L-Фото-метионин
 | Эту статью , возможно, придется переписать, Википедии чтобы она соответствовала стандартам качества . ( март 2022 г. ) |
 | |
| Имена | |
|---|---|
| Название ИЮПАК ( S )-2-амино-4-(3-метил-3H- диазирин -3-ил)бутановая кислота | |
| Другие имена L -2-амино-5,5-азигексановая кислота | |
| Идентификаторы | |
3D model ( JSmol ) | |
| ХимическийПаук | |
ПабХим CID | |
| Характеристики | |
| С 6 Н 11 Н 3 О 2 | |
| Молярная масса | 157.173 g·mol −1 |
| 6 мг/мл | |
| Опасности | |
| СГС Маркировка : | |
| Х315 , Х319 , Х335 | |
| П261 , П305 , П338 , П351 | |
Если не указано иное, данные приведены для материалов в стандартном состоянии (при 25 °C [77 °F], 100 кПа). | |
L -Фото-метионин представляет собой фотореактивное аминокислотное производное L -метионина , которое было синтетически получено в 2005 году. [1] Белки представляют собой длинные полимерные цепи аминокислот ; которые могут иметь различную структуру и размер. Белки могут взаимодействовать друг с другом ( белково-белковые взаимодействия или PPI) и посредством этих взаимодействий влияют на клеточные взаимодействия и пути. [1] Такие взаимодействия; слияние вирусов и передача сигналов факторов роста выглядели многообещающими для создания противовирусных или противораковых препаратов, поэтому необходимо провести исследование, чтобы понять взаимодействие. [1] Благодаря этому исследования начали доказывать, что белки функционируют в супрамолекулярных комплексах, а не в изолированных объектах. [1] Итак, ученые Моника Суханек, Анна Радзиковски и Кристоф Тиль исследовали, что прямой способ лучше изучить эти взаимодействия в естественной среде — это создать новый способ фотосшивки белков; что привело к синтезу L -фотометионина и в том же исследовании L -фотолейцина . [1]
Синтез
[ редактировать ]Рацемический фотометионин синтезируется из 4,4'-азипентаналя путем синтеза аминокислот Стрекера . [1] отделяют L- энантиомер ферментативным разделением ацетамида.
Фотоактивация метионина
[ редактировать ]Как уже упоминалось ранее, L-фотометионин можно использовать для изучения белок-белковых взаимодействий с белками в их нативной среде. Насколько это возможно, так это то, как аминокислота ведет себя под воздействием ультрафиолета. [1] Чтобы доказать, что сначала синтез работает, радиоактивный углерод ( 14 C) добавленный в ходе собственного синтеза для проведения соответствующих спектроскопических методов.
Активация фотометионина
[ редактировать ]Поскольку предыдущий синтез сработал, фотометионин является фотореактивным из-за диазиринового кольца. Как только это кольцо подвергается воздействию ультрафиолетового света, азот уходит в виде газообразного азота (N 2 ) и образует высокореактивный промежуточный карбен . [1] Фотоактивация аминокислот обеспечивает возможность фотосшивки белков. [1] Этот тип сшивки имеет три основных преимущества; существует большая специфичность этого перекрестного связывания из-за короткоживущих промежуточных продуктов и того, что эта аминокислота является функциональной, и что наиболее важно; не токсичен (то есть он не должен резко нарушать функцию или структуру белка). [1] Исследования показали, что эта активация является этапом, ограничивающим скорость; а не перекрестная связь. [2]
Новый эффективный синтез и использование
[ редактировать ]Ученые Микель Вила-Перелло, Мэтью Р. Пратт, Фрей Тулин и Том В. Мьюир хотели создать эффективный синтез, поскольку оригинал требовал ферментативного раствора и имел низкий выход. [3] Итак, они начали с L-глутаминовой кислоты с защитными группами как на карбоновой кислоте (трет-бутил), так и на Boc на амине. Этот синтез не будет детализирован, как классический, но ниже представлен полный синтез. Чтобы найти фактические шаги, обратитесь к ссылке. [3]
Итак, когда они синтезировали L-фотометионин, выход составил 32%, что намного выше (в шесть раз) исходного синтеза. [3] аминокислотного сшивающего агента и посттрансляционной модификации Затем его использовали (с защитной группой Fmoc на амине), после чего этот продукт подвергся дополнительным синтетическим стадиям для изучения возможности введения (PTM) в один и тот же участок белка специально для захвата ковалентное взаимодействие аминокислоты зависит от PTM. [3] PTM регулируют белок-белковые взаимодействия, которые имеют временные и субстехиометрические характеристики; что затрудняет их обнаружение стандартными методами. [3] Итак, чтобы проверить, сработает ли это, был