Мультиплексное лигирование-зависимое усиление зонда

Мультиплексная лигирующая амплификация зонда ( MLPA ) представляет собой изменение мультиплексной полимеразной цепной реакции , которая позволяет усилить множественные мишени только с одной парой праймеров . ^{[ 1 ]} Он обнаруживает изменения количества копий на молекулярном уровне, и для анализа используются программы. Идентификация делеций или дупликаций может указывать на патогенные мутации, поэтому MLPA является важным диагностическим инструментом, используемым в лабораториях клинической патологии по всему миру.

История

Мультиплексное лигирование-зависимое усиление зонда было изобретено Яном Шутеном , голландским ученым. ^{[ 1 ]} Метод был впервые описан в 2002 году в исследовании научных журналов нуклеиновых кислот . ^{[ 2 ]} The first applications included the detection of exon deletions in the human genes BRCA1 , MSH2 and MLH1 , which are linked to hereditary breast and colon cancer. Теперь MLPA используется для обнаружения сотен наследственных расстройств, а также для профилирования опухолей.

Описание

MLPA количественно определяет наличие конкретных последовательностей в образце ДНК, используя специально разработанную пару зондов для каждой интересующей последовательности целевой последовательности. Процесс состоит из нескольких шагов: ^{[ 3 ]}

ДНК образца денатурируется , что приводит к одноцепочечному образцу ДНК.
Пары зондов гибридизируются с ДНК образца, причем каждая пара зондов предназначена для запроса на наличие конкретной последовательности ДНК.
Лигаза применяется к гибридизированной ДНК, объединяя пары зондов, которые гибридизируются непосредственно рядом друг с другом в одну цепь ДНК, которая может быть амплифицирована с помощью ПЦР.
ПЦР усиливает все пары зондов, которые были успешно лигированы, используя флуорестно меченные праймеры ПЦР.
Продукты ПЦР определяются количественно, как правило, (капиллярный) электрофорез .

-мишени Каждая пара зондов состоит из двух олигонуклеотидов, с последовательности, которая распознает соседние участки ДНК , сайт праймирования ПЦР и, необязательно, «наполнитель», чтобы дать продукту ПЦР уникальную длину по сравнению с другими парами зондов в анализе MLPA. Каждая полная пара зондов должна иметь уникальную длину, так что ее полученные ампликоны могут быть однозначно идентифицированы во время количественного определения, избегая ограничений разрешения мультиплексной ПЦР . Поскольку прямой праймер, используемый для амплификации зонда, флуоресцентно помечен, каждый ампликон генерирует флуоресцентный пик, который может быть обнаружен капиллярным секвенсором. Сравнивая пиковую картину, полученную на данном образе с таковой, полученной в различных эталонных образцах, можно определить относительное количество каждого ампликона. Это соотношение является мерой для отношения, в котором целевая последовательность присутствует в ДНК образца.

Различные методы, в том числе DGGE ( электрофорез геля градиента денатурирования ), DHPLC ( высокопроизводительная жидкая хроматография ) и SSCA (анализ конформации с одной цепи), эффективно идентифицируют SNP и небольшие вставки и удаления. MLPA, однако, является одним из единственных точных, эффективных временных методов для обнаружения геномных удалений и вставки (один или несколько целых экзонов), которые являются частыми причинами рака, таких как наследственный неполипоз колоректальный рак ( HNPCC ), грудь и грудь и грудь рак яичников. MLPA может успешно и легко определить относительное количество копий всех экзонов в гене одновременно с высокой чувствительностью.

Относительная плоидия

Важным использованием MLPA является определение относительной плоиды . Например, зонды могут быть спроектированы для нацеливания на различные области хромосомы 21 клетки человека. Сила сигнала зондов сравнивается с таковыми, полученными из образец опорной ДНК, который, как известно, имеет две копии хромосомы. Если в испытательном образце присутствует дополнительная копия, ожидается, что сигналы будут в 1,5 раза больше интенсивности соответствующих зондов из ссылки. Если присутствует только одна копия, ожидается, что доля будет 0,5. Если выборка имеет две копии, ожидается, что относительная прочность зонда будет равными.

