Иммобилизованный фермент

Иммобилизованный фермент представляет собой фермент с ограниченной подвижностью, прикрепленным к инертному, нерастворимому материалу, таким как альгинат кальция (продуцируемый путем реагирования смеси раствора альгината натрия и раствора фермента с хлоридом кальция ). Это может обеспечить повышенную устойчивость к изменениям в таких условиях, как pH или температура . Он также позволяет удерживать ферменты на протяжении всей реакции, после чего они легко отделены от продуктов и могут использоваться снова - гораздо более эффективный процесс, и поэтому широко используется в промышленности для на ферментах катализированных реакций, . Альтернативой иммобилизации фермента является иммобилизация целых клеток . ^{[ 1 ]}^{[ 2 ]} Иммобилизованные ферменты легко обрабатываются, просто отделены от их продуктов и могут быть использованы повторно. ^{[ 3 ]}

Ферменты представляют собой био-катализаторы, которые играют важную роль в усилении химических реакций в клетках, не будучи постоянно модифицированными, не впустую и не приводят к потере равновесия химических реакций. Хотя характеристики ферментов чрезвычайно уникальны, их полезность в отрасли ограничена из-за отсутствия способности повторного использования, стабильности и высокой стоимости производства. ^{[ 4 ]}

История

Первый синтетический иммобилизованный фермент был изготовлен в 1950 -х годах, выполняемый включением фермента в полимерные матрицы или связывание с носителями. Также процедура сшивания была применена путем сшивки только белка или вместе с добавлением инертных материалов. ^{[ 3 ]} За последнее десятилетие были разработаны различные методы иммобилизации. Привязывание фермента с ранее синтезированными материалами для носителей, например, является в основном предпочтительным методом до сих пор. Недавно, процедура сшивания кристаллов фермента также рассматривается как захватывающая замена. Уровень использования иммобилизованных ферментов постоянно растет. ^{[ 5 ]}

Соображения

Прежде чем выполнять какие -либо методы иммобилизации, должны учитывать некоторые факторы. Необходимо понять химические и физические воздействия на фермент после иммобилизации. Стабильность фермента и кинетические характеристики могут быть изменены из -за изменений в условиях микроокружения фермента после захвата, прикрепления материала или продуктов ферментативных действий, например. Кроме того, важно рассмотреть возможность поддержания третичной структуры фермента до иммобилизации, чтобы иметь функциональный фермент. Точно так же, еще одним важным сайтом для функциональности фермента является активное сайт , который также следует поддерживать, в то время как фермент прикрепляется к поверхности для иммобилизации, необходимо иметь селективный метод для прикрепления поверхности/материал к Не в конечном итоге с иммобилизованным, но дисфункциональным ферментом. ^{[ 3 ]} Следовательно, существует три основополагающих фактора, которые должны рассматриваться для производства функциональных иммобилизованных ферментов: иммобилизация подтверждает отбор, условия и методы иммобилизации. ^{[ 6 ]}

Поддержка выбора

Чтобы опорный материал был идеальным, он должен быть гидрофильным , инертным в направлении ферментов, биосовместимых , микробных атаков и сжатия, и должен быть доступным. ^{[ 7 ]}^{[ 8 ]} Опорные материалы могут быть органическими или неорганическими, синтетическими или естественными (в зависимости от композиции), поскольку они являются типами биоматериалов в конце. Не существует универсального типа опорного материала, который будет использоваться для иммобилизации всех ферментов. Тем не менее, существуют некоторые часто используемые опоры, такие как носители на основе кремнезема, акриловые смолы , синтетические полимеры , активные мембраны и обменные смолы. ^{[ 6 ]} Одним из самых сложных процессов перед самого процесса иммобилизации является выбор опорного материала, поскольку он опирается на тип фермента, реакция среды, политику безопасности гидродинамических и условий реакции. ^{[ 3 ]}^{[ 8 ]} Поскольку разные типы поддержки дают различные физические и химические характеристики и свойства, которые будут влиять на функцию фермента, такие как: гидрофильность / гидрофобность , химия поверхности и размер пор.