использован домен MH2 Smad2 , поскольку известно, что этот сигнальный белок образует стабильные гомо-тримеры, когда они вступают в контакт с рецептором фосфорилированными остатками серина . [3] Лигирование экспрессионного белка (известное как EPL) использовали для синтеза с образованием Smad2-MH2-CSpSM-photo-Met (1). Продукт изучали с помощью перекрестного линкера (photo-Met) против контрольного белка: HA-MH2-CSpSmpS (в нем отсутствует фотометионин, 2) с использованием SDS-PAGE и вестерн-блоттинга с использованием антитела против HA. [3] 1 были созданы два основных сшитых вида, молекулярная масса которых соответствует димеру и тримеру Smad2-SH2. Без этого сшивающего агента димер и тример практически не обнаруживались в необлученном 1, а также в 2 до и после УФ-облучения. [3] Доказательство того, что l-фотометионин можно использовать с EPL и для определения временного взаимодействия MH2-MH2, которое зависит от PTM. [3]
Использование фото-метионина
[ редактировать ]Белковые взаимодействия
[ редактировать ]Комплекс и функция мембранного белка в гомеостазе холестерина
[ редактировать ]Как упоминалось ранее, ученые Моника Суханек, Анна Радзиковски и Кристоф Тиль хотели изучить белок-белковое взаимодействие в их естественной среде. В частности, мембранные белки (в комплексе это SCAP , Insig-1 и SREBP ), которые регулируют гомеостаз холестерина, поэтому они хотели знать, какова их функция и структура комплекса. [1] Они обнаружили, что использование этой фотореактивной аминокислоты эффективно включалось в белок клетками млекопитающих, но не требовалось использовать модифицированные тРНК (транспортные РНК) или AARS (синтез аминоацил-тРНК), которые позволяли осуществлять специфическое перекрестное сшивание. нужный. [1] Это перекрестное связывание можно было определить с помощью вестерн-блоттинга , и они обнаружили прямое взаимодействие между Insig-1 и PGRMC1 ( прогестерон -связывающим мембранным белком). [1] Все четыре мембранных белка находятся в эндоплазматическом ретикулуме , и этот комплекс реагирует на низкий уровень холестерина. [1] Клетки ( COS7 ), которые имели HA ( меченный гемагглютинином PGRMC1) и Myc, меченный Insig-1, выращивали с фото-Met и без него. В присутствии фото-Met Insig-1 и SCAP сшивались с PGRMC1; в частности, сшитый Insig-1 имел сильную полосу. [1] Сшивку обнаруживали путем иммунопреципитации детергентных экстрактов с антителом к HA, затем осадитель тестировали на Insig-1 с использованием вестерн-блоттинга с антителом к Myc. [1] Идентичная полоса была обнаружена в порядке, обратном обнаружению; это означает, что антитело Myc было иммунопреципитировано, а затем последовал блоттинг с антителом HA. [1] Итак, метод доказал свою эффективность: фото-Met может сшивать белки, но физиологические последствия этого сшивания еще предстоит определить.
Использование белковых нанозондов для изучения белок-белковых взаимодействий методом масс-спектрометрии
[ редактировать ]Белок изучали с использованием белкового нанозонда (который обеспечивает перекрестное сшивание), который вводил фотометионин в белок (во время рекомбинантной экспрессии), что приводило к тому, что белок сохранял свою зарезервированную структуру, сохраняя при этом способность картировать свои взаимодействия. Модель использовалась как область контактной поверхности, участвующая в известном взаимодействии (гомодимеризации) между двумя молекулами белка 14-3-3ζ . Как только фотометионин введен и активирован с помощью УФ-света, он может сшиваться без специфичности (то есть без группы), и связи имеют нулевую длину. высокого разрешения Затем можно использовать масс-спектрометрию или МС (даже МС/МС) для определения сшитых остатков и радиуса реакции; позволяя исследователям охарактеризовать и исследовать гомодимеризацию белка. Использование МС высокого разрешения с фотометионином имеет свои преимущества, поскольку оно снова позволяет белку находиться в нативном состоянии, существуют разумные временные рамки при использовании небольших количеств белка. Также существует меньше ограничений на специфичность реакции и ограничений при использовании фотоактивного сшивающего агента (фотометионина) по сравнению с химическая сшивка . Этот метод комбинированной фотоинициируемой поперечной сшивки белкового нанозонда в тандеме с МС может быть полезен для характеристики образования не только гомодимеров , но и олигомеров и в теории; гетеромеры (такие как состав белково-белковой смеси и ее функциональность). [4]
