наноЗАЖИМ

области иммунологии В медицинской nanoCLAMP ( CL ostridal Antibody Proteins Mimetic 15 кДа , аффинные реагенты ) представляют собой рекомбинантные белки- миметики антител массой отобранные для прочного, селективного и мягко обратимого связывания с молекулами-мишенями. ^{[ 1 ]} Каркас nanoCLAMP основан на IgG-подобном термостабильном углеводсвязывающем модуле семейства 32 (CBM32) из гиалуронидазы Clostridium perfringens (Му-токсин). Форма nanoCLAMP приближается к цилиндру длиной примерно 4 нм и диаметром 2,5 нм, примерно такого же размера, как нанотело ( PDB : 2W1Q ). nanoCLAMPs к конкретным мишеням генерируются путем изменения аминокислотных последовательностей, а иногда и длины трех открытых в растворителе соседних петель, которые соединяют бета-нити, образующие бета-сэндвич-складку, придавая аффинность связывания и специфичность к мишени. ^{[ 1 ]}

Характеристики

nanoCLAMP являются первыми миметиками антител, которые, как описано, реагируют на полиол . ^{[ 2 ]} это означает, что они высвобождают свои цели при воздействии нехаотропной соли и полиола , такого как пропиленгликоль . ^{[ 1 ]}^{[ 3 ]} Было показано, что это свойство полезно для очистки функциональных белков и белковых комплексов путем аффинной очистки . nanoCLAMPs легко производятся в цитоплазме E. coli с типичным выходом в диапазоне от 50 до 300 мг/л культуры. Поскольку nanoCLAMP лишены цистеинов , сконструированный C-концевой цистеин можно использовать для направленной конъюгации таких веществ, как флуорофоры или смолы, с использованием тиоловой химии.

Разработка и приложения

nanoCLAMP были разработаны в лабораториях Nectagen. nanoCLAMP Были созданы библиотеки фагового дисплея , которые содержали вариации 16 поверхностных аминокислот в трех петлях с функциональным разнообразием примерно 10 ⁹ варианты. Эти библиотеки были проверены на наличие связующих веществ с белками-мишенями и пептидами , что обычно дает от 1 до 30 уникальных связующих веществ с мишенью. ^{[ 1 ]}

Очищенные nanoCLAMP, содержащие один С-концевой цистеин, можно легко конъюгировать с галогенацетил-активированной агарозной смолой в нативных или денатурирующих условиях, а образующаяся в результате тиоэфирная связь делает смолы устойчивыми к выщелачиванию. Мишени можно очистить до очевидной гомогенности за один этап. Полиол - чувствительный ^{[ 2 ]} природа смол позволяет элюировать мишени 0,75 М сульфатом аммония и 40% пропиленгликолем при pH 7,9, условия, которые, как было показано, сохраняют нативную структуру и белковые комплексы . ^{[ 1 ]}^{[ 3 ]}^{[ 4 ]}^{[ 5 ]}^{[ 6 ]}

Были произведены nanoCLAMP, нацеленные на зеленый флуоресцентный белок (GFP) , mCherry , SUMO (SMT3) , NusA, авидин , NeutrAvidin , мальтозосвязывающий белок (MBP) , тиоредоксин 1, бета-галактозидазу , SlyD и другие. Типичная связывающая способность смол находится в диапазоне от 1 до 4 мг/мл смолы. Поскольку nanoCLAMP легко восстанавливаются, смолы nanoCLAMP можно регенерировать несколько раз, используя хлорид гуанидиния для очистки смолы. ^{[ 1 ]}

