Иммунологическая константа отторжения

Иммунологическая константа отторжения (ICR) — это понятие, введенное биологами для группировки общего набора генов, экспрессируемых при деструктивно-патогенных состояниях тканей, таких как рак и инфекция , по разнообразному набору физиологических обстоятельств повреждения тканей или органной недостаточности, включая аутоиммунные. заболевание или отторжение аллотрансплантата . ^{[ 1 ]} Идентификация общих механизмов и фенотипов различных иммунных патологий, отмеченных как отличительные признаки или биомаркеры, помогает идентифицировать новые варианты лечения без обязательной индивидуальной оценки феноменологии пациентов.

Концепция

Концепция иммунологической константы отторжения основана на положении, что: ^{[ 1 ]}

Тканеспецифическое разрушение не обязательно происходит только после несамостоятельного распознавания тела, но также может происходить против своего или квазисамого себя; такие как фенотипы, наблюдаемые при аутоиммунных заболеваниях.
Иммунные клетки, необходимые для индукции родственного/ адаптивного иммунного ответа, отличаются от клеток, необходимых для активации эффекторного иммунного ответа.
Хотя причины тканеспецифической деструкции варьируются в зависимости от патологического состояния, обнаружено, что эффекторный иммунный ответ, наблюдаемый при этих состояниях, сходится в один единый механизм, включающий активацию адаптивных и врожденных цитотоксических механизмов.
Адаптивный иммунитет выступает в качестве тканеспецифического триггера, но его не всегда достаточно или необходимо для разрушения тканей. Интенсивная работа над факторами, активируемыми во время иммуноопосредованного отторжения, привела к выводу, что тканеспецифическое разрушение коррелирует с экспрессией интерферонов (IFNa и IFNy) и интерферон-стимулируемых генов (ISG).

Механизм

В случае аутоиммунитета и/или отторжения аллотрансплантата иммунитет расширяется в органе-мишени за счет продукции хемокинов семейства CXCL, которые рекрутируют цитотоксические Т-клетки, несущие рецептор CXCR3 . Они запускают следующий каскад:

Хемокины-лиганды CXCR3 (CXCL-9, -10 и -11) продуцируются в ответ на активированные В-клетки и провоспалительную секрецию интерлейкина 12 ( IL12 ) и/или гамма-интерферона ( IFNy ) антигенпрезентирующими клетками (APC). ).
CXCR3, экспрессирующие Th1-поляризованные CD4 Т-клетки , и цитотоксические Т-клетки рекрутируются в место острого воспаления.
Антиген-активированные Т-клетки секретируют лиганды CCR5 (CCL2 и CCL3) для привлечения естественных киллеров (NK) клеток и других эффекторных клеток врожденного иммунитета к месту острого воспаления.
Несколько цитотоксических механизмов сходятся на ткани-мишени, и ее полное разрушение происходит за счет активированного воздействия ЦТЛ, NK-клеток, гранулоцитов , макрофагов и дендритных клеток .

Таким образом, 20 генов, участвующих в этом каскаде, составляют набор генов ICR, в том числе: ^{[ 2 ]}^{[ 3 ]}

Факторы, связанные с Т-хелперами типа 1 (Th1), такие как IFNy , преобразователи сигнала и активатор транскрипции 1 ( STAT1 ), IL12B , интерферон-регуляторный фактор 1 ( IRF1 ), транскрипционный фактор T-bet ( TBX21 ).
Маркеры CD8 Т-клеток: CD8A и CD8B.
Иммунные эффекторные или цитотоксические факторы, такие как гранзимы GZMA , GZMB , GZMH , перфорин PRF1 и гранулизин GNLY .
Хемокиновые лиганды CXCL9 , CXCL10 и CCL5, которые связываются с хемокиновыми рецепторами, такими как CXCR3 и CCR5,
Иммуносупрессивные или контррегуляторные гены, такие как IDO1 , PDCD1 , PDL1 (CD274), CTLA4 и FOXP3.