Методы

Ферменты могут быть иммобилизованы физическими или химическими методами, включая:

Физический

Адсорбция

Простой метод обратимой иммобилизации с участием ферментов, адсорбированных или физически прикрепленных к опорному веществу. Адсорбция может происходить через слабые неспецифические силы, такие как ван-дер-ваальс , водородные связи и гидрофобные взаимодействия, тогда как в ионных связях ферменты связаны через солевые связи. ^{[ 6 ]}
Адсорбция на стекло, альгинатные шарики или матрица: фермент прикреплен к внешней стороне инертного материала. В целом, этот метод является самым медленным среди перечисленных здесь. Поскольку адсорбция не является химической реакцией , активный сайт иммобилизованного фермента может блокироваться матрицей или шарикой, значительно снижая активность фермента. ^{[ 9 ]}

Захват

Это необратимая техника физической иммобилизации, которая может рассматриваться как физическое ограничение фермента в указанной области/пространстве. Его можно использовать для повышения механической стабильности, а также можно использовать для уменьшения событий выщелачивания ферментов. Поскольку фермент в этом процессе не взаимодействует химически с полимером/ материалом опорных волокон/ решетки, он остается защищенным от денатурации со временем. ^{[ 6 ]}
По сути, фермент пойман в нерастворимых шариках или микросферах, таких как альгинатные шарики кальция. Тем не менее, эти нерастворимые вещества препятствуют прибытию субстрата и выход продуктов.

Химический

Сшивание

Поперечная связь : еще один необратимый метод, который не требует опорного материала для прикрепления ферментных молекул. В этом методе молекулы ферментов ковалентно связаны друг с другом, чтобы создать матрицу, состоящую из почти только фермента. фермента Реакция гарантирует, что сайт связывания не покрывает активное сайт , на активность фермента страдает только неподвижность. Тем не менее, негибкость ковалентных связей исключает самовосстанавливающиеся свойства, демонстрируемые химио-адсорбированными самооборными монослоями. Использование молекулы спейсера, такой как поли ( этиленгликоль ), помогает в снижении стерического препятствия подложкой в этом случае. ^{[ 6 ]}

Ковалентная связь

Фермент ковалентно связан с нерастворимой поддержкой (такой как силикагель или макропористые полимерные шарики с эпоксидными группами). Этот подход обеспечивает наиболее сильное взаимодействие фермента/поддержки, и поэтому самая низкая утечка белка во время катализа. ^{[ 10 ]}
Активность ковалентно связанного фермента зависит от нескольких факторов, включая: форму и размер материала носителя, тип метода связи, композицию и сочетание особых условий материала носителя. ^{[ 11 ]}

Связывание с аффинностью-tag: представляет собой метод иммобилизации, объединяющий физические и химические методы, где ферменты могут быть иммобилизованы на поверхность, например, в пористом материале, используя нековалентные или ковалентные белковые метки . Эта технология была создана для целей очистки белка. Этот метод в целом применима и может быть выполнена без предварительной очистки ферментов с чистым препаратом в результате. Используются пористые стекло и производные, где пористая поверхность может быть адаптирована с точки зрения гидрофобности в соответствии с рассматриваемым ферментом. ^{[ 9 ]}

Случайный против сайта, направленного

Многочисленные ферменты биотехнологического значения были иммобилизованы на различных опорах (неорганические, органические, композитные и наноматериалы) посредством случайного многоточечного прикрепления. Однако иммобилизация посредством случайной химической модификации приводит к гетерогенной популяции белков, где в белках, присутствующих более чем одну боковую цепи (амино, карбоксил, тиол и т. Д.) Полем ^{[ 12 ]}