Ссылки

^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж Судерман Р.Дж., Райс Д.А., Гибсон С.Д., Стрик Э.Дж., Чао Д.М. (17 апреля 2017 г.). «Разработка миметиков антител, чувствительных к полиолам, для одностадийной очистки белков» . Экспрессия и очистка белков . 134 : 114–124. дои : 10.1016/j.pep.2017.04.008 . ПМИД 28428153 .
^ Jump up to: ^а ^б Берджесс Р.Р., Уотсон Дж.Д. (июнь 2017 г.). «Щадящая аффинная хроматография, имитирующая антитела, с чувствительными к полиолам nanoCLAMP». Экспрессия и очистка белков . 134 : 154–155. дои : 10.1016/j.pep.2017.06.002 . ПМИД 28633910 .
^ Jump up to: ^а ^б Томпсон Н.Е., Аронсон Д.Б., Берджесс Р.Р. (1990). «Очистка эукариотической РНК-полимеразы II с помощью иммуноаффинной хроматографии. Элюция активного фермента с помощью белковых стабилизирующих агентов из полиол-чувствительного моноклонального антитела» . J Биол Хим . 265 (12): 7069–7077. дои : 10.1016/S0021-9258(19)39260-9 . ПМИД 2324114 .
^ Томпсон Н.Э., Фоли К.М., Сталдер Э.С., Берджесс Р.Р. (2009). «Глава 28 Идентификация, производство и использование полиол-чувствительных моноклональных антител для иммуноаффинной хроматографии». Руководство по очистке белков, 2-е издание . Методы Энзимол. Том. 463. стр. 475–494. дои : 10.1016/S0076-6879(09)63028-7 . ISBN 978-0-12-374536-1 . ПМИД 19892188 .
^ Томпсон Н.Е., Хагер Д.А., Берджесс Р.Р. (4 августа 1992 г.). «Выделение и характеристика полиол-чувствительного моноклонального антитела, пригодного для щадящей очистки РНК-полимеразы Escherichia coli». Биохимия . 31 (30): 7003–7008. дои : 10.1021/bi00145a019 . ПМИД 1637835 .
^ Томпсон Н.Е., Дженсен Д.Б., Ламберски Дж.А., Берджесс Р.Р. (2006). «Очистка белковых комплексов с помощью иммуноаффинной хроматографии: применение к транскрипционной машине». Женет Энг (Нью-Йорк) . Генная инженерия: принципы и методы. 27 : 81–100. дои : 10.1007/0-387-25856-6_6 . ISBN 0-387-25855-8 . ПМИД 16382873 .

Внешние ссылки

Nectagen, Inc. , разработчик

[pmid28428153-1] Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж Судерман Р.Дж., Райс Д.А., Гибсон С.Д., Стрик Э.Дж., Чао Д.М. (17 апреля 2017 г.). «Разработка миметиков антител, чувствительных к полиолам, для одностадийной очистки белков» . Экспрессия и очистка белков . 134 : 114–124. дои : 10.1016/j.pep.2017.04.008 . ПМИД 28428153 .

[BurgessWatson-2] Jump up to: ^а ^б Берджесс Р.Р., Уотсон Дж.Д. (июнь 2017 г.). «Щадящая аффинная хроматография, имитирующая антитела, с чувствительными к полиолам nanoCLAMP». Экспрессия и очистка белков . 134 : 154–155. дои : 10.1016/j.pep.2017.06.002 . ПМИД 28633910 .

[pmid2324114-3] Jump up to: ^а ^б Томпсон Н.Е., Аронсон Д.Б., Берджесс Р.Р. (1990). «Очистка эукариотической РНК-полимеразы II с помощью иммуноаффинной хроматографии. Элюция активного фермента с помощью белковых стабилизирующих агентов из полиол-чувствительного моноклонального антитела» . J Биол Хим . 265 (12): 7069–7077. дои : 10.1016/S0021-9258(19)39260-9 . ПМИД 2324114 .

[pmid19892188-4] Томпсон Н.Э., Фоли К.М., Сталдер Э.С., Берджесс Р.Р. (2009). «Глава 28 Идентификация, производство и использование полиол-чувствительных моноклональных антител для иммуноаффинной хроматографии». Руководство по очистке белков, 2-е издание . Методы Энзимол. Том. 463. стр. 475–494. дои : 10.1016/S0076-6879(09)63028-7 . ISBN 978-0-12-374536-1 . ПМИД 19892188 .

[pmid1637835-5] Томпсон Н.Е., Хагер Д.А., Берджесс Р.Р. (4 августа 1992 г.). «Выделение и характеристика полиол-чувствительного моноклонального антитела, пригодного для щадящей очистки РНК-полимеразы Escherichia coli». Биохимия . 31 (30): 7003–7008. дои : 10.1021/bi00145a019 . ПМИД 1637835 .

[pmid16382873-6] Томпсон Н.Е., Дженсен Д.Б., Ламберски Дж.А., Берджесс Р.Р. (2006). «Очистка белковых комплексов с помощью иммуноаффинной хроматографии: применение к транскрипционной машине». Женет Энг (Нью-Йорк) . Генная инженерия: принципы и методы. 27 : 81–100. дои : 10.1007/0-387-25856-6_6 . ISBN 0-387-25855-8 . ПМИД 16382873 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

v т и Сконструированные моноклональные антитела и миметики антител
Цельное антитело	биспецифический Трехфункциональное антитело
Потрясающий фрагмент	F(ab') ₂ фрагмент / Fab' фрагмент биспецифический Химически связанный Fab
Переменный фрагмент	Одноцепочечный вариабельный фрагмент/di-scFv/tri-scFv Однодоменное антитело Малый модульный иммунофармацевтический биспецифический Активатор Т-клеток
Меньшие единицы	Микроантитело
Внутриклеточный	Внутритела
Миметики антител	Молекула аффитела Аффилин Аффимер Аффитин Альфатело Антикалин Авимер в DARP Пептид домена Кунитца Монокело наноЗАЖИМ