pH 8,5 до pH 6,2). Таким образом, эту технологию можно адаптировать к широкому спектру буферов, адаптированных к целевым значениям pH 8,5 и 6,2. Ожидаемая чистота целевых белков или пептидов составляет 95–99%. i интеина CapTag™ содержит запатентованный компонент, полученный из punctiforme (Npu) Nostoc . Эта метка используется для очистки рекомбинантных белков и их фрагментов. Его можно использовать в исследовательских лабораториях, а также он предназначен для крупномасштабной очистки в ходе последующего производственного процесса. Комплекс i CapTag™-целевой белок может быть экспрессирован в широком диапазоне экспрессирующих хозяев ( например, в клетках CHO и E.coli ). Он не предназначен для полностью экспрессированных моноклональных антител. [8] [9] [10]
  • полиглутаматная метка, пептид, эффективно связывающийся с анионообменной смолой, такой как Mono-Q (EEEEEE) [3]
  • полиаргининовая метка, пептид, эффективно связывающийся с катионообменной смолой (от 5 до 9 последовательных R)
  • E-tag, пептид, распознаваемый антителом (GAPVPYPDPLEPR).
  • FLAG-tag , пептид, распознаваемый антителом (DYKDDDDK). [11]
  • HA-tag , пептид гемагглютинина, распознаваемый антителом (YPYDVPDYA). [12]
  • His-tag , 5-10 гистидинов, связанных хелатом никеля или кобальта (HHHHHH)
    • Gly-His-теги представляют собой N-концевые варианты His-тегов (например, GHHHH, или GHHHHHH, или GSSHHHHHH), которые все еще связываются с иммобилизованными катионами металлов, но также могут быть активированы посредством азидоглюконилирования для обеспечения возможности применения клик-химии. [13]
  • Myc-tag , пептид, полученный из c- myc , распознаваемый антителом (EQKLISEEDL).
  • NE-tag , синтетический пептид из 18 аминокислот (TKENPRSNQEESYDDNES), распознаваемый моноклональным антителом IgG1, который полезен в широком спектре применений, включая вестерн-блоттинг, ELISA, проточную цитометрию, иммуноцитохимию, иммунопреципитацию и аффинную очистку рекомбинантных белков. [14]
  • Rho1D4-tag относится к последним 9 аминокислотам внутриклеточного С-конца бычьего родопсина (TETSQVAPA). Это очень специфическая метка, которую можно использовать для очистки мембранных белков .
  • S-tag , пептид, полученный из рибонуклеазы А (KETAAAKFERQHMDS).
  • SBP-tag , пептид, связывающийся со стрептавидином (MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP) [15]
  • Softag 1 для экспрессии у млекопитающих (SLAELLNAGLGGS)
  • Softag 3 для прокариотической экспрессии (TQDPSRVG)
  • Spot-tag , пептид, распознаваемый нанотелом ( PDRVRAVSHWSS) для иммунопреципитации, аффинной очистки, иммунофлуоресценции и микроскопии сверхвысокого разрешения.
  • Strep-tag , пептид, который связывается со стрептавидином или модифицированным стрептавидином, называемым стрептактином (Strep-tag II: WSHPQFEK). [2]
  • T7-tag , эпитопная метка, полученная из основного капсидного белка T7 гена T7 (MASMTGGQQMG). Используется в различных иммуноанализах, а также для аффинной очистки. В основном используется. [16]
  • Тег TC , тег тетрацистеина, который распознается бимышьяковыми соединениями FlAsH и ReAsH (CCPGCC).
  • Ty tag (EVHTNQDPLD)
  • Тег V5 , пептид, распознаваемый антителом (GKPIPNPLLGLDST) [17]
  • VSV-тег, пептид, распознаваемый антителом (YTDIEMNRLGK).
  • Xpress-тег (DLYDDDDK), пептид, распознаваемый антителом.

Ковалентные пептидные метки

[ редактировать ]
  • Изопептаг , пептид, который ковалентно связывается с белком пилин-С (TDKDMTITFTNKKDAE). [18]
  • SpyTag , пептид, который ковалентно связывается с белком SpyCatcher (AHIVMVDAYKPTK). [19]
  • SnoopTag , пептид, который ковалентно связывается с белком SnoopCatcher (KLGDIEFIKVNK). [20] Второе поколение, SnoopTagJr, также было разработано для привязки к SnoopCatcher или DogTag (при посредничестве SnoopLigase) (KLGSIEFIKVNK). [21]
  • DogTag, пептид, который ковалентно связывается с DogCatcher (DIPATYEFTDGKHYITNEPIPPK), [22] а также может ковалентно связываться с SnoopTagJr при посредничестве SnoopLigase. [21]
  • SdyTag, пептид, ковалентно связывающийся с белком SdyCatcher (DPIVMIDNDKPIT). [23] SdyTag/SdyCatcher обладает кинетически-зависимой перекрестной реактивностью со SpyTag/SpyCatcher.