Напротив, в иммобилизации фермента, направленного на сайт, поддержка может быть связана с одной специфической аминокислотой (обычно N- или C-конца) в молекуле белка вдали от активного сайта. Таким образом, максимальная активность фермента сохраняется из-за свободного доступа субстрата к активному сайту. Эти стратегии в основном являются химическими, но могут дополнительно потребовать генетических и ферментативных методов для генерации функциональных групп (которые отсутствуют в белке) в поддержке и ферменте. ^{[ 12 ]}

Выбор метода SDCM зависит от многих факторов, таких как тип фермента (менее стабильный психофильный или более стабильный термофильный гомолог), стабильность рН фермента, наличие N- или C-конце Фермент -концерн с активностью фермента, тип каталитической аминокислотной остатки, доступность, цена и простота приготовления реагентов. Например, генерация дополнительных кликабельных функций (алкин и азид) на поддержку и ферменте является одним из наиболее удобных способов иммобилизации ферментов посредством химической модификации, направленной на сайт. ^{[ 13 ]}

Подложка иммобилизация

Другим широко используемым применением подхода иммобилизации вместе с ферментами были ферментативные реакции на иммобилизованных субстратах. Этот подход облегчает анализ активности ферментов и имитирует эффективность ферментов на клеточных стенках, например. ^{[ 14 ]}

Коммерческое использование

Иммобилизованные ферменты имеют важное использование применения, поскольку они снижают затраты и улучшают результаты реакции, которую они катализируют. Преимущества включают:

Удобство: Неумысленные количества белка растворяются в реакции, поэтому рабочее время может быть намного проще. После завершения реакционные смеси обычно содержат только растворитель и продукты реакции. ^{[ 15 ]}
Экономика: Иммобилизованный фермент легко удаляется из реакции, что позволяет легко переработать биокатализатор . Это особенно полезно в таких процессах, как производство молока без лактозы, так как молоко можно слить из контейнера, покидающего фермент ( лактаза ) внутри, готовый к следующей партии. ^{[ 15 ]}
Стабильность: Иммобилизованные ферменты обычно обладают большей тепловой и эксплуатационной стабильностью, чем растворимая форма фермента. ^{[ 15 ]}

В прошлом биологические порошки и моющие средства содержали много протеаз и липаз , которые сломали грязь. Однако, когда чистящие средства связались с кожей человека, они создали аллергические реакции. Вот почему иммобилизация ферментов важна для многих областей применения.

Иммобилизованные ферменты используются в различных применениях, включая: пищевые, химические, фармацевтические и медицинские отрасли. иммобилизованные ферменты используются для производства нескольких типов нулевых калорийных сладостей, аллелоза например, является эпимером фруктозы Например, в пищевой промышленности , который различен структурно, что приводит к тому, что она не впитывается человеческими телами при попадании. Другой пример сладостей на основе иммобилизованного энзима включает в себя: тагатозу (иммобилизованная β-галактозидаза ). ^{[ 16 ]}

В химической (косметической) промышленности также используются иммобилизованные ферменты для производства эфирных эфиров путем использования иммобилизованного фермента CALB. Первой компанией, которая использует такой метод, является компания Evonik в 2000 году. Фермент липаза-кальба в его иммобилизованном состоянии фактически используется в других фармацевтических применениях для производства Odanacatib и Sofosbuvir . ^{[ 16 ]}