Клиническое значение

Рак

Установлено, что нарушение гомеостаза раковых клеток инициирует процессы, способствующие росту клеток. Например, факторы роста и хемокины, активируемые в ответ на повреждение, рекрутируются опухолевыми клетками, поддерживая хроническое воспаление ; аналогично иммунному фенотипу, обнаруженному при хронической инфекции, отторжении трансплантата и аутоиммунных заболеваниях. Роль иммунитета при раке демонстрируется прогностической ролью инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TIL) и сигнатур генов иммунного ответа. При некоторых видах рака эти гены демонстрируют большую корреляцию. ^{[ 2 ]} Высокая экспрессия этих генов указывает на активное иммунное взаимодействие и, по крайней мере, на частичное отторжение раковой ткани.

Рак молочной железы

При раке молочной железы повышенная выживаемость наблюдается у пациентов с высоким уровнем экспрессии гена ICR. ^{[ 3 ]} Этот иммунно-активный фенотип был связан с повышенным уровнем мутаций, тогда как плохой иммунный фенотип определялся нарушениями в сигнальных путях МАРК . ^{[ 4 ]}

Консенсусная кластеризация опухолей на основе экспрессии гена ICR обеспечивает оценку прогноза и ответа на иммунотерапию . Например, классификация рака молочной железы на четыре класса (от ICR4 до ICR1) показала более высокие уровни иммунного противоопухолевого ответа в опухолях ICR4, а также более длительную выживаемость по сравнению с опухолями ICR1-3. ^{[ 4 ]} Еще одно исследование ^{[ 5 ]} оценили клинико-биологическую ценность ICR при раке молочной железы посредством классификации около 8700 опухолей молочной железы и оценки выживаемости без метастазов и полного патологического ответа на неоадъювантную химиотерапию .

Доказано, что подпись ICR связана с выживаемостью без метастазов и патологическим ответом на химиотерапию . Повышенное обогащение иммунной сигнатуры отражает экспрессию клеток, включая Т-клетки, цитотоксические Т-клетки, клетки Th-1, CD8+ Т-клетки, Tγδ-клетки и APC; который определяет опухоли как иммуноактивные и иммуномолчащие. [7] Хотя инфильтрация иммунных клеток в опухолях ICR4 связана с плохим прогнозом, она привела к более длительной выживаемости без метастазов и лучшему ответу на химиотерапию, что доказывает важность иммунной реакции при раке молочной железы. Было также показано, что классификация ICR зависит от внутреннего молекулярного подтипа опухолей молочной железы, который широко присутствует в тройных негативных и HER2 + опухолях.

Рак толстой кишки

Для геномного исследования была использована группа свежезамороженных образцов от 348 пациентов с первичным раком толстой кишки (AC-ICAM). Это исследование показало, что TH1-клеточная/цитотоксическая иммунная активация, зафиксированная с помощью ICR, иммуноредактирование, одновременное расширение клонотипов TCR и специфического состава внутриопухолевого микробиома были связаны с благоприятным клиническим исходом. Результаты также показали, что ICR был связан с общей выживаемостью независимо от консенсусных молекулярных подтипов (CMS) и микросателлитной нестабильности (MSI). ^{[ 6 ]}

Кроме того, они выявили признаки микробиома, имеющие сильное прогностическое значение (оценка риска MBR). Затем исследователи объединили ICR с оценкой риска MBR, чтобы получить новый мультиомикальный биомаркер (mICRoScore), который позволил прогнозировать исключительно длительную выживаемость у пациентов с раком толстой кишки. ^{[ 6 ]}

Панрак

Ранее существовавший внутриопухолевый противоопухолевый Т-хелперный иммунный ответ (Th-1) был связан с благоприятными результатами иммунотерапии, но не все иммунологически активные виды рака поддаются лечению. В панраковом анализе с использованием Атласа генома рака (TCGA), включающего 31 тип рака у 9282 пациенток, высокая экспрессия сигнатуры ICR была связана со значительным увеличением выживаемости при инвазивной карциноме молочной железы, меланоме кожи и кожи, саркоме и карциноме тела матки эндометрия. , в то время как этот «горячий» иммунный фенотип был связан со снижением общей выживаемости при увеальной меланоме, глиоме низкой степени злокачественности, аденокарциноме поджелудочной железы. и светлоклеточный рак почки. В ходе системного анализа было обнаружено, что специфичные для рака пути модулируют прогностическую ценность ICR. В опухолях с высоким показателем пролиферации ICR был связан с лучшей выживаемостью, тогда как в опухолях с низкой пролиферацией не наблюдалось никакой связи с выживаемостью. В опухолях, в которых преобладает передача сигналов рака, например, за счет повышенной передачи сигналов TGF-бета, «горячий» иммунный фенотип не имел никакого преимущества в выживаемости, что позволяет предположить, что иммунный ответ сильно подавляется без защитного эффекта. ^{[ 7 ]}

