в DARP
DARPins ( аббревиатура от «созданные белки с анкириновыми повторами ») представляют собой генно-инженерные -миметики антител белки , обычно демонстрирующие высокоспецифическое и высокоаффинное связывание с целевыми белками . Они происходят из природных белков-повторов анкирина , одного из наиболее распространенных классов связывающих белков в природе, которые отвечают за разнообразные функции, такие как передача сигналов в клетке, регуляция и структурная целостность клетки. DARPins состоят как минимум из трех повторяющихся мотивов или модулей, из которых большинство N- и большинство C-концевых модулей называются «кэпами», поскольку они защищают гидрофобное ядро белка. Количество внутренних модулей обозначается цифрами (например, N1C, N2C, N3C, ...), а колпачки обозначаются буквами «N» или «C» соответственно. Молекулярная масса , например, 14 или 18 кДа ( килодальтоны ) для четырех-(N2C) или пяти-(N3C) повторов DARPins довольно мала для биологического препарата (около 10% размера IgG ).
DARPins представляют собой новый класс мощных, специфических и универсальных низкобелковых терапевтических средств и используются в качестве исследовательских инструментов в различных исследовательских, диагностических и терапевтических целях. [ 1 ] Molecular Partners AG , биофармацевтическая компания клинической стадии, владеющая несколькими молекулами DARPin в клинической и доклинической разработке, в настоящее время занимается разработкой терапевтических DARPin как посредством собственных разработок, так и параллельно с партнерами. Athebio AG продолжает совершенствовать платформу DARPin, используя модель партнерства . [ 2 ]
Кроме того, DARPins можно использовать в качестве шаперонов кристаллизации для растворимых и мембранных белков, включая рецепторы, связанные с G-белками (GPCR), либо в качестве партнеров по связыванию, либо в качестве жестких слияний с целевым белком, концепция теперь расширяется до определения структуры с помощью криоЭМ. [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ]
Происхождение, структура и поколение
[ редактировать ]
Платформа DARPin была открыта и разработана в лаборатории Андреаса Плюктуна в Цюрихском университете , Швейцария, во время изучения техники и библиотек рекомбинантных антител. [ 7 ] DARPins получены из встречающихся в природе белков анкиринов, класса белков, которые в природе опосредуют белок-белковые взаимодействия с высоким сродством .
Библиотеки DARPin были разработаны путем выравнивания последовательностей нескольких тысяч природных анкириновых повторяющихся мотивов (около 33 аминокислот каждый) в сочетании с методами структурного проектирования и рекомбинантной ДНК . [ 7 ] Эти белки состоят из повторяющихся структурных единиц, которые образуют стабильный белковый домен с большой потенциальной поверхностью взаимодействия с мишенью. Обычно DARPins содержат четыре или пять повторов, из которых первый (N-кэпирующий повтор) и последний (C-кэпирующий повтор) служат для защиты гидрофобного белкового ядра от водной среды. DARPins соответствуют среднему размеру природных белковых доменов с анкириновыми повторами. Белки с менее чем тремя повторами (т.е. кэп-повторами и одним внутренним повтором) не образуют достаточно стабильной третичной структуры. [ 8 ] Молекулярная масса дарпина зависит от общего количества повторов, как показано в следующей таблице:
| Повторы | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | ... |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Приблизительная масса (кДа) | 10 | 14 | 18 | 22 | 26 | ... |
Библиотеки DARPins со рандомизированными остатками потенциального взаимодействия с мишенями, с разнообразием более 10 12 варианты были созданы на уровне ДНК. Из этих библиотек биохимики могут выбрать дарпины для связывания выбранной мишени с пикомолярным сродством , а специфичность может быть выбрана с помощью рибосомного дисплея. [ 9 ] или фаговый дисплей [ 10 ] использование сигнальных последовательностей, обеспечивающих котрансляционную секрецию. [ 11 ] DARPins могут действовать как рецепторов агонисты , антагонисты , обратные агонисты , ингибиторы ферментов или простые связыватели белков-мишеней. [ 1 ]
Свойства и потенциальные преимущества DARPins
[ редактировать ]DARPins экспрессируются в цитоплазме Escherichia coli на высоких уровнях (более 10 г/л при ферментации, 1 г/л во встряхиваемой колбе) в растворимой форме. [ 12 ] Белки обладают высокой термической и термодинамической стабильностью ( средняя точка денатурации : обычно равновесное разворачивание : ∆G > 9,5 ккал/моль ), которая увеличивается с увеличением числа повторов. [ 7 ] [ 13 ] [ 14 ] Дарпины стабильны в сыворотке крови человека и могут быть сконструированы так, чтобы не содержать Т-клеток эпитопов .
