Кислотная гуанидинтиоцианат-фенол-хлороформная экстракция

Кислотная экстракция тиоцианатом гуанидина-фенола-хлороформа (сокращенно AGPC ) представляет собой метод жидкостно-жидкостной экстракции в биохимии и молекулярной биологии . Он широко используется для выделения РНК (а также ДНК и белка в некоторых случаях ). Этот метод может занять больше времени, чем система на колонке, такая как очистка на основе диоксида кремния, но он имеет более высокую чистоту и преимущество, заключающееся в высоком извлечении РНК. ^{[ 1 ]} Кроме того, колонка с РНК обычно не подходит для очистки коротких (<200 нуклеотидов ) видов РНК, таких как миРНК , микроРНК и тРНК .

Первоначально он был разработан Петром Хомчинским и Николеттой Сакки , опубликовавшими свой протокол в 1987 году. ^{[ 2 ]}^{[ 3 ]} Реагент продается компанией Sigma-Aldrich под названием TRI Reagent; от Invitrogen под названием TRIzol ; от Bioline как Trisure; и Tel-Test как STAT-60.

Как это работает

Этот метод основан на разделении фаз путем центрифугирования смеси водного образца и раствора, содержащего водонасыщенный фенол и хлороформ , в результате чего образуется верхняя водная фаза и нижняя органическая фаза (в основном фенол). Тиоцианат гуанидина , хаотропный агент , добавляется к органической фазе, чтобы способствовать денатурации белков (например, тех, которые прочно связывают нуклеиновые кислоты или тех, которые разрушают РНК). Нуклеиновые кислоты (РНК и/или ДНК) переходят в водную фазу, а белок — в органическую фазу. pH смеси определяет, какие нуклеиновые кислоты подлежат очистке. ^{[ 4 ]} В кислых условиях (pH 4–6) ДНК переходит в органическую фазу, а РНК остается в водной фазе. В нейтральных условиях (рН 7–8) и ДНК , и РНК переходят в водную фазу. На последней стадии нуклеиновые кислоты выделяют из водной фазы осаждением 2-пропанолом . Затем 2-пропанол промывают этанолом , осадок кратковременно сушат на воздухе и растворяют в ТЕ-буфере или в воде, не содержащей РНКазы.

Тиоцианат гуанидина денатурирует белки, в том числе РНКазы, и отделяет рРНК от рибосомальных белков, тогда как фенол , изопропанол и вода являются растворителями с плохой растворимостью. В присутствии хлороформа или BCP ( бромхлорпропана ) эти растворители полностью разделяются на две фазы, которые можно узнать по цвету: прозрачную верхнюю водную фазу (содержащую нуклеиновые кислоты) и нижнюю фазу (содержащую белки, растворенные в феноле и липиды, растворенные в хлороформе). другие денатурирующие химические вещества, такие как 2-меркаптоэтанол и саркозин Также можно использовать . Основным недостатком является то, что фенол и хлороформ являются одновременно опасными и неудобными материалами, а их экстракция зачастую трудоемка, поэтому в последние годы многие компании предлагают альтернативные способы выделения РНК.

Реагенты

Фенол : Фенол, используемый в биохимии, поставляется в виде водонасыщенного раствора с трис-буфером , в виде трис-буферного раствора 50% фенола, 50% хлороформа или в виде трис-буферного раствора 50% фенола, 48% хлороформа, 2% изоамилового спирта. решение (иногда называемое «25:24:1»). Фенол, естественно, частично растворим в воде и дает нечеткую границу раздела, которая становится более четкой в присутствии хлороформа, а изоамиловый спирт уменьшает пенообразование. Большинство растворов также содержат антиоксиданты, поскольку окисленный фенол повреждает нуклеиновые кислоты. Для очистки РНК pH поддерживают на уровне около 4, что предпочтительно удерживает РНК в водной фазе. Для очистки ДНК pH обычно составляет около 7, при этом все нуклеиновые кислоты находятся в водной фазе.
Хлороформ : Хлороформ стабилизируется небольшими количествами амилена или этанола , поскольку воздействие чистого хлороформа на кислород и ультрафиолетовый свет приводит к образованию газообразного фосгена . Некоторые растворы хлороформа представляют собой предварительно приготовленную смесь 96% хлороформа и 4% изоамилового спирта, которую можно смешать с равным объемом фенола для получения раствора 25:24:1.
Изоамиловый спирт : Изоамиловый спирт может уменьшить пенообразование и обеспечить дезактивацию РНКаз.

См. также

Ссылки

^ Рио, Дональд С.; Арес, Мануэль; Хэннон, Грегори Дж.; Нильсен, Тимоти В. (2010). «Очистка РНК с использованием TRIzol (TRI Reagent)». Протоколы Колд-Спринг-Харбора . 2010 (6): pdb.prot5439. дои : 10.1101/pdb.prot5439 . ISSN 1940-3402 .
^ Хомчинский, П.; Сакки, Н. (1987). «Одностадийный метод выделения РНК путем кислой экстракции тиоцианатом гуанидиния, фенола и хлороформа». Анальный. Биохим. 162 (1): 156–159. дои : 10.1016/0003-2697(87)90021-2 . ПМИД 2440339 .
^ Хомчинский, П.; Сакки, Н. (2006). «Одностадийный метод выделения РНК путем кислотной экстракции тиоцианатом гуанидиния, фенола и хлороформа: двадцать с чем-то лет спустя». Протоколы природы . 1 (2): 581–585. дои : 10.1038/нпрот.2006.83 . ПМИД 17406285 . S2CID 28653075 .
^ Перри Р.П., Ла Торре Дж., Келли Д.Э., Гринберг-младший. (1972) О лабильности поли(А)-последовательностей при выделении матричной РНК из полирибосом. Биохим. Биофиз. Акта 262: 220–226; Браверман Дж., Мендеки Дж., Ли С.Ю. (1972)Процедура выделения матричной рибонуклеиновой кислоты млекопитающих. Биохимия 11: 637–641.

Внешние ссылки

[z619-1] Рио, Дональд С.; Арес, Мануэль; Хэннон, Грегори Дж.; Нильсен, Тимоти В. (2010). «Очистка РНК с использованием TRIzol (TRI Reagent)». Протоколы Колд-Спринг-Харбора . 2010 (6): pdb.prot5439. дои : 10.1101/pdb.prot5439 . ISSN 1940-3402 .

[2] Хомчинский, П.; Сакки, Н. (1987). «Одностадийный метод выделения РНК путем кислой экстракции тиоцианатом гуанидиния, фенола и хлороформа». Анальный. Биохим. 162 (1): 156–159. дои : 10.1016/0003-2697(87)90021-2 . ПМИД 2440339 .

[3] Хомчинский, П.; Сакки, Н. (2006). «Одностадийный метод выделения РНК путем кислотной экстракции тиоцианатом гуанидиния, фенола и хлороформа: двадцать с чем-то лет спустя». Протоколы природы . 1 (2): 581–585. дои : 10.1038/нпрот.2006.83 . ПМИД 17406285 . S2CID 28653075 .

[4] Перри Р.П., Ла Торре Дж., Келли Д.Э., Гринберг-младший. (1972) О лабильности поли(А)-последовательностей при выделении матричной РНК из полирибосом. Биохим. Биофиз. Акта 262: 220–226; Браверман Дж., Мендеки Дж., Ли С.Ю. (1972)Процедура выделения матричной рибонуклеиновой кислоты млекопитающих. Биохимия 11: 637–641.

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]