Анализ дозировки дозировки

Анализ дозировки является обычным методом интерпретации данных MLPA. ^{[ 4 ]} Если A и B являются сигналами от двух ампликонов в образце пациента, а A и B являются соответствующими ампликонами в экспериментальном контроле, то дозировка коэффициента DQ = (A/B)/(A/B). Хотя коэффициенты дозировки могут быть рассчитаны для любой пары ампликонов, обычно относится к тому, что одна из пары является внутренним эталонным зондом.

Приложения

MLPA облегчает амплификацию и обнаружение нескольких целей с помощью одной пары праймеров. В стандартной мультиплексной реакции ПЦР каждый фрагмент нуждается в уникальной паре усилителей праймеров. Эти праймеры присутствуют в большом количестве, приводят к различным проблемам, таким как димеризация и ложное праймирование. При MLPA может быть достигнуто усиление зондов. Таким образом, многие последовательности (до 40) могут быть усилены и количественно определены с использованием лишь одной пары праймеров. Реакция MLPA быстрая, недорогая и очень простая в выполнении.

MLPA имеет множество приложений ^{[ 5 ]} включая обнаружение мутаций и отдельных нуклеотидных полиморфизмов , ^{[ 6 ]} ДНК анализ метилирования , ^{[ 7 ]} Относительное количественное определение мРНК , ^{[ 8 ]} хромосомная характеристика клеточных линий и образцов тканей, ^{[ 9 ]} обнаружение числа копий генов, ^{[ 10 ]} Обнаружение дупликаций и делеций в генах предрасположенности рака человека , таких как BRCA1 , BRCA2 , HMLH1 и HMSH2 ^{[ 11 ]} и анеуплоидии . определение ^{[ 12 ]} MLPA имеет потенциальное применение в пренатальной диагностике как инвазивных ^{[ 13 ]} и неинвазивный . ^{[ 14 ]}

Недавние исследования показали, что MLPA (а также другие варианты, такие как IMLPA), является надежным методом характеристики инверсии. ^{[ 15 ]}

Варианты

Imlpa

Giner-Delgado, Carla, et al. описал вариант MLPA, объединяющий его с IPCR. Они называют этот новый метод IMLPA ^{[ 15 ]} и его процедура такая же, как MLPA, но в начале есть два дополнительных шага:

Во -первых, необходимо лечение ДНК с рестрикционными ферментами, которые разрезают по обе стороны интересующей области.
Фрагменты, полученные из пищеварения, рециркуляризируются и связаны

Дизайн зонда очень похож. Каждый зонд будет сформирован двумя частями, которые имеют по крайней мере: целевую последовательность , которая представляет собой область, которая содержит последовательность, дополняющую интересующую область, так что может произойти правильная гибридизация. И последовательность праймеров в конце, это последовательность, чья дизайн варьируется и является то, что позволит конструкции праймеров и последующего усиления фрагментов. Кроме того, одна из частей зонда обычно содержит наводчик между целевой последовательности и последовательности праймеров. Использование различных набивающих позволяет идентифицировать зонды с одинаковыми последовательностями праймеров, но разных целевых последовательностей, то есть ключевой для множественной амплификации нескольких различных фрагментов в одной реакции.