Белковые теги

[ редактировать ]
  • BCCP (биотин-карбоксильный белок-носитель), белковый домен, биотинилированный BirA , обеспечивающий распознавание стрептавидином.
  • BromoTag , мутированная версия второго бромодомена Brd4, Brd4-BD2 L387A, с мутацией типа «bump-and-hole», которая может высокоселективно связываться с помощью специфичного для метки деградатора PROTAC AGB1 с образованием тройного комплекса между белком «BromoTagged» и Лигаза E3 VHL, приводящая к убиквитинированию меченого белка и его последующей быстрой и эффективной протеасомной деградации в клетках. [24]
  • FAST (тег, активирующий флуоресценцию и изменяющий поглощение), мутировавший фотоактивный желтый белок (PYP), который обратимо связывает родственные флуорогенные лиганды.
  • CL7 -tag, сконструированный вариант колицина E7, который обладает сильным сродством к связыванию и специфичностью к иммобилизованному иммунному белку 7 (Im7). [25]
  • Глутатион-S-трансфераза- метка, белок, который связывается с иммобилизованным глутатионом.
  • Зеленый флуоресцентный белок -метка, [4] белок, который спонтанно флуоресцирует и может связываться нанотелами
  • HaloTag , мутировавшая бактериальная галоалкандегалогеназа , которая ковалентно прикрепляется к галогеналкановым субстратам.
  • SNAP-tag , мутировавшая эукариотическая ДНК-метилтрансфераза , которая ковалентно присоединяется к бензилгуанина. производным
  • CLIP-tag , мутировавшая эукариотическая ДНК-метилтрансфераза , которая ковалентно присоединяется к бензилцитозина . производным
  • HUH-tag , специфичный для последовательности одноцепочечный ДНК-связывающий белок, который ковалентно связывается со своей целевой последовательностью.
  • Мальтозосвязывающий белок -tag, белок, который связывается с амилозо-агарозой. [26]
  • День Нуса
  • Тиоредоксин -тег
  • Fc -метка, полученная из Fc-домена иммуноглобулина, допускает димеризацию и солюбилизацию. Может использоваться для очистки на сефарозе белка-А.
  • Разработаны внутренне неупорядоченные метки, содержащие аминокислоты, способствующие нарушению (P,E,S,T,A,Q,G,..) [27]
  • Домен распознавания углеводов или CRDSAT -tag, белок, который связывается с лактозной агарозой или сефарозой. [28]

Другие

[ редактировать ]

HiBiT-тег был разработан учеными компании Promega. Это пептидная метка из 11 аминокислот, которую можно присоединить к N- или C-концу или к внутренним участкам белков. [29] Его небольшой размер приводит к быстрому связыванию этой метки с другими белками с помощью технологии CRISPR/Cas9. [29]

Приложения

[ редактировать ]

