Лантанидные зонды

Лантаноидные зонды являются неинвазивным аналитический инструмент, обычно используемый для биологических и химических приложений. Лантаниды — это ионы металлов, у которых заполнен энергетический уровень 4f, и обычно они относятся к элементам от церия до лютеция в периодической таблице . Флуоресценция солей лантаноидов слабая , поскольку поглощение энергии металлического иона мало; поэтому чаще всего используются хелатные комплексы лантаноидов. Термин «хелат» происходит от греческого слова «коготь» и применяется для обозначения лигандов, которые прикрепляются к иону металла с двумя или более донорными атомами посредством дативных связей . Флуоресценция наиболее интенсивна, когда ион металла имеет степень окисления 3+. Не все металлы-лантаниды можно использовать, наиболее распространенными являются: Sm(III), Eu(III), Tb(III) и Dy(III).

История

EuFOD, пример комплекса европия

С начала 1930-х годов было известно, что соли некоторых лантаноидов флуоресцируют. Реакция солей лантаноидов с нуклеиновыми кислотами обсуждалась в ряде публикаций 1930-х и 1940-х годов, где для фиксации структур нуклеиновых кислот использовались лантансодержащие реагенты. В 1942 было обнаружено, что комплексы европия , тербия и самария проявляют необычные люминесцентные свойства при возбуждении УФ-светом . Однако первое окрашивание биологических клеток лантанидами произошло двадцать лет спустя при обработке мазков бактерий E. coli водными растворами комплекса европия, которые при освещении ртутной лампой проявлялись в виде ярко-красных пятен. Внимание к лантаноидным зондам значительно возросло в середине 1970-х годов, когда финские исследователи предложили полиаминокарбоксилаты Eu(III), Sm(III), Tb(III) и Dy(III) в качестве люминесцентных сенсоров в люминесцентных (TRL) иммуноанализах с временным разрешением. Оптимизация аналитических методов, начиная с 1970-х годов, для хелатов лантаноидов и люминесцентной микроскопии с временным разрешением (TRLM) привела к использованию зондов на основе лантаноидов во многих научных, медицинских и коммерческих областях.

Техники

Существует два основных метода анализа: гетерогенный и гомогенный. Если в анализе последовательно используются два хелата лантаноидов — это называется гетерогенным анализом. Первый аналит связывается со специфическим связующим агентом на твердой основе, такой как полимер , а затем другая реакция связывает первый плохо люминесцентный комплекс лантаноида с новым, лучшим комплексом. Этот утомительный метод используется потому, что второе, более люминесцентное соединение не будет связываться без присутствия первого аналита. Последующее с разрешением по времени обнаружение металлоцентрированного люминесцентного зонда дает желаемый сигнал. Антигены , стероиды и гормоны обычно анализируются гетерогенными методами. Гомогенные анализы основаны на прямом связывании метки лантаноида с органическим акцептором.

Релаксация возбужденных состояний молекул часто происходит за счет излучения света, называемого флуоресценцией. Есть два способа измерения этого излучаемого излучения: как функция частоты ( обратная длине волны ) или времени. Обычно спектр флуоресценции показывает интенсивность флуоресценции на разных длинах волн, но поскольку лантаноиды имеют относительно большие времена затухания флуоресценции (от одной микросекунды до одной миллисекунды), можно регистрировать излучение флуоресценции при разных временах затухания от заданной энергии возбуждения при время ноль. Это называется флуоресцентной спектроскопией с временным разрешением.

Механизм

Лантаниды можно использовать, поскольку их небольшой размер ( ионный радиус ) дает им способность замещать ионы металлов внутри белковых комплексов, таких как кальций или никель . Оптические свойства ионов лантаноидов, таких как Ln(III), обусловлены особенностями их электронного [Xe]4f ^н конфигурации. Эти конфигурации порождают множество электронных уровней, число которых равно [14!/n!(14- n)!], что соответствует 3003 энергетическим уровням для Eu(III) и Tb(III).

Энергии этих уровней хорошо определены благодаря экранированию 4f-орбиталей заполненными подоболочками 5s и 5p. и не очень чувствительны к химической среде, в которую попадают ионы лантаноидов. Переходы 4f-4f внутренней оболочки охватывают как видимый, так и ближний инфракрасный диапазоны. Они резкие и легко узнаваемые. Поскольку эти переходы запрещены по четности, время жизни возбужденных состояний велико, что позволяет использовать спектроскопию с временным разрешением . незаменимый актив для биоанализов и микроскопии. Единственным недостатком ff-переходов является их слабая сила осциллятора, которую на самом деле можно превратить в преимущество.

