L-Photo-Methionine
 | Эта статья , возможно, должна быть переписана, Википедии чтобы соответствовать стандартам качества . ( Март 2022 г. ) |
| |
| Имена | |
|---|---|
| Имя IUPAC
( S ) -2-амино-4- (3-метил-3 H -диазирин-3-ил) бутановая кислота
| |
| Другие имена
L -2-амино-5,5-ази-гексановая кислота
| |
| Идентификаторы | |
3D model ( JSmol )
|
|
| Chemspider | |
PubChem CID
|
|
| Характеристики | |
| C 6 H 11 N 3 O 2 | |
| Молярная масса | 157.173 g·mol −1 |
| 6 мг/мл | |
| Опасности | |
| GHS Маркировка : | |
| H315 , H319 , H335 | |
| P261 , P305 , P338 , P351 | |
За исключением случаев, когда отмечены, данные приведены для материалов в их стандартном состоянии (при 25 ° C [77 ° F], 100 кПа).
| |
L -фото -метионин представляет собой фотореактивное производное аминокислоты L -метионина , которое было синтетически образовано в 2005 году. [ 1 ] Белок представляют собой длинные полимерные цепи аминокислот ; который может варьироваться в различных структурах и размерах. Белки могут взаимодействовать друг с другом ( взаимодействие белка-белок или PPI), и с этими взаимодействиями влияют на клеточные взаимодействия и пути. [ 1 ] Такие взаимодействия; В вирусном слиянии и в фактическом росте передача сигналов выглядела многообещающе для противовирусных или противораковых лекарств, необходимо провести исследования, чтобы понять взаимодействия. [ 1 ] При этом исследования начали доказывать, что белки функционируют в супрамолекулярных комплексах по сравнению с изолированными объектами. [ 1 ] Итак, ученые Моника Суханек, Анна Радзиковски и Кристоф Тиле исследовали, что прямой способ лучше изучить эти взаимодействия в природной среде, заключался в создании нового способа скрещивания фотоспеки; что привело к синтезу L -фото -метионина и в том же исследовании, L -фото -лецин . [ 1 ]
Синтез
[ редактировать ]Реймический фотометинин синтезируется от 4,4'-ази-пентанала с помощью аминокислотного синтеза Strecker . [ 1 ] L ацетамида Enantiomer отделяется ферментативным разрешением .
Фотоактивация метионина
[ редактировать ]Как уже упоминалось ранее, L-фотон-метионин может использоваться для изучения белковых взаимодействий с белками в их нативной среде. Как это возможно, как аминокислота ведет себя при воздействии ультрафиолетового света. [ 1 ] Чтобы доказать, что сначала работает синтез, радиоактивный углерод ( 14 C) как добавлено под его собственным синтезом для выполнения правильных спектроскопических методов.
Активация фотометиона
[ редактировать ]Поскольку предыдущий синтез сработал, фото-метионин является фотореактивным из-за кольца диазирина . Как только это кольцо станет подверженным воздействию ультрафиолетового света, листья азота в виде газа азота (N 2 ) и образуют высокореактивную промежуточную карбен . [ 1 ] Фото-активация аминокислот обеспечивает способность связывания фотосвешения в белках. [ 1 ] Этот тип сшивания имеет три основных преимущества; Существует большая специфичность для этого перекрестного связывания из -за коротких промежуточных соединений и что эта аминокислота функциональна, и самое главное; Не токсично (это означает, что он не должен резко разрушать функцию или структуру белка). [ 1 ] Исследования показали, что эта активация является ограничивающим скоростью шаг; Не перекрестная связь. [ 2 ]
Новый эффективный синтез и использование
[ редактировать ]Ученые Микель Вила-Эрелло, Мэтью Р. Пратт, Фрейдж Тулин и Том В. Мьюр хотели создать эффективный синтез, поскольку оригинал требовал ферментативного решения и имел низкий выход. [ 3 ] Таким образом, они начали с L-глютаминовой кислоты с защитой групп как на карбоновой кислоте (Tert-Butyl), так и на BOC на амине. Этот синтез не будет подвергаться детали в качестве классики, но ниже является полным синтезом. Чтобы найти фактические шаги, посмотрите на ссылку. [ 3 ]