Ссылки

[ редактировать ]
  1. ^ Махмуди Гомари, Мохаммед; Сарайгорд-Афшари, Неда; Фарсимадан, Марзие; Ростами, Неда; Агамири, Шахин; Фарахоллахи, Мохаммад М. (декабрь 2020 г.). «Возможности и проблемы методов очистки белков с помощью меток: применение в фармацевтической промышленности» . Достижения биотехнологии . 45 : 107653. doi : 10.1016/j.biotechadv.2020.107653 . ISSN   0734-9750 . ПМИД   33157154 . S2CID   226276355 .
  2. ^ Jump up to: а б Шмидт, Томас ГМ; Кепке, Юрген; Фрэнк, Рональд; Скерра, Арне (1996). «Молекулярное взаимодействие между аффинным пептидом Strep-tag и его родственной мишенью, стрептавидином». Журнал молекулярной биологии . 255 (5): 753–66. дои : 10.1006/jmbi.1996.0061 . ПМИД   8636976 .
  3. ^ Jump up to: а б Фэйрхед М., Крндиджа Д., Лоу Э.Д., Ховарт М. (январь 2014 г.). «Сопряжение по принципу «подключи и работай» с помощью определенных двухвалентных стрептавидинов» . Журнал молекулярной биологии . 426 (1): 199–214. дои : 10.1016/j.jmb.2013.09.016 . ПМК   4047826 . ПМИД   24056174 .
  4. ^ Jump up to: а б Чжан, Цзинь; Кэмпбелл, Роберт; Тинг, Алиса; Цянь, Роджер (2002). «Создание новых флуоресцентных зондов для клеточной биологии». Nat Rev Mol Cell Biol . 3 (12): 906–918. дои : 10.1038/nrm976 . ПМИД   12461557 . S2CID   11588100 .
  5. ^ Гётцке, Хансйорг; Килиш, Маркус; Мартинес-Карранса, Маркель; Сограте-Идрисси, Шама; Раджавел, Абирами; Шлихтаерле, Томас; Энгельс, Никлас; Юнгманн, Ральф; Стенмарк, Пал; Опазо, Фелипе; Фрей, Штеффен (2019). «ALFA-tag — это универсальный инструмент для бионаучных приложений на основе нанотел» . Природные коммуникации . 10 (1): 4403. Бибкод : 2019NatCo..10.4403G . дои : 10.1038/s41467-019-12301-7 . ПМК   6764986 . ПМИД   31562305 .
  6. ^ Де Генст, Эрвин Дж.; Гильямс, Тим; Велленс, Шутка; О'Дей, Элизабет М.; Воудби, Кристофер А.; Михан, Сара; Дюмулен, Мирей; Сюй, Шан-Те Дэнни; Кремадес, Нунило; Шушуерен, Коэн Х.Г.; Извините, Элс; Винс, Лод; Стейерт, Джон; Христодулу, Джон; Добсон, Кристофер М. (сентябрь 2010 г.). «Структура и свойства комплекса α-синуклеина и однодоменного антитела верблюда» (PDF) . Журнал молекулярной биологии . 402 (2): 326–343. дои : 10.1016/j.jmb.2010.07.001 . ПМИД   20620148 .
  7. ^ «Матрица аффинности C-tag CaptureSelect - Thermo Fisher Scientific» . www.thermofisher.com .
  8. ^ Купер, Меридет А.; Тарис, Джозеф Э.; Ши, Чанхуа; Вуд, Дэвид В. (2018). «Удобный метод метки расщепления интеина для очистки целевых белков без меток» . Современные протоколы в науке о белках . 91 (1): 5.29.1–5.29.23. дои : 10.1002/cpps.46 . ISSN   1934-3655 . ПМИД   29516483 . S2CID   3749506 .
  9. ^ Прабхала, Саи Вивек; Гирах, Изабела; Вуд, Дэвид В. (2022). «Эволюция методов аффинности на основе интеина, отраженная в 30-летней истории патентов» . Границы молекулярной биологии . 9 : 857566. дои : 10.3389/fmolb.2022.857566 . ISSN   2296-889X . ПМК   9033041 . ПМИД   35463948 .
  10. ^ « Технология i CapTag™ — наука о захвате белка» . www.proteincapturescience.com .
  11. ^ Эйнхауэр, А.; Юнгбауэр, А. (2001). «Пептид FLAG™, универсальная слитая метка для очистки рекомбинантных белков». Журнал биохимических и биофизических методов . 49 (1–3): 455–65. дои : 10.1016/S0165-022X(01)00213-5 . ПМИД   11694294 .
  12. ^ Пракрия, Мурали; Феске, Стефан; Гвак, Юсанг; Шрикант, Сонал; Рао, Анжана; Хоган, Патрик Г. (2006). «Orai1 является важной субъединицей поры канала CRAC». Природа . 443 (7108): 230–3. Бибкод : 2006Natur.443..230P . дои : 10.1038/nature05122 . ПМИД   16921383 . S2CID   4310221 .