Энергия, поглощенная органическим рецептором (лигандом), передается на возбужденные состояния Ln(III), и резкие полосы излучения, исходящие от иона металла, обнаруживаются после быстрого внутреннего преобразования на излучающий уровень. Это явление называется сенсибилизацией металлоцентрированного комплекса (также называемым антенным эффектом) и является довольно сложным. Однако путь миграции энергии проходит через долгоживущее триплетное состояние лиганда. Ионы Ln(III) являются хорошими тушителями триплетных состояний, поэтому фотообесцвечивание существенно снижается. Для лантаноидных зондов наблюдаются три типа переходов: LMCT, 4f-5d и внутриконфигурационные 4f-4f. Первые два обычно происходят при энергиях, слишком высоких, чтобы их можно было использовать в биоприложениях.

Приложения

Исследования рака

Инструменты скрининга для разработки новых методов лечения рака пользуются большим спросом во всем мире и часто требуют определения кинетики ферментов. Высокая чувствительность люминесценции лантаноидов, особенно люминесценции с временным разрешением, оказалась идеальным кандидатом для этой цели. Существует несколько способов проведения этого анализа с использованием субстратов флуорогенных ферментов, субстратов, несущих донорно-акцепторные группы, обеспечивающих резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET), и иммуноанализов. Например, белки, связывающие гуаниновые нуклеотиды, состоят из нескольких субъединиц, одна из которых включает субъединицы подсемейства Ras . Ras -ГТФазы действуют как бинарные переключатели, превращая гуаденозинтрифосфат ( GTP ) в гуаденозиндифосфат ( GDP ). Люминесценция комплекса Tb(III) с норфлоксацином чувствительна к определению концентрации фосфата, высвобождаемого ГТФ, к трансформации ГДФ.

pH-зонды

Протонирование основных центров в системах, включающих хромофор и люминесцентный металлоцентр, открывает путь для датчиков pH. Некоторые первоначально предложенные системы были основаны на производных пиридина, но они не были стабильны в воде. Были предложены более надежные сенсоры, в которых ядро ​​представляет собой замещенный макроцикл, обычно несущий фосфинатные , карбоксилатные или четыре амидные координационные группы. Было замечено, что эмиссия люминесцентного зонда лантанидов увеличивается примерно в шесть раз при уменьшении pH раствора с шести до двух.

Датчик перекиси водорода

Перекись водорода можно обнаружить с высокой чувствительностью по люминесценции лантаноидных зондов, однако только при относительно высоких значениях pH. Аналитическая процедура на основе лантаноидов была предложена в 2002 году на основании открытия, что комплекс европия с различными тетрациклинами связывает перекись водорода, образуя люминесцентный комплекс.

Оценка размера молекул и расстояний между атомами

FRET в зондах на основе лантаноидов — это широко используемый метод измерения расстояния между двумя точками, разделенными примерно 15–100 ангстремами. Измерения можно проводить в физиологических условиях in vitro с использованием генетически закодированных красителей, а часто и in vivo. Этот метод основан на дистанционно-зависимой передаче энергии от донорного флуорофора к акцепторному красителю. Лантанидные зонды использовались для изучения взаимодействий ДНК-белок (с использованием хелатного комплекса тербия ) для измерения расстояний в комплексах ДНК, изогнутых белком CAP.

Конформация белка

Лантаноидные зонды использовались для обнаружения конформационных изменений в белках. Недавно шейкер калиевого ионного канала , С помощью этого метода был измерен потенциалзависимый канал, участвующий в передаче нервных импульсов. Некоторые ученые также использовали резонансный перенос энергии люминесценции (LRET) на основе лантаноидов, который очень похож на FRET, для изучения конформационных изменений РНК-полимеразы при связывании с ДНК и инициации транскрипции у прокариот. LRET также использовался для изучения взаимодействия белков дистрофина и актина в мышечных клетках. Дистрофин присутствует во внутренней мембране мышечных клеток и, как полагают, стабилизирует мышечные волокна, связываясь с актиновыми нитями. Использовали специально меченный дистрофин с меченными Tb моноклональными антителами.

Вирусология

Традиционные методы диагностики вирусов заменяются чувствительными иммуноанализами с лантанидами. Метод флуоресценции с временным разрешением в целом применим, и его эффективность также была проверена при анализе вирусных антигенов в клинических образцах.