Клиническая значимость этого открытия была продемонстрирована в наборе данных Ван Аллена с образцами опухолей пациентов с меланомой, получавших ингибитор контрольной точки анти-CTLA4. В целом, у ответивших наблюдалось значительно повышенное выражение ICR по сравнению с неответившими на лечение. Однако связь высоких показателей ICR до обработки с выживаемостью наблюдалась только для образцов с высокими показателями пролиферации. И наоборот, ICR был связан с выживаемостью только в образцах с низкой экспрессией бета-ТФР.

Саркома мягких тканей

При саркоме мягких тканей к группе из 1455 неметастатических образцов ретроспективно применили ICR, чтобы обнаружить связи между классами ICR и клинико-патологическими и биологическими переменными. По этой причине когорта была разделена на 4 группы, обозначенные как ICR1, ICR2, ICR3 и ICR4, каждая из которых включала 34, 27, 24 и 15% опухолей. Вышеупомянутые группы были созданы с учетом возраста, глубины патологии и степени обогащения ICR1–4 количественных/качественных показателей иммунных ответов. При сравнении ICR1 с классами ICR2-4 число метастатических рецидивов увеличилось на 59%. Многомерный анализ также показал, что классификация ICR по-прежнему связана с MFS, а также с патологическим типом и классификацией CINSARC, что позволяет предположить, что существует независимая прогностическая ценность. Наличие сигнатуры ICR связано с послеоперационным MFS на ранней стадии STS, независимо от других прогностических факторов, таких как CINSARC. Была создана прогностическая клинико-геномная модель, сочетающая ICR, CINSARC и патологический тип для обеспечения надежного прогнозирования исходов. Кроме того, исследование предполагает, что каждая прогностическая группа имеет разные уровни восприимчивости к различным системным методам лечения. ^{[ 8 ]}

Детский рак

Большой систематический анализ общедоступных данных RNAseq (TARGET) для пяти типов педиатрических опухолей: остеосаркомы (OS), нейробластомы (NBL), светлоклеточной саркомы почки (CCSK), опухоли Вильмса (WLM) и рабдоидной опухоли почки ( RT) показали очень важную роль ICR при опухолях у детей. Было обнаружено, что более низкий показатель ICR был связан с более низкой выживаемостью при WLM, тогда как более высокий показатель ICR был связан с лучшей выживаемостью при ОС и НБЛ высокого риска без амплификации MYCN. Затем иммунные признаки были использованы для группировки образцов в 6 различных иммунных подтипов (S1-S6), каждый из которых имел разные и разные результаты выживаемости. Например, кластер S2 продемонстрировал самую высокую общую выживаемость, отличающуюся низким усилением признаков заживления ран, высокой инфильтрацией Th1 и низкой инфильтрацией Th2. Однако в S4 было подчеркнуто обратное. Повышение регуляции пути WNT/бета-катенин было связано с неблагоприятными исходами и снижением инфильтрации Т-клеток при ОС. ^{[ 9 ]}

Другие заболевания

Молекулярные пути, включая активацию генов, стимулируемую ИФН; рекрутирование NK-клеток и Т-клеток посредством секреции CCL5 и CXCL9-10; а индукция иммунных эффекторных механизмов перекрывается при таких состояниях, как аутоиммунитет, в результате реакции хозяина против самого себя, когда иммунные клетки инициируют тканеспецифическое разрушение. Аналогичным образом, аллотрансплантат приводит к сильному иммунному ответу, который клинически требует продолжения иммуносупрессии для поддержания выживания трансплантата. Обнаружено, что они экспрессируют конформационные эпитопы, такие как молекулы MHC , как чужеродные антигены, которые активируют как В-, так и Т-клетки. ^{[ 1 ]}

Альтернативы и вариации

ГЭП, воспаленный Т-клетками, или признак опухолевого воспаления (TIS)

Профиль экспрессии генов из 18 генов, позволяющий предсказать ответ на пембролизумаб при множественных солидных опухолях. Может использоваться с такой платформой, как платформа NanoString nCounter, и определять независимые от типа опухоли размеры микроокружения опухоли, необходимые для прогнозирования клинического результата для агентов, нацеленных на сигнальный путь PD-1/PD-L1. ^{[ 10 ]}^{[ 11 ]}

Сигнатура гена: CCL5, CD27, CD274 (PD-L1), CD276 (B7-H3), CD8A, CMKLR1, CXCL9, CXCR6, HLA-DQA1, HLA-DRB1, HLA-E, IDO1, LAG3, NKG7, PDCD1LG2 (PDL2). ), PSMB10, STAT1 и TIGIT.