  13. ^ Брюн, Карл Д.; Ликни, Ильва; Сутов, Григорий; Моррис, Александр Р.; Йовичевич, Деяна; Фордж, Гиннесс; Казак, Энди; Клюг, Ричард; Кастальяна, Сабина; Заякина, Анна; Джонсон, Юрис; Скрэстин, Даце; Спунде, Карин; Коэн, Александр А.; Бьоркман, Памела Дж.; Моррис, Ховард Р.; Суна, Эдгар; Тар, Каспар (16 ноября 2021 г.). «N-концевая модификация белков, меченных Gly-His, азидоглюконолактоном» . ХимБиоХим . 22 (22): 3199–3207. дои : 10.1002/cbic.202100381 . ISSN   1439-7633 . ПМИД   34520613 . S2CID   237515136 .
  14. ^ Хо, Филип В.Л.; Це, Зеро ХМ.; Лю, Х.Ф.; Лу, С.; Хо, Джессика ВМ.; Кунг, Мишель Х.В.; Рамсден, Дэвид Б.; Хо, СЛ. (2013). «Оценка клеточной эстрогенной активности на основе опосредованного рецептором эстрогена снижения экспрессии растворимой формы катехол-О-метилтрансферазы (КОМТ) в системе на основе ИФА» . ПЛОС ОДИН . 8 (9): e74065. Бибкод : 2013PLoSO...874065H . дои : 10.1371/journal.pone.0074065 . ПМЦ   3765251 . ПМИД   24040167 .
  15. ^ Киф, Энтони Д.; Уилсон, Дэвид С.; Силиг, Буркхард; Шостак, Джек В. (2001). «Одноэтапная очистка рекомбинантных белков с использованием наномолярного стрептавидинсвязывающего пептида, SBP-метки». Экспрессия и очистка белков . 23 (3): 440–6. дои : 10.1006/преп.2001.1515 . ПМИД   11722181 .
  16. ^ «Теги эпитопов и слитые белки - антитела онлайн» . www.antibodies-online.com .
  17. ^ МакНатт, Марки К.; Лагас, Томас А.; Хортон, Джей Д. (2007). «Каталитическая активность не требуется для секретируемого PCSK9 для уменьшения количества рецепторов липопротеинов низкой плотности в клетках HepG2» . Журнал биологической химии . 282 (29): 20799–803. дои : 10.1074/jbc.C700095200 . ПМИД   17537735 .
  18. ^ Закери, Бижан; Ховарт, Марк (2010). «Спонтанное образование межмолекулярных амидных связей между боковыми цепями для необратимого нацеливания пептидов». Журнал Американского химического общества . 132 (13): 4526–7. дои : 10.1021/ja910795a . ПМИД   20235501 .
  19. ^ Закери, Бижан; Фирер, Джейкоб О.; Челик, Эмра; Читток, Эмили К.; Шварц-Линек, Ульрих; Мой, Винсент Т.; Ховарт, Марк (2012). «Пептидная метка, образующая быструю ковалентную связь с белком посредством создания бактериального адгезина» . Труды Национальной академии наук . 109 (12): E690–7. Бибкод : 2012PNAS..109E.690Z . дои : 10.1073/pnas.1115485109 . ПМК   3311370 . ПМИД   22366317 .
  20. ^ Веджиани, Джанлука; Накамура, Томохико; Бреннер, Майкл; Гайе, Рафаэль; Ян, Джун; Робинсон, Кэрол; Ховарт, Марк (2016). «Программируемые полипротеамы, построенные с использованием двойных пептидных суперклеев» . Труды Национальной академии наук . 113 (5): 1202–7. Бибкод : 2016ПНАС..113.1202В . дои : 10.1073/pnas.1519214113 . ПМЦ   4747704 . ПМИД   26787909 .
  21. ^ Jump up to: а б Булдун, Джан М.; Джин, Джису X.; Бедфорд, Майкл Р.; Ховарт, Марк (14 февраля 2018 г.). «SnoopLigase катализирует пептид-пептидную блокировку и обеспечивает твердофазную изоляцию конъюгата» . Журнал Американского химического общества . 140 (8): 3008–3018. дои : 10.1021/jacs.7b13237 . ПМИД   29402082 . S2CID   207189163 .
  22. ^ Кибл, Энтони Х.; Ядав, Викаш К.; Ферла, Маттео П.; Бауэр, Клаудия К.; Чунтарпурсат-Бон, Эулашини; Хуан, Цзинь; Бон, Робин С.; Ховарт, Марк (июль 2021 г.). «DogCatcher позволяет осуществлять петлевое лигирование белок-белок» . Клеточная химическая биология . 29 (2): 339–350.e10. doi : 10.1016/j.chembiol.2021.07.005 . ISSN   2451-9456 . ПМЦ   8878318 . ПМИД   34324879 .
  23. ^ Тан, Ли Лин; Хун, Шон С.; Вонг, Фонг Т.; Ахмед, С. Ашраф (26 октября 2016 г.). «Кинетические контролируемые взаимодействия меток-ловушек для направленной сборки ковалентного белка» . ПЛОС ОДИН . 11 (10): e0165074. Бибкод : 2016PLoSO..1165074T . дои : 10.1371/journal.pone.0165074 . ПМК   5082641 . ПМИД   27783674 .