Следующий шаг продолжается с типичным протоколом MLPA. ^{[ 1 ]}

Ссылки

^ Jump up to: ^а ^{беременный} ^в Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, Zwijnenburg D, Diepvens F, Pals G (2002). «Относительное количественное определение 40 последовательностей нуклеиновых кислот с помощью мультиплексной лигирующей амплификации зонда» . Нуклеиновые кислоты Res . 30 (12): 57e - 57. doi : 10.1093/nar/gnf056 . PMC 117299 . PMID 12060695 .
^ Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, Zwijnenburg D, Diepvens F, Pals G (2002-06-15). «Относительное количественное определение 40 последовательностей нуклеиновых кислот с помощью мультиплексной лигирующей амплификации зонда» . Исследование нуклеиновых кислот . 30 (12): E57. doi : 10.1093/nar/gnf056 . ISSN 0305-1048 . PMC 117299 . PMID 12060695 .
^ «Мультиплексное лигирование-зависимое усиление зонда (MLPA)» . Bitesize Bio . 2018-12-27 . Получено 2021-06-07 .
^ Яу С.К., Боброу М., Мэтью К.Г., Аббс С.Дж. (1996). «Точный диагноз носителей делеций и дублирования в мышечной дистрофии Дюшенна/Беккера с помощью флуоресцентного анализа дозировки» . J. Med. Генет . 33 (7): 550–558. doi : 10.1136/jmg.33.7.550 . PMC 1050661 . PMID 8818939 .
^ Список статей, связанных с MLPA, архивированных 2007-02-20 на машине Wayback
^ Volikos E, Robinson J, Aittomaki K, Mecklin JP, Jarvinen H, Westerman AM, De Rooji FW, Vogel T, Moeslein G, Launonen V, Tomlinson IP, Silver AR, Aaltonen LA (2006). «Исходные экзонические и цельные гены LKB1 являются распространенной причиной синдрома Путц-Джегера» . J. Med. Генет . 43 (5): E18. doi : 10.1136/jmg.2005.039875 . PMC 2564523 . PMID 16648371 .
^ Procter M, Chou LS, Tang W, Jama M, Mao R (2006). «Молекулярная диагностика синдромов Прадера-Вилли и Ангелмана с помощью метилирования-специфического анализа плавления и специфического для метилирования мультиплексного лигирования-зависимого амплификации зонда» (PDF) . Клин Химический 52 (7): 1276–1283. doi : 10.1373/clinchem.2006.067603 . PMID 16690734 .
^ Wehner M, Mangold E, Sengteller M, Friedrichs N, Aretz S, Friedl W, Proping P, Pagenstecher C (2005). «Наследственный неполипоз колоректальный рак: ловушки в скрининге делеции в генах MSH2 и MLH1» . Евро. J. Hum. Генет . 13 (8): 983–986. doi : 10.1038/sj.ejhg.5201421 . PMID 15870828 .
^ Wilting SM, Snijders PJ, Meijer GA, Ylstra B, Van Den Ijssel PR, Snijders AM, Albertson DG, Cofa J, Schouten JP, Van de Wiel MA, Meijer CJ, Steenbergen Rd (2006). «Увеличение числа копий генов в хромосоме 20Q часто встречается как в плоскоклеточных карциномах, так и в аденокарциномах шейки матки». J. Pathol . 209 (2): 220–230. Doi : 10,1002/path.1966 . PMID 16538612 . S2CID 25427077 .
^ Введение в MLPA
^ Bunyan DJ, Eccles DM, Sillibourne J, Wilkins E, Thomas NS, Shea-Simonds J, Duncan PJ, Curtis CE, Robinson DO, Harvey JF, Cross NC (2004). «Анализ дозировки генов предрасположенности рака с помощью мультиплексной лигирующей амплификации зонда» . Бренд Дж. Рак . 91 (6): 1155–1159. doi : 10.1038/sj.bjc.6602121 . PMC 2747696 . PMID 15475941 .
^ Гердес Т., Кирххофф М., Линд А.М., Ларсен Г.В., Шварц М., Лундстин С. (2005). «Компьютерная пренатальная анеуплоидная скрининг для хромосомы 13, 18, 21, x и y на основе мультиплексного лигирования-зависимого амплификации зонда (MLPA)» . Евро. J. Hum. Генет . 13 (2): 171–175. doi : 10.1038/sj.ejhg.5201307 . PMID 15483643 .
^ Highst Y R, Major J, из Brug J, Vossed-Hoff I, Jans R, Lift RB, Sink RJ, Page-Christian GC, Paless of Amstlee JM, Pater JM (2005). «Быстрое обнаружение или хромосомсомальные анеуплауды в некультурированных амницитах с помощью мультилекс -ответственности зависит от амплиминации зонда (MLPA)». Пренат. Диагноз 25 (11): 1032–1039. doi : 10,1002/с.1247 . PMID 1623111 . S2CID 23214645 .
^ Illanes S, Avent N, Soothill PW (2005). «Бесклетчатая ДНК плода в материнской плазме: важный прогресс для связи генетики плода с акушерским ультразвуком» . Ультразвуковое акушерство. Гинекол . 25 (4): 317–322. doi : 10.1002/uog.1881 . PMID 15789415 .
^ Jump up to: ^а ^{беременный} Ginner-Delgado, C., Villatoro, S., Lerga-Jasso, J., Gayà-Vidal, M., Oliva, M., Castellano, D., ... & Olalde, I. (2019). Эволюционное и функциональное влияние общих полиморфных инверсий в геноме человека. Природная связь , 10 (1), 1-1 https://doi.org/10.1038/S41467-019-12173-x