Медицинская визуализация

Основная статья: контрастное вещество для МРТ

Было предложено несколько систем, которые сочетают возможности МРТ с зондами на основе лантаноидов в двойных анализах. Люминесцентный зонд может, например, служить для локализации контрастного вещества для МРТ. Это помогло визуализировать доставку нуклеиновых кислот в культивируемые клетки. Лантаниды используются не из-за их флуоресценции, а из-за их магнитных свойств.

Биология – Взаимодействие рецепторов и лигандов

Лантанидные зонды обладают уникальными свойствами флуоресценции, включая длительное время жизни флуоресценции, большой стоксов сдвиг и узкий пик эмиссии. Эти свойства очень полезны для разработки аналитических зондов для взаимодействия рецептор-лиганд. Многие исследования флуоресценции на основе лантаноидов были разработаны для GPCR , включая CXCR1 , пептидный рецептор 2 инсулиноподобного семейства, протеазо-активируемый рецептор 2 , β2-адренергический рецептор и рецептор C3a .

Инструментарий

, излучаемые Фотоны возбужденными лантанидами, обнаруживаются высокочувствительными устройствами и методами, такими как однофотонное обнаружение. Если время жизни возбужденного излучающего уровня достаточно велико, то для улучшения отношения сигнал/шум можно использовать обнаружение с временным разрешением (TRD). Аппаратура, используемая для проведения LRET, относительно проста, хотя и немного сложнее, чем обычные флуориметры. Общие требования — это импульсный источник УФ-возбуждения и детектирование с временным разрешением.

Источники света, излучающие кратковременные импульсы, можно разделить на следующие категории:

• Флэш-лампы
• с механическим или электронным прерыванием Газоразрядные лампы
• Искровые разрядники
• Импульсные лазеры

Наиболее важными факторами при выборе импульсного источника света являются продолжительность и интенсивность света. Импульсные лазеры в диапазоне от 300 до 500 нм теперь заменили искровые конденсаторы во флуоресцентной спектроскопии. Используются четыре основных типа импульсных лазеров: лазеры с импульсным возбуждением, лазеры с G-переключением, лазеры с синхронизацией мод и лазеры со сбросом резонатора. Импульсные азотные лазеры (337 нм) часто используются в качестве источника возбуждения во флуорометрии с временным разрешением.

Во флуорометрии с временным разрешением быстрый фотоумножитель является единственным практичным детектором одиночных фотонов. Хорошее разрешение одиночных фотонов также является преимуществом при подсчете фотонов от флуоресцентных зондов с длинным распадом, таких как хелаты лантаноидов.

Сегодня на рынке доступны следующие коммерческие приборы: Perkin-Elmer микрофильтр-флуорометр LS-2, люминесцентный спектрометр Perkin-Elmer, модель LS 5, и флуорометр с временным разрешением LKB-Wallac , модель 1230.

Лиганды

лантаноидных зондов Лиганды должны соответствовать нескольким химическим требованиям, чтобы зонды работали правильно. Этими качествами являются: растворимость в воде, высокая термодинамическая стабильность при физиологических значениях pH , кинетическая инертность и поглощение при длине волны выше 330 нм для минимизации разрушения живых биологических материалов.

Хелаты, изученные и используемые на сегодняшний день, можно разделить на следующие группы:

1. Трис-хелаты (три лиганда)
2. Хелаты тетракиса (четыре лиганда)
3. Смешаннолигандные комплексы
4. Комплексы с нейтральными донорами
5. Другие, такие как: фталатные , пикратные и салицилатные комплексы.

Эффективность передачи энергии от лиганда к иону определяется связью лиганд-металл. Перенос энергии более эффективен при ковалентной связи , чем при ионной связи. Электронодонорные заместители в лиганде, такие как гидрокси , метокси и метильные группы, увеличивают флуоресценцию. Противоположный эффект наблюдается при присоединении электроноакцепторной группы (например, нитро). Кроме того, интенсивность флуоресценции увеличивается за счет замещения лиганда фтором. Передача энергии иону металла увеличивается, поскольку электроотрицательность фторированной группы придает связи европий-кислород более ковалентную природу. что усиление сопряжения ароматическими заместителями за счет замены фенила нафтильными группами приводит к усилению флуоресценции. Показано,

См. также

• Спектроскопия
• Флюорометрия
• Ферменты
• Биосенсор
• Контрастное вещество для МРТ