Благодаря высокой специфичности, стабильности, активности и сродству, а также гибкой архитектуре, DARPins имеют режим связывания с жестким телом . [ 1 ] [ 9 ] Мультиспецифические или мультивалентные конструкции, полученные путем слияния генов, позволяют предположить, что слитые DARPins обладают такими же связывающими свойствами, что и однодоменные DARPins. [ 1 ] Отсутствие цистеинов в каркасе позволяет создавать сайт-специфические цистеины, обеспечивая сайт-направленное связывание химических веществ с молекулой. С той же целью можно вводить неприродные аминокислоты. [ 15 ]
Потенциально дарпины могут обеспечить клиническую пользу, преодолевая ограничения традиционных терапевтических подходов, которые обычно нацелены на один путь заболевания и, таким образом, могут поставить под угрозу эффективность. Во многих случаях сложность заболевания является результатом нарушения регуляции нескольких путей. Технологию DARPin можно использовать для быстрого создания тысяч различных «мульти-DARPin», где связывающие домены соединены (т.е. линкерами), тем самым позволяя воздействовать на несколько путей заболевания. DARPin и мульти-DARPin также могут быть слиты с элементами, не относящимися к DARPin, такими как токсин, [ 16 ] для создания таргетных терапевтических средств, а их производству способствует устойчивость дарпинов к агрегации. Разнообразие форматов и надежность мульти-DARPins облегчают эмпирический подход (например, посредством скрининга на основе результатов) для эффективной идентификации DARPins с потенциальной активностью в отношении конкретных путей заболевания.
Потенциальные преимущества дарпинов во многом обусловлены их структурными и биофизическими характеристиками. Считается, что их небольшой размер (14–18 кДа) обеспечивает повышенное проникновение в ткани, а их высокая активность (<5–100 пМ) делает дарпины активными при низких концентрациях. [ 17 ] Дарпины растворимы при концентрации >100 г/л, а их высокая стабильность и растворимость считаются желательными свойствами для лекарственных соединений. DARPins можно производить быстро и экономически эффективно (т.е. из E.coli ). Их фармакокинетические (ФК) свойства можно регулировать путем слияния с молекулами, увеличивающими период полувыведения, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ), или с дарпинами, связывающимися с сывороточным альбумином человека. Благодаря своим благоприятным биофизическим свойствам, [ 1 ] DARPins считаются легко разрабатываемыми с использованием стандартных процессов и потенциально демонстрируют устойчивое классовое поведение.
Клинические разработки и применения
[ редактировать ]DARPins использовались в качестве исследовательских инструментов. [ 1 ] в качестве диагностических средств [ 17 ] и в качестве терапевтических средств. [ 18 ] [ 19 ] [ 20 ] [ 21 ] MP0112, первый кандидат на дарпин в клинике, является ингибитором фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и вступил в клинические испытания для лечения влажной возрастной макулярной дегенерации (влажной ВМД, также известной как неоваскулярная возрастная макулярная дегенерация). [ 16 ] и диабетический макулярный отек [ 22 ] в начале 2010 года.
В настоящее время MP0112 исследуется в трех различных клинических испытаниях. Первые два исследования представляют собой исследования безопасности и эффективности абиципара у пациентов с влажной ВМД с целью установления сопоставимости между японскими и неяпонскими пациентами. [ 18 ] [ 20 ] Третье исследование направлено на проверку безопасности и эффективности абиципара у пациентов с ДМО. [ 19 ]
В июле 2014 года компания Molecular Partners инициировала первое исследование на людях для изучения безопасности, переносимости и уровня в крови MP0250, второго кандидата на дарпин, у пациентов с раком. [ 21 ]
Компания Molecular Partners AG имеет несколько дополнительных дарпинов, находящихся на доклинической разработке, с потенциальными показаниями для различных областей заболеваний, включая офтальмологию , онкологию , иммуноонкологию и иммунологию .