Внешние ссылки

Дальнейшие применения MLPA

[:0-1] Jump up to: ^а ^{беременный} ^в Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, Zwijnenburg D, Diepvens F, Pals G (2002). «Относительное количественное определение 40 последовательностей нуклеиновых кислот с помощью мультиплексной лигирующей амплификации зонда» . Нуклеиновые кислоты Res . 30 (12): 57e - 57. doi : 10.1093/nar/gnf056 . PMC 117299 . PMID 12060695 .

[2] Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, Zwijnenburg D, Diepvens F, Pals G (2002-06-15). «Относительное количественное определение 40 последовательностей нуклеиновых кислот с помощью мультиплексной лигирующей амплификации зонда» . Исследование нуклеиновых кислот . 30 (12): E57. doi : 10.1093/nar/gnf056 . ISSN 0305-1048 . PMC 117299 . PMID 12060695 .

[3] «Мультиплексное лигирование-зависимое усиление зонда (MLPA)» . Bitesize Bio . 2018-12-27 . Получено 2021-06-07 .

[4] Яу С.К., Боброу М., Мэтью К.Г., Аббс С.Дж. (1996). «Точный диагноз носителей делеций и дублирования в мышечной дистрофии Дюшенна/Беккера с помощью флуоресцентного анализа дозировки» . J. Med. Генет . 33 (7): 550–558. doi : 10.1136/jmg.33.7.550 . PMC 1050661 . PMID 8818939 .

[5] Список статей, связанных с MLPA, архивированных 2007-02-20 на машине Wayback

[6] Volikos E, Robinson J, Aittomaki K, Mecklin JP, Jarvinen H, Westerman AM, De Rooji FW, Vogel T, Moeslein G, Launonen V, Tomlinson IP, Silver AR, Aaltonen LA (2006). «Исходные экзонические и цельные гены LKB1 являются распространенной причиной синдрома Путц-Джегера» . J. Med. Генет . 43 (5): E18. doi : 10.1136/jmg.2005.039875 . PMC 2564523 . PMID 16648371 .

[7] Procter M, Chou LS, Tang W, Jama M, Mao R (2006). «Молекулярная диагностика синдромов Прадера-Вилли и Ангелмана с помощью метилирования-специфического анализа плавления и специфического для метилирования мультиплексного лигирования-зависимого амплификации зонда» (PDF) . Клин Химический 52 (7): 1276–1283. doi : 10.1373/clinchem.2006.067603 . PMID 16690734 .

[8] Wehner M, Mangold E, Sengteller M, Friedrichs N, Aretz S, Friedl W, Proping P, Pagenstecher C (2005). «Наследственный неполипоз колоректальный рак: ловушки в скрининге делеции в генах MSH2 и MLH1» . Евро. J. Hum. Генет . 13 (8): 983–986. doi : 10.1038/sj.ejhg.5201421 . PMID 15870828 .