Таким образом, как только они синтезировали L-фото-метионин, выход составил 32%, что намного выше (в шесть раз) исходного синтеза. [ 3 ] Затем использовался (с группой защиты FMOC на амине), который этот продукт предпринял больше синтетических шагов для изучения, если может быть введен аминокислотный перекрестный линкер и посттрансляционная модификация (PTM), специально для захвата, чтобы захватить Ковалентное взаимодействие аминокислота зависит от PTM. [ 3 ] PTM регулируют белкопротеиновые взаимодействия, которые имеют характеристики, которые являются временными и подлихиометрическими; Сделает их трудным для обнаружения стандартными методами. [ 3 ] Таким образом, чтобы увидеть, будет ли это сработать, домен MH2 SMAD2 был использован , потому что этот сигнальный белок , как известно, образует стабильных гомо -тримеров, как только они вступают в контакт с рецепторными фосфорилированными сериновыми остатками. [ 3 ] Лигирование белка экспрессии (известное как EPL) использовали для синтеза с образованием SMAD2-MH2-CSPSM-PHOTO-MET (1). Продукт изучали с помощью сшивки (фото-MET) против контрольного белка: HA-MH2-CSPSMP (в этом не хватает фотометионина, 2) с использованием SDS-PAGE и вестерн-блоттинга с использованием антитела против HA. [ 3 ] 1 создали два основных сшитых вида, которые имеют молекулярную массу, соответствующую димеру и тримеру Smad2-Sh2. Без этого сшивателя димер и тример были едва обнаружены в не облученных 1 и в 2 до и после ультрафиолета. [ 3 ] Доказывая, что L-фото-метионин может использоваться с EPL и может использоваться для определения переходного взаимодействия MH2-MH2, которое зависело от PTM. [ 3 ]
Использование фотометиона
[ редактировать ]Белковые взаимодействия
[ редактировать ]Сложный и функция мембранного белка при гомеостазе холестерина
[ редактировать ]Как упоминалось ранее, ученые Моника Суханек, Анна Радзиковски и Кристоф Тиле хотели изучить взаимодействие белкового белка в их естественной среде. В частности, мембранные белки (в комплексе и SCAP , Insig-1 и SREBP ), которые регулируют гомеостаз холестерина, поэтому они хотели знать, какова была их функция, и сложная структура. [ 1 ] Они обнаружили, что использование этой фотореактивной аминокислоты было эффективно включено в белок клетками млекопитающих, но ей не нужно было использовать модифицированные ( передача РНК) или AARS (аминоацил-синтез) тРНК нужный. [ 1 ] Это сшивание может быть определено с помощью вестерн-блоттинга , и они обнаружили прямое взаимодействие между INSIG-1 и PGRMC1 ( мембранный белок, связывающий прогестерон ). [ 1 ] Все четыре мембранных белка обнаружены в эндоплазматическом ретикулуме , а комплекс реагирует на низкие уровни холестерина. [ 1 ] Клетки ( COS7 ), которые имели HA ( гемагглютинин с меткой PGRMC1) и MYC Tagged Insig-1, выращивались с фото-MET и без него. В присутствии фотомета INSIG-1 и SCAP сшивали с помощью PGRMC1; В частности, сшивая insig-1 имела сильную полосу. [ 1 ] Сшивание было обнаружено с помощью иммунопреципитации моющих средств с антителом к HA, затем осадку испытали на Insig-1 с использованием вестерн-блоттинга с антителом для MYC. [ 1 ] Была найдена идентичная полоса, выполняя обратный порядок обнаружения; Это означает, что антитело Myc иммунопреципитировали, затем с последующим блоттингом с антителом HA. [ 1 ] Таким образом, этот метод доказал, что этот фотомет может скрещивать белки, но физиологические последствия этого сшивания еще предстоит определить.