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б с д и ж Плюктун А (2015). «Разработанные белки с анкириновыми повторами (DARPins): связывающие белки для исследований, диагностики и терапии» . Анну. Преподобный Фармакол. Токсикол . 55 (1): 489–511. doi : 10.1146/annurev-pharmtox-010611-134654 . ПМИД 25562645 .
- ^ www.athebio.com
- ^ Миттл П.Р., Эрнст П., Плюктун А. (февраль 2020 г.). «Выяснение структуры с помощью шаперонов с помощью DARPins». Современное мнение в области структурной биологии . 60 : 93–100. дои : 10.1016/j.sbi.2019.12.009 . ПМИД 31918361 . S2CID 210133068 .
- ^ Делуиджи М., Клипп А., Кленк С., Мерклингер Л., Эберле С.А., Морштейн Л., Хейне П., Миттл П.Р., Эрнст П., Каменецка Т.М., Хе Ю., Вакка С., Эглофф П., Онеггер А., Плюктхун А. (январь 2021 г.). «Комплексы рецептора нейротензина 1 с низкомолекулярными лигандами обнаруживают структурные детерминанты полного, частичного и обратного агонизма» . Достижения науки . 7 (5): eabe5504. Бибкод : 2021SciA....7.5504D . дои : 10.1126/sciadv.abe5504 . ПМК 7840143 . ПМИД 33571132 .
- ^ Делуиджи М, Морштейн Л, Шустер М, Кленк С, Мерклингер Л, Кридж РР, де Чжан Л.А., Клипп А, Вакка С, Вайд ТМ, Миттл П.Р., Эглофф П., Эберле С.А., Зербе О, Чалмерс Д.К., Скотт DJ, Плюктун А (январь 2022 г.). «Кристаллическая структура α1B-адренергического рецептора раскрывает молекулярные детерминанты селективного распознавания лигандов» . Природные коммуникации . 13 (1): 382. Бибкод : 2022NatCo..13..382D . дои : 10.1038/s41467-021-27911-3 . ПМЦ 8770593 . ПМИД 35046410 .
- ^ Кастельс-Граэльс, Роджер; Мидор, Кайл; Арбинг, Марк А.; Савая, Майкл Р.; Ну и дела, Морган; Кашио, Дуилио; Глив, Эмма; Дебрецени, Юдит Э.; Брид, Джейсон; Леопольд, Каролина; Патель, Анкур; Джахагирдар, Душьянт; Лайонс, Бронвин; Субраманиам, Шрирам; Йейтс, Тодд (12 сентября 2023 г.). «Крио-ЭМ определение структуры небольших терапевтических белковых мишеней с разрешением 3 Å с использованием жесткого каркаса для визуализации» . Труды Национальной академии наук . 120 (37): e2305494120. дои : 10.1073/pnas.2305494120 . ISSN 0027-8424 . ПМК 10500258 . PMID 37669364 .
- ^ Jump up to: а б с Бинц Х.К., Штумп М.Т., Форрер П., Амстутц П., Плюктун А. (сентябрь 2003 г.). «Разработка повторяющихся белков: хорошо экспрессируемые, растворимые и стабильные белки из комбинаторных библиотек консенсусных белков-анкириновых повторов». Журнал молекулярной биологии . 332 (2): 489–503. CiteSeerX 10.1.1.627.317 . дои : 10.1016/S0022-2836(03)00896-9 . ПМИД 12948497 .
- ^ Мосави, ЛК; Минор, DL; Пэн, З.-Ю. (2002). «Структурные детерминанты повторного мотива анкирина, полученные на основе консенсуса» . Труды Национальной академии наук . 99 (25): 16029–16034. Бибкод : 2002PNAS...9916029M . дои : 10.1073/pnas.252537899 . ПМК 138559 . ПМИД 12461176 .
- ^ Jump up to: а б Бинц Х.К., Амштуц П., Коль А., Штумп М.Т., Бриан С., Форрер П., Грюттер М.Г., Плюктхун А. (май 2004 г.). «Высокоаффинные связыватели, выбранные из разработанных библиотек белков с повторами анкирина». Природная биотехнология . 22 (5): 575–582. дои : 10.1038/nbt962 . ПМИД 15097997 . S2CID 1191035 .