[9] Wilting SM, Snijders PJ, Meijer GA, Ylstra B, Van Den Ijssel PR, Snijders AM, Albertson DG, Cofa J, Schouten JP, Van de Wiel MA, Meijer CJ, Steenbergen Rd (2006). «Увеличение числа копий генов в хромосоме 20Q часто встречается как в плоскоклеточных карциномах, так и в аденокарциномах шейки матки». J. Pathol . 209 (2): 220–230. Doi : 10,1002/path.1966 . PMID 16538612 . S2CID 25427077 .

[10] Введение в MLPA

[11] Bunyan DJ, Eccles DM, Sillibourne J, Wilkins E, Thomas NS, Shea-Simonds J, Duncan PJ, Curtis CE, Robinson DO, Harvey JF, Cross NC (2004). «Анализ дозировки генов предрасположенности рака с помощью мультиплексной лигирующей амплификации зонда» . Бренд Дж. Рак . 91 (6): 1155–1159. doi : 10.1038/sj.bjc.6602121 . PMC 2747696 . PMID 15475941 .

[12] Гердес Т., Кирххофф М., Линд А.М., Ларсен Г.В., Шварц М., Лундстин С. (2005). «Компьютерная пренатальная анеуплоидная скрининг для хромосомы 13, 18, 21, x и y на основе мультиплексного лигирования-зависимого амплификации зонда (MLPA)» . Евро. J. Hum. Генет . 13 (2): 171–175. doi : 10.1038/sj.ejhg.5201307 . PMID 15483643 .

[13] Highst Y R, Major J, из Brug J, Vossed-Hoff I, Jans R, Lift RB, Sink RJ, Page-Christian GC, Paless of Amstlee JM, Pater JM (2005). «Быстрое обнаружение или хромосомсомальные анеуплауды в некультурированных амницитах с помощью мультилекс -ответственности зависит от амплиминации зонда (MLPA)». Пренат. Диагноз 25 (11): 1032–1039. doi : 10,1002/с.1247 . PMID 1623111 . S2CID 23214645 .

[14] Illanes S, Avent N, Soothill PW (2005). «Бесклетчатая ДНК плода в материнской плазме: важный прогресс для связи генетики плода с акушерским ультразвуком» . Ультразвуковое акушерство. Гинекол . 25 (4): 317–322. doi : 10.1002/uog.1881 . PMID 15789415 .

[:1-15] Jump up to: ^а ^{беременный} Ginner-Delgado, C., Villatoro, S., Lerga-Jasso, J., Gayà-Vidal, M., Oliva, M., Castellano, D., ... & Olalde, I. (2019). Эволюционное и функциональное влияние общих полиморфных инверсий в геноме человека. Природная связь , 10 (1), 1-1 https://doi.org/10.1038/S41467-019-12173-x

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]

[ 11 ]

[ 12 ]

[ 13 ]

[ 14 ]

[ 15 ]

v Т и полимеразной цепной реакции Методы
Процедура	Инициализация Цикл Денатурация Отжиг Удлинение Окончательное удлинение Окончательный удержание
Полимераза	Кленоу T4 и T7 Таке Тт ПФУ Вентиляционный Ящики Тли TFU
Оптимизация и варианты	Количественная полимеразная цепная реакция (КПЦР) Обратная транскрипционная полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР) Обратная полимеразная цепная реакция (обратная ПЦР) Вложенная полимеразная цепная реакция (вложенная ПЦР) Приземление полимеразной цепной реакции Горячий старт ПЦР Перекрытие удлинительной полимеразной цепной реакции (OE-PCR) Мультиплексная полимеразная цепная реакция (мультиплексная ПЦР) Мультиплексное лигирование-зависимое усиление зонда (MLPA) Совместная амплификация при более низкой температуре денатурации ПЦР (Cold-PCR) Цифровая полимеразная цепная реакция (DEPCR) Случайная амплификация полиморфной ДНК (RAPD)
История и люди	Кари Муллис Кьелл Клеппе Алиса Дог