Использование нанопробов белка для изучения белковых взаимодействий с масс-спектрометрией
[ редактировать ]Белок изучали с использованием нанопроба белка (который позволяет сшивать сшивание), который вводил фотометинин в белке (во время рекомбинантной экспрессии), что приводит к тому, что белок сохраняет его сдержанную структуру, одновременно имея способность быть отображенным для его взаимодействия. Модель использовалась в качестве области контактной поверхности, которая участвует в хорошо известном взаимодействии (гомодимеризации) между двумя молекулами 14-3-3ζ белка. После того, как фотометинин введен и стал активирован с использованием ультрафиолетового света, он может сшивать без специфичности (что означает отсутствие группы), а ссылки имеют нулевую длину. высокого разрешения Массовая спектрометрия или MS может (даже MS/MS), затем для определения сшитых остатков и радиуса реакции; позволяя исследователям охарактеризовать и исследовать гомодимеризацию белка. Использование MS с высоким разрешением с фотометионином имеет свои преимущества, поскольку он снова позволяет белке находиться в его нативном состоянии, существуют разумные временные масштабы при использовании небольших количеств белка. Также меньше ограничений на специфичность и ограничения реакции с использованием фото-активного сшивателя (фото-метионин) по сравнению с химическое сшивание . Этот метод комбинированного фотоиницированного сшивания из нанопроба белка в тандеме с РС может быть полезен для характеристики не только образования гомодимеров, но и олигомеров и теории; Гетеромеры (такие как состав белковой смеси и ее функциональность). [ 4 ]
изучать цитохрому P450-трансспорта Способность
[ редактировать ]Цитохром B 5 был синтезирован с фотометионином для картирования взаимодействия белка-белка, а также идентификации ее структуры для изучения системы смешанной функции млекопитающих оксидазы (также известной как MFO). [ 5 ] Эта система расположена в мембране эндоплазматического ретикулума и состоит из цитохрома P450 , NADPH : цитохрома P450 -редуктазы и цитохрома B 5 вместе с NADH : цитохром B 5 редуктаза . [ Цитация необходима ] После того, как в комплексе цитохрома B 5 был включен фотометинин (то есть на фото-MET заменили вместо метионина, а теперь фото-Cyt B 5 ), фото-Cyt B 5 и цитохром P450 были положены под ультрафиолетовым светом, а продукты были способны учиться с использованием SDS-PAGE ; Этот метод показал три сшивки. [ Цитация необходима ] Фото-метионин оказался успешным в картировании фото-цит-бит B 5 , поскольку метод Maldi-Tof показал три олигомера (из химотриптических пептидов), которые состояли из фото-Cyt B 5 и цитохрома P450 в соотношении молекулярной массы 1: 1, 1. : 2 и 2: 1. [ Цитация необходима ] То, что делает фото-метионин здесь таким полезным при изучении цитохрома P450 и цитохрома B 5, является то, что этот метод не только отображает интерфейсы белкового белка не только в регионах, подвергшихся воздействию растворителя, но и в нативной среде; мембрана. [ 5 ] Типичный метод сшивки может работать только в областях, подвергшихся воздействию растворителей, еще раз доказывая, что фотометинин полезен для картирования этих белковых взаимодействий с белком в их нативной среде. [ 5 ]
Белковая структура
[ редактировать ]Анализ нидогена-1, взаимодействующего с ламинином γ1
[ редактировать ]Ламинины -это неколлагеновые белки, обнаруженные в базальных мембранах и образуют сети посредством нековалентных самостоятельных действий. Нидогены (также известные как энтактины) представляют собой сульфатированные мономерные гликопротеины , которые повсеместно присутствуют в базальных мембранах более высоких организмов. Нидогены помогают с формированием подвала. При наличии как ламининов, так и нидогенов оба взаимодействуют друг с другом, чтобы иметь соотношение стехиометрии 1: 1 в комплексе. Чтобы изучить короткий рычаг ламинина γ1, фотометионин введен как в Nidogen-1 , ламинин γ1 LEB2-4 и ламинин γ1 короткий рычаг, чтобы увидеть, сможет ли этот метод связывания фотосплета наметить структуру. Анализ MS/MS был проведен перед сшиванием, чтобы найти только 13-25% метионина, но после индуцированного ультрафиолетового излучения или другого поперечного сшивателя BS BS 2 G-опосредованный сшитый (гомобифункциональный сшитый сшитый) процент фотометионина увеличился до 35%. Оба сшивателя продемонстрировали дополнительную структурную информацию как вычислительно, так и экспериментально, чтобы помочь в понимании функций. [ 6 ]