Ссылки

^ Zaushitsyna O, Berillo D, Kirsebom H, Mattiasson B (2013). «Криоструктурированные и сшитые жизнеспособные клетки, образующие монолиты, подходящие для применения биореактора». Темы в катализе . 57 (5): 339–348. doi : 10.1007/s11244-013-0189-9 . S2CID 94773366 .
^ Börner RA, Zaushitsyna O, Berillo D, Scaccia N, Mattiasson B, Kirsebom H (2014). «Иммобилизация Clostridium acetobutylicum DSM 792 в качестве макропористых агрегатов посредством криогелирования для производства бутанола». Процесс биохимия . 49 : 10–18. doi : 10.1016/j.procbio.2013.09.027 .
^ Jump up to: ^а ^{беременный} ^в ^{дюймовый} Fessner WD (1999). Биокатализ: от обнаружения до применения . Берлин: Спрингер. ISBN 3-540-64942-5 Полем OCLC 40551838 .
^ Zhang DH, Yuwen LX, Peng LJ (2013). «Параметры, влияющие на производительность иммобилизованного фермента» . Журнал химии . 2013 : 1–7. doi : 10.1155/2013/946248 . ISSN 2090-9063 .
^ Zelinski T, Waldmann H (1997-04-04). «Крестные кристаллы фермента (CLECS) - Эффективные и стабильные биокатализаторы для препаративной органической химии» . Прикладная химия (на немецком языке). 109 (7): 746–748. Bibcode : 1997angch.109..746z . DOI : 10.1002/Прикреплен .
^ Jump up to: ^а ^{беременный} ^в ^{дюймовый} ^и Мохамад Н.Р., Марзуки Н.Х., Буанг Н.А., Хуйоп Ф., Вахаб Р.А. (март 2015 г.). «Обзор технологий иммобилизации ферментов и методов анализа поверхности для иммобилизованных ферментов» . Биотехнология, биотехнологическое оборудование . 29 (2): 205–220. doi : 10.1080/13102818.2015.1008192 . PMC 4434042 . PMID 26019635 .
^ Brodelius P, Mosbach K (1987). «[14] Обзор». Методы в фермере . Тол. 135. Elsevier. С. 173–175. doi : 10.1016/0076-6879 (87) 35075-x . ISBN 9780121820350 Полем Получено 2022-12-28 .
^ Jump up to: ^а ^{беременный} Буххольц К., Кляйн Дж. (1987). «[1] Характеристика иммобилизованных биокатализаторов». Характеристика иммобилизованных биокатализаторов . Методы в фермере. Тол. 135. Elsevier. С. 3–30. doi : 10.1016/0076-6879 (87) 35062-1 . ISBN 9780121820350 Полем PMID 3600301 .
^ Jump up to: ^а ^{беременный} Engelmark Cassimjee K, Kadow M, Wikmark Y, Sedendahl Humble M, Rothstein ML, Rothstein DM, Bäckvall JE (август 2014). «Общий метод очистки белка и иммобилизации на контролируемом стекле пористости: биокаталитические применения» . Химическая связь . 50 (65): 9134–9137. doi : 10.1039/c4cc02605e . PMID 24989793 .
^ Zucca P, Sanjust E (сентябрь 2014 г.). «Неорганические материалы как поддержки для иммобилизации ковалентного фермента: методы и механизмы» . Молекулы . 19 (9): 14139–14194. doi : 10.3390/molecules190914139 . PMC 6272024 . PMID 25207718 .
^ смягчение с носителем» Polarons , Pres слабыми связями : Cambridge , «Поляроны с University 9781139023436 Получено 2022-12-28
^ Jump up to: ^а ^{беременный} Margesin R (2017-06-22). Психофилы: от биоразнообразия до биотехнологии (второе изд.). Чам, Швейцария: Спрингер. ISBN 978-3-319-57057-0 Полем OCLC 991854426 .
^ Шемси А.М., Кхандай Ф.А., Кораши А., Халил А., Гереро Г., Сиддики К.С. (май 2019). «Участок, направленные на химически модифицированные магнитные ферменты: изготовление, улучшения, биотехнологические применения и будущие перспективы». Биотехнологические достижения . 37 (3): 357–381. doi : 10.1016/j.biotechadv.2019.02.002 . PMID 30768953 . S2CID 73473772 .
^ Грей CJ, Вайсенборн М.Дж., Эйерс Се, Flitchch SL (август 2013 г.). «Ферментативные реакции на иммобилизованные субстраты». Обзоры химического общества . 42 (15): 6378–6405. doi : 10.1039/c3cs60018a . PMID 23579870 .
^ Jump up to: ^а ^{беременный} ^в Wu H, Liang Y, Shi J, Wang X, Yang D, Jiang Z (апрель 2013 г.). «Улучшенная стабильность каталазы, ковалентно иммобилизованной на функционализированных титановых субмикросферах» . Материаловая и инженерия. C, материалы для биологических применений . 33 (3): 1438–1445. doi : 10.1016/j.msec.2012.12.048 . PMID 23827593 .
^ Jump up to: ^а ^{беременный} Бассо, Алессандра; Сербан, Симона (2020), Гисан, Хосе М.; Боливар, Хуан М.; Лопес-Галлего, Фернандо; Rocha-Martín, Javier (Eds.), «Обзор применений иммобилизованных ферментов в фармацевтической, химической и пищевой промышленности» , Иммобилизация ферментов и клеток , методы в молекулярной биологии, вып. 2100, Нью-Йорк, Нью-Йорк: Springer US, стр. 27–63, doi : 10.1007/978-1-0716-0215-7_2 , ISBN 978-1-0716-0214-0 , PMID 31939114 , S2CID 210826633 , получен 2023-01-09