- ^ Штайнер Д., Форрер П., Плюктун А. (2008). «Эффективный отбор дарпинов с субнаномолярным сродством с использованием SRP-фагового дисплея» (PDF) . Мол. Биол . 382 (5): 1211–1227. дои : 10.1016/j.jmb.2008.07.085 . ПМИД 18706916 .
- ^ Штайнер Д., Форрер П., Штумп М.Т., Плюктун А. (май 2006 г.). «Сигнальные последовательности, управляющие котрансляционной транслокацией, расширяют диапазон белков, поддающихся фаговому дисплею». Природная биотехнология . 24 (7): 823–831. дои : 10.1038/nbt1218 . ПМИД 16823375 . S2CID 869587 .
- ^ Данные в файле. Молекуляр Партнерс АГ.
- ^ Коль А., Бинц Х.К., Форрер П., Штумп М.Т., Плюктхун А., Грюттер М.Г. (май 2003 г.). «Создан для стабильности: кристаллическая структура консенсусного белка с анкириновыми повторами» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 100 (4): 1700–1775. Бибкод : 2003PNAS..100.1700K . дои : 10.1073/pnas.0337680100 . ПМК 149896 . ПМИД 12566564 .
- ^ Ветцель С.К., Сеттанни Г., Кениг М., Бинц Х.К., Плюктун А. (февраль 2008 г.). «Механизм сворачивания и разворачивания высокостабильных белков анкириновых повторов с полным консенсусом» (PDF) . Журнал молекулярной биологии . 376 (1): 241–257. дои : 10.1016/j.jmb.2007.11.046 . ПМИД 18164721 .
- ^ Саймон М., Фрей Р., Зангемайстер-Виттке У., Плюктун А. (2013). «ортогональная сборка разработанного конъюгата белка-цитотоксина с повторами анкирина с кликабельным модулем сывороточного альбумина для продления периода полураспада». Биоконъюгат, хим . 24 (2): 1955–1966. дои : 10.1021/bc200591x . ПМИД 22188139 .
- ^ Jump up to: а б Мартин-Киллиас П., Стефан Н., Ротшильд С., Плюктун А., Зангемайстер-Виттке У (2011). «Новый гибридный токсин, полученный из EpCAM-специфического белка с повторами анкирина, обладает мощной противоопухолевой активностью» . Клин. Рак Рез . 17 (1): 100–110. дои : 10.1158/1078-0432.CCR-10-1303 . ПМИД 21075824 .
- ^ Jump up to: а б Занд С, Каве М, Стампп МТ, де Паскуале С, Тамаскович Р, Надь-Давидеску Г, Драйер Б, Шибли Р, Бинц ХК, Вайбель Р, Плюктхун А (2010). «Эффективное нацеливание на опухоль с помощью белков с анкириновыми повторами, разработанными с высоким сродством: влияние сродства и размера молекул» . Рак Рез . 70 (4): 1595–1605. дои : 10.1158/0008-5472.CAN-09-2724 . ПМИД 20124480 .
- ^ Jump up to: а б Номер клинического исследования NCT02181517 «Исследование абиципара пегола у пациентов с неоваскулярной возрастной макулярной дегенерацией» на сайте Clinicaltrials.gov .
- ^ Jump up to: а б Номер клинического исследования NCT02186119 «Исследование абиципара пегола у пациентов с диабетическим макулярным отеком» на сайте Clinicaltrials.gov .
- ^ Jump up to: а б Номер клинического исследования NCT02181504 «Исследование абиципара пегола у японских пациентов с неоваскулярной возрастной макулярной дегенерацией» на сайте Clinicaltrials.gov .
- ^ Jump up to: а б Номер клинического испытания NCT02194426 «Первое исследование на людях по изучению безопасности, переносимости и уровня в крови тестируемого препарата MP0250 у онкологических больных» на сайте Clinicaltrials.gov .
- ^ Номер клинического исследования NCT01042678 «Исследование интравитреальной инъекции MP0112 у пациентов с диабетическим отеком макулы» на сайте ClinicalTrials.gov.
Сконструированные моноклональные антитела и миметики антител | ||
|---|---|---|
| Цельное антитело |  | |
| Потрясающий фрагмент | ||
| Переменный фрагмент | ||
| Меньшие единицы | ||
| Внутриклеточный | ||
| Миметики антител | ||