Откровение димерной структуры и олигомерной структуры
[ редактировать ]Структуры циклооксигеназы-2 (COX-2) и микросомального простагландина E 2 синтазы-1 (MPGES-1) изучали с использованием как фотометионинового (фото-активируемого), так и бифункциональных поперечных линкеры. Фото-метионин, используемый в COX-2, показал так же, как бифункциональный сшитый сшитый, что была димерная структура, которая согласуется с кристаллической структурой фермента. В MPGES-1 клетки человека ( A549 ) были обработаны дисукцинимидил-субебератом (химический сшитый сшитый) имел димер 33 кДа, а тример 45 кДа, в то время как его обработали фотометионином, дали димер того же молекулярного Вес (33 кДа) и две предполагаемые тримеры (50 кДа и 55 кДа). Как только ингибитор MPGES-1 ( MF63 был введен ); Это ингибировало образование комплексов 50 кДа и 55 кДа. Димер и тример, полученные химическим сшившим сшившим, не подвергались влиянию ингибитора. Тем не менее, фотометионин или дисукцинимидил-суберат не показали каких-либо взаимодействий белка-белка между COX-2 и MPGES-1, и это может быть связано с различными причинами. Для фотометионина; В настоящее время можно быть связано с низким включением, так как оно было 0,7%. Итак, для MPGES-1; Это имеет 152 аминокислота, поэтому только один фотометинин будет включен для мономера. Это также означает, что ни один конкретный метионин не будет заменен, чтобы привести к неоднородной популяции MPGES-1, что приводит к различным сшиванию. Несмотря на то, что в нем не было никаких белковых взаимодействий, его можно было использовать для обнаружения индуцированных ингибитором конформационных изменений белка в клеточных мембранах на вершине определения олигомерных структур. [ 7 ]
Escherichia coli клетки
[ редактировать ]Фото-метионин может использоваться для маркировки рекомбинантных белков в Escherichia coli клетках ; Хотя метионин в целом является редкой аминокислотой, так что это означает, что он может дать только ограниченные структурные данные. [ 8 ] Тем не менее, фотометинин был включен в CA 2+ Регулирующий белок кальмодулин (CAM, который был 17 кДа), который имеет девять метионинов и изучаемый с помощью масс-спектрометрии (MS). [ 9 ] Что отличает этот метод, так это использование среды минеральных солей вместо DMEM (модифицированная среда Eagle's Dulbecco) или диализированная сыворотка для бычьей плода для включения в ячейки. [ 9 ] Использование минеральной солевой среды позволило выращивать клетки с самого начала, чтобы устранить сложные этапы с другими протоколами (инкубация клеток в среде LB , с последующей промывкой и дальнейшим инкубацией в истощенной среде), что означает, что фото-метинин может быть включенным в самом начале роста клеток, который имел высокий выход свыше 30%. [ 9 ] Фото-метионин не показал повреждения во время процесса роста клеток, и после того, как фотоактивируется светом ультрафиолетового излучения, CAM имел девять различных мест сшивки, как только MS определил, были пики фото-метионина, помеченного CAM. [ 9 ] Не только фотометинин можно использовать для картирования структуры 3D белка, изучения белковых взаимодействий, но теперь гидрофобные области в белке. [ 9 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а беременный в дюймовый и фон глин час я Дж k л м не а п Q. Суханек, Моника; Радзиковска, Анна; Тиле, Кристоф (апрель 2005 г.). «Фото-лейцина и фотометинин позволяют идентифицировать взаимодействия белка белка в живых клетках» . Природные методы . 2 (4): 261–268. doi : 10.1038/nmeth752 . ISSN 1548-7105 . PMID 15782218 . S2CID 205427639 .