Возможность изучения электрон-транспортной цепи цитохрома P450 с использованием фотоцитохрома b 5
[ редактировать ]Цитохром b 5 был синтезирован с фотометионином для картирования белок-белковых взаимодействий, а также для определения его структуры для изучения оксидазной системы млекопитающих со смешанными функциями (также известной как MFO). [5] Эта система расположена в мембране эндоплазматического ретикулума и состоит из цитохрома P450 , НАДФН : цитохрома P450 редуктазы и цитохрома b 5 вместе с НАДН : цитохром b 5 редуктазы . [ нужна ссылка ] Как только в комплекс цитохрома b 5 был включен фотометионин (это означает, что фотомет был заменен вместо метионина и теперь фотоцит b 5 ), фотоцит b 5 и цитохром P450 подвергались воздействию УФ-света, и продукты были способны изучаться с помощью SDS-Page ; этот метод показал три перекрестных связи. [ нужна ссылка ] Фотометионин оказался успешным в картировании фотоцита b 5, поскольку метод MALDI-TOF показал три олигомера (из химотриптических пептидов), которые состояли из фотоцита b 5 и цитохрома P450 в соотношении молекулярных масс 1: 1, 1. :2 и 2:1. [ нужна ссылка ] Что делает фотометионин таким полезным при изучении цитохрома P450 и цитохрома b 5 , так это то, что этот метод не только картирует межбелковые интерфейсы не только в областях, подвергающихся воздействию растворителя, но и в нативной среде; мембрана. [5] Типичный метод сшивки может работать только в областях, подверженных воздействию растворителя, что еще раз доказывает, что фотометионин полезен для картирования межбелковых взаимодействий с белком в их нативной среде. [5]
Структура белка
[ редактировать ]Анализ взаимодействия нидогена-1 с ламинином γ1
[ редактировать ]Ламинины — это неколлагеновые белки, обнаруженные в базальных мембранах и образующие сети посредством нековалентных самовзаимодействий. Нидогены (также известные как энтактины) представляют собой сульфатированные мономерные гликопротеины , которые повсеместно присутствуют в базальных мембранах высших организмов. Нидогены помогают в формировании фундамента. При наличии как ламининов, так и нидогенов оба взаимодействуют друг с другом, образуя в комплексе стехиометрическое соотношение 1:1. Чтобы изучить короткое плечо ламинина γ1, фотометионин вводили как в нидоген-1 , так и в короткое плечо ламинина γ1 LEb2-4, а также в короткое плечо ламинина γ1, чтобы посмотреть, сможет ли этот метод фотосшивки составить карту структуры. Перед сшивкой был проведен МС/МС-анализ, который показал, что было включено только 13-25% метионина, но после воздействия УФ-А или другого сшивающего агента BS 2 G-опосредованная сшивка (гомобифункциональный сшивающий агент), процент фотометионина увеличился до 35%. Оба сшивателя продемонстрировали дополнительную структурную проницательность как в вычислительном, так и в экспериментальном плане, что помогло понять функции. [6]
Выявление димерной структуры и олигомерной структуры
[ редактировать ]Структуры циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2) и микросомальной простагландин Е 2 синтазы-1 (mPGES-1) были изучены с использованием как фотометиониновых (фотоактивируемых), так и бифункциональных сшивающих агентов. Фотометионин, использованный в ЦОГ-2, как и бифункциональный сшивающий агент, показал, что существует димерная структура, соответствующая кристаллической структуре фермента. В mPGES-1 человеческие клетки ( A549 ), обработанные дисукцинимидилсубератом (химическим сшивающим агентом), дали димер 33 кДа и тример 45 кДа, в то время как обработка фотометионином привела к димеру той же молекулярной массы. вес (33 кДа) и два предполагаемых тримера (50 кДа и 55 кДа). Однажды ингибитор mPGES-1 ( MF63 был введен ); это ингибировало образование комплексов 50 кДа и 55 кДа. Димер и тример, полученные с помощью химического сшивающего агента, не подвергались воздействию ингибитора. Тем не менее, фотометионин и дисукцинимидилсуберат не выявили каких-либо белок-белковых взаимодействий между ЦОГ-2 и mPGES-1, и это могло быть связано с разными причинами. Для фото-метионина; это могло быть связано с низким уровнем регистрации в то время, поскольку он составлял 0,7%. Итак, для mPGES-1; в нем 152 аминокислоты, поэтому на каждый мономер будет включен только один фотометионин. Это также означает, что ни один конкретный метионин не будет заменен, что приведет к образованию гетерогенной популяции mPGES-1, что приведет к различным перекрестным сшивкам. Несмотря на то, что он не показал каких-либо белок-белковых взаимодействий, его можно использовать для обнаружения конформационных изменений белков в клеточных мембранах, вызванных ингибиторами, помимо определения олигомерных структур. [7]