Оценка цитолитической активности (CYT)

Средний показатель экспрессии GZMA и PRF1 для простых двух генов. Высокий уровень CYT при колоректальном раке связан с улучшением выживаемости, вероятно, из-за повышения иммунитета и цитолитической активности Т-клеток и макрофагов M1. ^{[ 12 ]} Пятилетняя безрецидивная выживаемость больных раком печени с низкими показателями CYT была значительно короче, чем у пациентов с высокими показателями CYT. ^{[ 13 ]}

Подпись 3-днРНК

исследователи обнаружили 20 различных прогностических сигнатур из 20 днк-РНК, которые показали более сильное влияние на общую выживаемость, чем сигнатура ICR при различных солидных раковых заболеваниях. Они также обнаружили сигнатуру 3 днРНК, которая имела прогностическую значимость при 5 типах солидного рака с более сильной связью с клиническим исходом, чем ICR, и демонстрировала дополнительную прогностическую значимость в когорте матки, карциноме эндометрия, плоскоклеточном раке шейки матки и эндоцервикальной аденокарциноме по сравнению с ICR. ^{[ 14 ]}

Ссылки

^ Перейти обратно: ^а ^б ^с Ван Э., Воршех А., Маринкола FM (июнь 2008 г.). «Иммунологическая константа отторжения». Тенденции в иммунологии . 29 (6): 256–62. дои : 10.1016/j.it.2008.03.002 . ПМИД 18457994 .
^ Перейти обратно: ^а ^б Бедоньетти Д., Хендрикс В., Маринкола Ф.М., Миллер Л.Д. (ноябрь 2015 г.). «Прогностические и прогнозирующие сигнатуры иммунных генов при раке молочной железы» . Современное мнение в онкологии . 27 (6): 433–44. doi : 10.1097/CCO.0000000000000234 . ПМИД 26418235 . S2CID 30713069 .
^ Перейти обратно: ^а ^б Бедоньетти Д., Хендрикс В., Чеккарелли М., Миллер Л.Д., Селигер Б. (апрель 2016 г.). «Распутывание связи между генетическими программами опухолей и иммунной реакцией». Современное мнение в иммунологии . 39 : 150–8. дои : 10.1016/j.coi.2016.02.001 . ПМИД 26967649 .
^ Перейти обратно: ^а ^б Хендрикс В., Симеоне И., Анджум С., Мокраб Ю., Бертуччи Ф., Финетти П. и др. (2017). «Идентификация генетических детерминант иммунных фенотипов рака молочной железы методом интегративного геномного анализа» . Онкоиммунология . 6 (2): e1253654. дои : 10.1080/2162402X.2016.1253654 . ПМК 5353940 . ПМИД 28344865 .
^ Бертуччи Ф., Финетти П., Симеоне И., Хендрикс В., Ван Э., Маринкола Ф.М. и др. (ноябрь 2018 г.). «Иммунологическая константа классификации отторжения уточняет прогностическую ценность традиционных прогностических признаков рака молочной железы» . Британский журнал рака . 119 (11): 1383–1391. дои : 10.1038/s41416-018-0309-1 . ПМК 6265245 . ПМИД 30353048 .
^ Перейти обратно: ^а ^б Руландс Дж., Куппен П.Дж.К., Ахмед Э.И. и др. Интегрированный атлас опухолей, иммунитета и микробиома рака толстой кишки. Nat Med 29, 1273–1286 (2023). https://doi.org/10.1038/s41591-023-02324-5
^ Руландс Дж., Хендрикс В., Зопполи Дж., Молл Р., Саад М., Холливилл К. и др. (апрель 2020 г.). «Онкогенные состояния определяют прогностический и прогнозирующий смысл внутриопухолевого иммунного ответа» . Журнал иммунотерапии рака . 8 (1): e000617. doi : 10.1136/jitc-2020-000617 . ПМЦ 7223637 . ПМИД 32376723 .