[Zaushitsyna2014-1] Zaushitsyna O, Berillo D, Kirsebom H, Mattiasson B (2013). «Криоструктурированные и сшитые жизнеспособные клетки, образующие монолиты, подходящие для применения биореактора». Темы в катализе . 57 (5): 339–348. doi : 10.1007/s11244-013-0189-9 . S2CID 94773366 .

[Börner2014-2] Börner RA, Zaushitsyna O, Berillo D, Scaccia N, Mattiasson B, Kirsebom H (2014). «Иммобилизация Clostridium acetobutylicum DSM 792 в качестве макропористых агрегатов посредством криогелирования для производства бутанола». Процесс биохимия . 49 : 10–18. doi : 10.1016/j.procbio.2013.09.027 .

[:0-3] Jump up to: ^а ^{беременный} ^в ^{дюймовый} Fessner WD (1999). Биокатализ: от обнаружения до применения . Берлин: Спрингер. ISBN 3-540-64942-5 Полем OCLC 40551838 .

[4] Zhang DH, Yuwen LX, Peng LJ (2013). «Параметры, влияющие на производительность иммобилизованного фермента» . Журнал химии . 2013 : 1–7. doi : 10.1155/2013/946248 . ISSN 2090-9063 .

[5] Zelinski T, Waldmann H (1997-04-04). «Крестные кристаллы фермента (CLECS) - Эффективные и стабильные биокатализаторы для препаративной органической химии» . Прикладная химия (на немецком языке). 109 (7): 746–748. Bibcode : 1997angch.109..746z . DOI : 10.1002/Прикреплен .

[:1-6] Jump up to: ^а ^{беременный} ^в ^{дюймовый} ^и Мохамад Н.Р., Марзуки Н.Х., Буанг Н.А., Хуйоп Ф., Вахаб Р.А. (март 2015 г.). «Обзор технологий иммобилизации ферментов и методов анализа поверхности для иммобилизованных ферментов» . Биотехнология, биотехнологическое оборудование . 29 (2): 205–220. doi : 10.1080/13102818.2015.1008192 . PMC 4434042 . PMID 26019635 .

[7] Brodelius P, Mosbach K (1987). «[14] Обзор». Методы в фермере . Тол. 135. Elsevier. С. 173–175. doi : 10.1016/0076-6879 (87) 35075-x . ISBN 9780121820350 Полем Получено 2022-12-28 .

[:2-8] Jump up to: ^а ^{беременный} Буххольц К., Кляйн Дж. (1987). «[1] Характеристика иммобилизованных биокатализаторов». Характеристика иммобилизованных биокатализаторов . Методы в фермере. Тол. 135. Elsevier. С. 3–30. doi : 10.1016/0076-6879 (87) 35062-1 . ISBN 9780121820350 Полем PMID 3600301 .