- ^ Kölbel, Knut; Ihling, Christian H.; Синц, Андреа (2012). «Анализ пептидных вторичных структур с помощью фотоактивируемых аминокислотных аналогов» . Angewandte Chemie International Edition . 51 (50): 12602–12605. doi : 10.1002/anie.201205308 . ISSN 1521-3773 . PMID 23109332 .
- ^ Jump up to: а беременный в дюймовый и фон глин час я Вила-Пелло, Микель; Пратт, Мэтью Р.; Тулин, Фридж; Muir, Tom W. (2007-07-01). «Ковалентный захват фосфо-зависимой протеиновой олигомеризации путем сайт-специфического включения диазиринского фотоспеличика» . Журнал Американского химического общества . 129 (26): 8068–8069. doi : 10.1021/ja072013j . ISSN 0002-7863 . PMC 3242410 . PMID 17567014 .
- ^ Птачкова, Рената; Ячмень, Томас; Новак, Петр; Hudecek, Jiri; Стиборова, Мари; Шульк, Мирослав (июнь 2014 г.). «Применение появляющегося метода для картирования интерфейса взаимодействия белка белка: комбинация нанопробов с сшиванием белка с масс-спектрометрией» . Международный журнал молекулярных наук . 15 (6): 9224–9241. Doi : 10.3390/ijms15069224 . PMC 4100091 . PMID 24865487 .
- ^ Jump up to: а беременный в Ячмень, Томас; Птачкова, Рената; Черный, Věra; Дракон, Хелена; Ходек, Петр; Стиборова, Мари; Hudecek, Jiri; Sulc, Мирослав (2015-11-01). «Инициированное фотосвязанным сшиванием расширяет картирование границы раздела белок-белок на мембрану, встроенные части цитохромов P450 2B4 и B5» . Методы Масс-спектрометрическая структурная биология. 89 : 128–137. Doi : 10.1016/j.ymeth.2015.07.015 . ISSN 1046-2023 . PMID 26235815 .
- ^ Lössl, Philip; Kölbel, Knut; Тянцлер, Дирк; Нанеманн, Дэвид; Ihling, Christian H.; Келлер, Мануэль В.; Шнайдер, Мариан; Зауке, Фрэнк; Мейлер, Йенс; Синц, Андреа (2014-11-11). «Анализ взаимодействия Nidogen-1/Laminin γ1 с помощью сшивания, масс-спектрометрии и вычислительного моделирования выявляет множественные моды связывания» . Plos один . 9 (11): E112886. Bibcode : 2014ploso ... 9K2886L . doi : 10.1371/journal.pone.0112886 . ISSN 1932-6203 . PMC 4227867 . PMID 25387007 .
- ^ Эту, Пьер-Оливье; Оуэллет, Марк; Falgueyret, Жан-Пьер; Рамачандран, Чидамбарам; Робихо, Джоэл; Замбони, Роберт; Riendeau, Denis (2008-09-01). «Фотосвязанность белков в неповрежденных клетках выявляет димерную структуру циклооксигеназы-2 и чувствительную к ингибитору олигомерную структуру микросомальной простагландина E2-синтазы-1» . Архивы биохимии и биофизики . 477 (1): 155–162. doi : 10.1016/j.abb.2008.04.038 . ISSN 0003-9861 . PMID 18498757 .
- ^ Кол, Бастиан; Брюдерлин, Митчелл; Ритц, Данило; Шмидт, Александр; Хиллер, Себастьян (2020-08-07). «Протокол для высокодоходной продукции белков, меченных фото-лейцином в Escherichia coli» . Журнал исследований протеома . 19 (8): 3100–3108. doi : 10.1021/acs.jproteome.0c00105 . ISSN 1535-3893 . PMID 32412763 . S2CID 218658726 .
- ^ Jump up to: а беременный в дюймовый и Пиотровский, Кристина; Ihling, Christian H.; Синц, Андреа (2015-11-01). «Расширение стратегии сшивки/масс-спектрометрии: легкое включение фотоактивируемых аминокислот в модель белка кальмодулин в клетках Escherichia coli» . Методы Масс-спектрометрическая структурная биология. 89 : 121–127. doi : 10.1016/j.ymeth.2015.02.012 . ISSN 1046-2023 . PMID 25726908 .