^ Бертуччи, Ф; Низьерс, В; де Нонневиль, А. (январь 2022 г.). «Иммунологическая константа сигнатуры отторжения является прогностической при саркоме мягких тканей и уточняет сигнатуру CINSARC» . Журнал иммунотерапии рака . 10 (1): e003687. дои : 10.1136/jitc-2021-003687 . ПМЦ 8753443 . ПМИД 35017155 .
^ Шериф С., Роландс Дж., Мифсуд В. и др. Иммунный ландшафт солидных педиатрических опухолей. J Exp Clin Cancer Res 41, 199 (2022). https://doi.org/10.1186/s13046-022-02397-z
^ Айерс М., Лансфорд Дж., Небожин М., Мерфи Э., Лобода А., Кауфман Д.Р. и др. (август 2017 г.). «Профиль мРНК, связанный с IFN-γ, предсказывает клинический ответ на блокаду PD-1» . Журнал клинических исследований . 127 (8): 2930–2940. дои : 10.1172/JCI91190 . ПМК 5531419 . ПМИД 28650338 .
^ Дамотт Д., Уоррен С., Аррондо Дж., Буду-Рукет П., Мансуэ-Лупо А., Битон Дж. и др. (ноябрь 2019 г.). «Признак воспаления опухоли (TIS) связан с эффективностью лечения анти-PD-1 в когорте больных панраком CERTIM» . Журнал трансляционной медицины . 17 (1): 357. дои : 10.1186/s12967-019-2100-3 . ПМЦ 6829827 . ПМИД 31684954 .
^ Нарайанан С., Кавагути Т., Ян Л., Пэн Х., Ци Ц, Такабэ К. (август 2018 г.). «Показатель цитолитической активности для оценки противоракового иммунитета при колоректальном раке» . Анналы хирургической онкологии . 25 (8): 2323–2331. дои : 10.1245/s10434-018-6506-6 . ПМК 6237091 . ПМИД 29770915 .
^ Вакияма Х., Масуда Т., Мотомура Ю., Ху К., Тобо Т., Эгучи Х. и др. (декабрь 2018 г.). «Показатель цитолитической активности (CYT) является прогностическим биомаркером, отражающим иммунный статус хозяина при гепатоцеллюлярной карциноме (ГЦК)». Противораковые исследования . 38 (12): 6631–6638. doi : 10.21873/anticanres.13030 . hdl : 2324/2236110 . ПМИД 30504371 . S2CID 54485149 .
^ Шериф С., Молл Р., Алмир Х. и др. Связанная с иммунитетом сигнатура 3-днРНК с прогностическим значением в условиях множественного рака. J Transl Med 20, 442 (2022). https://doi.org/10.1186/s12967-022-03654-7

[:0-1] Перейти обратно: ^а ^б ^с Ван Э., Воршех А., Маринкола FM (июнь 2008 г.). «Иммунологическая константа отторжения». Тенденции в иммунологии . 29 (6): 256–62. дои : 10.1016/j.it.2008.03.002 . ПМИД 18457994 .

[:1-2] Перейти обратно: ^а ^б Бедоньетти Д., Хендрикс В., Маринкола Ф.М., Миллер Л.Д. (ноябрь 2015 г.). «Прогностические и прогнозирующие сигнатуры иммунных генов при раке молочной железы» . Современное мнение в онкологии . 27 (6): 433–44. doi : 10.1097/CCO.0000000000000234 . ПМИД 26418235 . S2CID 30713069 .

[:2-3] Перейти обратно: ^а ^б Бедоньетти Д., Хендрикс В., Чеккарелли М., Миллер Л.Д., Селигер Б. (апрель 2016 г.). «Распутывание связи между генетическими программами опухолей и иммунной реакцией». Современное мнение в иммунологии . 39 : 150–8. дои : 10.1016/j.coi.2016.02.001 . ПМИД 26967649 .