[Cassimjee2014-9] Jump up to: ^а ^{беременный} Engelmark Cassimjee K, Kadow M, Wikmark Y, Sedendahl Humble M, Rothstein ML, Rothstein DM, Bäckvall JE (август 2014). «Общий метод очистки белка и иммобилизации на контролируемом стекле пористости: биокаталитические применения» . Химическая связь . 50 (65): 9134–9137. doi : 10.1039/c4cc02605e . PMID 24989793 .

[10] Zucca P, Sanjust E (сентябрь 2014 г.). «Неорганические материалы как поддержки для иммобилизации ковалентного фермента: методы и механизмы» . Молекулы . 19 (9): 14139–14194. doi : 10.3390/molecules190914139 . PMC 6272024 . PMID 25207718 .

[11] смягчение с носителем» Polarons , Pres слабыми связями : Cambridge , «Поляроны с University 9781139023436 Получено 2022-12-28

[:3-12] Jump up to: ^а ^{беременный} Margesin R (2017-06-22). Психофилы: от биоразнообразия до биотехнологии (второе изд.). Чам, Швейцария: Спрингер. ISBN 978-3-319-57057-0 Полем OCLC 991854426 .

[13] Шемси А.М., Кхандай Ф.А., Кораши А., Халил А., Гереро Г., Сиддики К.С. (май 2019). «Участок, направленные на химически модифицированные магнитные ферменты: изготовление, улучшения, биотехнологические применения и будущие перспективы». Биотехнологические достижения . 37 (3): 357–381. doi : 10.1016/j.biotechadv.2019.02.002 . PMID 30768953 . S2CID 73473772 .

[Gray2013-14] Грей CJ, Вайсенборн М.Дж., Эйерс Се, Flitchch SL (август 2013 г.). «Ферментативные реакции на иммобилизованные субстраты». Обзоры химического общества . 42 (15): 6378–6405. doi : 10.1039/c3cs60018a . PMID 23579870 .

[:4-15] Jump up to: ^а ^{беременный} ^в Wu H, Liang Y, Shi J, Wang X, Yang D, Jiang Z (апрель 2013 г.). «Улучшенная стабильность каталазы, ковалентно иммобилизованной на функционализированных титановых субмикросферах» . Материаловая и инженерия. C, материалы для биологических применений . 33 (3): 1438–1445. doi : 10.1016/j.msec.2012.12.048 . PMID 23827593 .

[:5-16] Jump up to: ^а ^{беременный} Бассо, Алессандра; Сербан, Симона (2020), Гисан, Хосе М.; Боливар, Хуан М.; Лопес-Галлего, Фернандо; Rocha-Martín, Javier (Eds.), «Обзор применений иммобилизованных ферментов в фармацевтической, химической и пищевой промышленности» , Иммобилизация ферментов и клеток , методы в молекулярной биологии, вып. 2100, Нью-Йорк, Нью-Йорк: Springer US, стр. 27–63, doi : 10.1007/978-1-0716-0215-7_2 , ISBN 978-1-0716-0214-0 , PMID 31939114 , S2CID 210826633 , получен 2023-01-09

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]

[ 11 ]

[ 12 ]

[ 13 ]

[ 14 ]

[ 15 ]

[ 16 ]

v Т и Концепции энантиоселективного синтеза
Типы хиральности	Хиральность Стерео центр Планарная хиральность C ₂ -Симметричные лиганды Осевая хиральность Супрамолекулярная хиральность Присущая хиральности
Хиральные молекулы	Стереоизомер Энантиомер Диастереомер Мезо соединение Раковая смесь Энантиомерный избыток (EE) Диастереомерный избыток (DE)
Анализ	Оптическое вращение Хиральные дериватизирующие агенты ЯМР -спектроскопия стереоизомеров Ультрафиолетовая спектроскопия стереоизомеров
Хиральное разрешение	Перекристаллизация Кинетическое разрешение Хиральная колонна хроматография Диастереомерная перекристаллизация
Реакция	Асимметричная индукция Хиральный синтез бассейна Хиральные вспомогательные Асимметричный катализ Органокатализ Биокатализ