  24. ^ Чулли, Бонд; Алесси, Крейгон (октябрь 2021 г.). «Разработка BromoTag: система PROTAC «Bump-and-Hole» для индукции мощной, быстрой и селективной деградации меченых целевых белков» . J Med Chem . 64 (20): 15477–15502. doi : 10.1021/acs.jmedchem.1c01532 . ПМЦ   8558867 . ПМИД   34652918 .
  25. ^ Чоу, Луиза Т.; Васильев, Дмитрий Георгиевич (2022). «Применение новой аффинной системы CL7/Im7 для очистки сложных и фармацевтических белков» . Аффинная хроматография . Методы молекулярной биологии. Том. 2466. стр. 61–82. дои : 10.1007/978-1-0716-2176-9_5 . ISBN  978-1-0716-2175-2 .
  26. ^ Бедуэль, Хьюг; Дюплей, Паскаль (февраль 1988 г.). «Производство в Escherichia coli и одностадийная очистка бифункциональных гибридных белков, связывающих мальтозу. Экспорт полимеразы Кленова в периплазматическое пространство» . Eur J Biochem . 171 (3): 541–549. дои : 10.1111/j.1432-1033.1988.tb13823.x . ПМИД   3278900 .
  27. ^ Минд, Дэвид П; Хальффф, Элс Ф; Танс, Сандер (2013). «Проектирование беспорядка: рассказы о неожиданных хвостах» . Внутренне неупорядоченные белки . 1 (1): 5–15. дои : 10.4161/idp.26790 . ПМК   5424805 . ПМИД   28516025 .
  28. ^ Кризник, Александр; Йелехе-Окума, Мелисса; Лек, Жан-Кристоф; Грошенри, Уильям; Ле Кордье, Элен; Чаррон, Кристоф; Кинтернет, Марк; Мазон, Гортензия; Тальфурнье, Франсуа; Боски-Мюллер, Сандрин; Жузо, Жан-Ив; Ребул, Паскаль (октябрь 2018 г.). «CRDSAT, созданный pCARGHO: новый эффективный метод аффинной метки на основе лектина для безопасной, простой и недорогой очистки белков» . Биотехнолог Дж. 14 (4): 1800214. doi : 10.1002/biot.201800214 . ПМИД   30298550 . S2CID   52942568 .
  29. ^ Jump up to: а б Швинн, Мари К.; Махлейдт, Томас; Циммерман, Крис; Эггерс, Кристофер Т.; Диксон, Эндрю С.; Херст, Робин; Холл, Мэри П.; Энселл, Лэнс П.; Бинковски, Брок Ф.; Вуд, Кейт В. (16 февраля 2018 г.). «CRISPR-опосредованное мечение эндогенных белков люминесцентным пептидом» . АКС Химическая биология . 13 (2): 467–474. doi : 10.1021/acschembio.7b00549 . ISSN   1554-8929 . ПМИД   28892606 .
Retrieved from "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Protein_tag&oldid=1236061977"
Arc.Ask3.Ru: конец переведенного документа.
Arc.Ask3.Ru
Номер скриншота №: 9bc219957cd0e1b123ba6348422bb9df__1721660100
URL1:https://arc.ask3.ru/arc/aa/9b/df/9bc219957cd0e1b123ba6348422bb9df.html
Заголовок, (Title) документа по адресу, URL1:
Protein tag - Wikipedia
Данный printscreen веб страницы (снимок веб страницы, скриншот веб страницы), визуально-программная копия документа расположенного по адресу URL1 и сохраненная в файл, имеет: квалифицированную, усовершенствованную (подтверждены: метки времени, валидность сертификата), открепленную ЭЦП (приложена к данному файлу), что может быть использовано для подтверждения содержания и факта существования документа в этот момент времени. Права на данный скриншот принадлежат администрации Ask3.ru, использование в качестве доказательства только с письменного разрешения правообладателя скриншота. Администрация Ask3.ru не несет ответственности за информацию размещенную на данном скриншоте. Права на прочие зарегистрированные элементы любого права, изображенные на снимках принадлежат их владельцам. Качество перевода предоставляется как есть. Любые претензии, иски не могут быть предъявлены. Если вы не согласны с любым пунктом перечисленным выше, вы не можете использовать данный сайт и информация размещенную на нем (сайте/странице), немедленно покиньте данный сайт. В случае нарушения любого пункта перечисленного выше, штраф 55! (Пятьдесят пять факториал, Денежную единицу (имеющую самостоятельную стоимость) можете выбрать самостоятельно, выплаичвается товарами в течение 7 дней с момента нарушения.)