[:3-4] Перейти обратно: ^а ^б Хендрикс В., Симеоне И., Анджум С., Мокраб Ю., Бертуччи Ф., Финетти П. и др. (2017). «Идентификация генетических детерминант иммунных фенотипов рака молочной железы методом интегративного геномного анализа» . Онкоиммунология . 6 (2): e1253654. дои : 10.1080/2162402X.2016.1253654 . ПМК 5353940 . ПМИД 28344865 .

[5] Бертуччи Ф., Финетти П., Симеоне И., Хендрикс В., Ван Э., Маринкола Ф.М. и др. (ноябрь 2018 г.). «Иммунологическая константа классификации отторжения уточняет прогностическую ценность традиционных прогностических признаков рака молочной железы» . Британский журнал рака . 119 (11): 1383–1391. дои : 10.1038/s41416-018-0309-1 . ПМК 6265245 . ПМИД 30353048 .

[Roelands-6] Перейти обратно: ^а ^б Руландс Дж., Куппен П.Дж.К., Ахмед Э.И. и др. Интегрированный атлас опухолей, иммунитета и микробиома рака толстой кишки. Nat Med 29, 1273–1286 (2023). https://doi.org/10.1038/s41591-023-02324-5

[:6-7] Руландс Дж., Хендрикс В., Зопполи Дж., Молл Р., Саад М., Холливилл К. и др. (апрель 2020 г.). «Онкогенные состояния определяют прогностический и прогнозирующий смысл внутриопухолевого иммунного ответа» . Журнал иммунотерапии рака . 8 (1): e000617. doi : 10.1136/jitc-2020-000617 . ПМЦ 7223637 . ПМИД 32376723 .

[Bertucci-8] Бертуччи, Ф; Низьерс, В; де Нонневиль, А. (январь 2022 г.). «Иммунологическая константа сигнатуры отторжения является прогностической при саркоме мягких тканей и уточняет сигнатуру CINSARC» . Журнал иммунотерапии рака . 10 (1): e003687. дои : 10.1136/jitc-2021-003687 . ПМЦ 8753443 . ПМИД 35017155 .

[9] Шериф С., Роландс Дж., Мифсуд В. и др. Иммунный ландшафт солидных педиатрических опухолей. J Exp Clin Cancer Res 41, 199 (2022). https://doi.org/10.1186/s13046-022-02397-z

[10] Айерс М., Лансфорд Дж., Небожин М., Мерфи Э., Лобода А., Кауфман Д.Р. и др. (август 2017 г.). «Профиль мРНК, связанный с IFN-γ, предсказывает клинический ответ на блокаду PD-1» . Журнал клинических исследований . 127 (8): 2930–2940. дои : 10.1172/JCI91190 . ПМК 5531419 . ПМИД 28650338 .

[11] Дамотт Д., Уоррен С., Аррондо Дж., Буду-Рукет П., Мансуэ-Лупо А., Битон Дж. и др. (ноябрь 2019 г.). «Признак воспаления опухоли (TIS) связан с эффективностью лечения анти-PD-1 в когорте больных панраком CERTIM» . Журнал трансляционной медицины . 17 (1): 357. дои : 10.1186/s12967-019-2100-3 . ПМЦ 6829827 . ПМИД 31684954 .

[12] Нарайанан С., Кавагути Т., Ян Л., Пэн Х., Ци Ц, Такабэ К. (август 2018 г.). «Показатель цитолитической активности для оценки противоракового иммунитета при колоректальном раке» . Анналы хирургической онкологии . 25 (8): 2323–2331. дои : 10.1245/s10434-018-6506-6 . ПМК 6237091 . ПМИД 29770915 .

[13] Вакияма Х., Масуда Т., Мотомура Ю., Ху К., Тобо Т., Эгучи Х. и др. (декабрь 2018 г.). «Показатель цитолитической активности (CYT) является прогностическим биомаркером, отражающим иммунный статус хозяина при гепатоцеллюлярной карциноме (ГЦК)». Противораковые исследования . 38 (12): 6631–6638. doi : 10.21873/anticanres.13030 . hdl : 2324/2236110 . ПМИД 30504371 . S2CID 54485149 .

[14] Шериф С., Молл Р., Алмир Х. и др. Связанная с иммунитетом сигнатура 3-днРНК с прогностическим значением в условиях множественного рака. J Transl Med 20, 442 (2022). https://doi.org/10.1186/s12967-022-03654-7

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]

[ 11 ]

[ 12 ]

[ 13 ]

[ 14 ]