кишечной палочки Клетки
[ редактировать ]Фотометионин можно использовать для мечения рекомбинантных белков в Escherichia coli клетках ; хотя метионин в целом является редкой аминокислотой, а это означает, что он может дать лишь ограниченные структурные данные. [8] Тем не менее фотометионин был включен в состав Ca. 2+ регулирующий белок кальмодулин (CaM с массой 17 кДа), содержащий девять метионинов и изученный с помощью масс-спектрометрии (МС). [9] Что отличает этот метод, так это использование среды минеральных солей вместо DMEM (модифицированной Дульбекко ограничивающей среды Игла) или диализированной фетальной бычьей сыворотки для включения в клетки. [9] Использование среды с минеральной солью позволило выращивать клетки с самого начала, чтобы исключить сложные этапы с другими протоколами (инкубация клеток в среде LB с последующей промывкой и дальнейшее инкубирование в обедненной среде), а это означает, что фотометионин может быть включен в самом начале роста клеток, который имел высокий выход выше 30%. [9] Фотометионин не повреждался в процессе роста клеток, и после фотоактивации под действием УФ-А света CaM имел девять различных сайтов перекрестных связей, как только MS определила наличие пиков фотометионина, меченного CaM. [9] Фотометионин можно использовать не только для картирования трехмерной структуры белка, изучения межбелковых взаимодействий, но и для гидрофобных областей белка. [9]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Перейти обратно: а б с д и ж г час я дж к л м н тот п д Суханек, Моника; Радзиковская, Анна; Тиле, Кристоф (апрель 2005 г.). «Фотолейцин и фотометионин позволяют идентифицировать белок-белковые взаимодействия в живых клетках» . Природные методы . 2 (4): 261–268. дои : 10.1038/nmeth752 . ISSN 1548-7105 . ПМИД 15782218 . S2CID 205427639 .
- ^ Кёльбель, Кнут; Илинг, Кристиан Х.; Синц, Андреа (2012). «Анализ вторичных структур пептидов с помощью фотоактивируемых аналогов аминокислот» . Angewandte Chemie, международное издание . 51 (50): 12602–12605. дои : 10.1002/anie.201205308 . ISSN 1521-3773 . ПМИД 23109332 .
- ^ Перейти обратно: а б с д и ж г час я Вила-Перельо, Микель; Пратт, Мэтью Р.; Тулин, Фрей; Мьюир, Том В. (1 июля 2007 г.). «Ковалентный захват фосфорзависимой олигомеризации белка путем сайт-специфического включения диазиринового фотосшивающего линкера» . Журнал Американского химического общества . 129 (26): 8068–8069. дои : 10.1021/ja072013j . ISSN 0002-7863 . ПМЦ 3242410 . ПМИД 17567014 .
- ^ Птачкова, Рената; Барли, Томас; Новак, Петр; Гудечек, Иржи; Стиборова, Мария; Шульц, Мирослав (июнь 2014 г.). «Применение нового метода для картирования интерфейса белок-белкового взаимодействия: сочетание фотоинициируемых сшивающих белковых нанозондов с масс-спектрометрией» . Международный журнал молекулярных наук . 15 (6): 9224–9241. дои : 10.3390/ijms15069224 . ПМК 4100091 . ПМИД 24865487 .
- ^ Перейти обратно: а б с Барли, Томас; Птачкова, Рената; Блэк, Вера; Драчинска, Елена; Ходек, Питер; Стиборова, Мария; Гудечек, Иржи; Шульц, Мирослав (01 ноября 2015 г.). «Фотоинициируемое сшивание расширяет картирование межбелкового интерфейса до встроенных в мембрану частей цитохромов P450 2B4 и b5» . Методы . Структурная биология, основанная на масс-спектрометрии. 89 : 128–137. дои : 10.1016/j.ymeth.2015.07.015 . ISSN 1046-2023 . ПМИД 26235815 .
- ^ Лёссль, Филип; Кёльбель, Кнут; Тенцлер, Дирк; Наннеманн, Дэвид; Илинг, Кристиан Х.; Келлер, Мануэль В.; Шнайдер, Мэриан; Зауке, Фрэнк; Мейлер, Йенс; Синц, Андреа (11 ноября 2014 г.). «Анализ взаимодействия нидоген-1/ламинина γ1 с помощью перекрестных связей, масс-спектрометрии и компьютерного моделирования выявляет множественные режимы связывания» . ПЛОС ОДИН . 9 (11): e112886. Бибкод : 2014PLoSO...9k2886L . дои : 10.1371/journal.pone.0112886 . ISSN 1932-6203 . ПМЦ 4227867 . ПМИД 25387007 .
- ^ Хету, Пьер-Оливье; Уэлле, Марк; Фальгейре, Жан-Пьер; Рамачандран, Чидамбарам; Робишо, Джоэл; Замбони, Роберт; Риендо, Дени (1 сентября 2008 г.). «Фотосшивка белков в интактных клетках выявляет димерную структуру циклооксигеназы-2 и чувствительную к ингибитору олигомерную структуру микросомальной простагландин-синтазы Е2-1» . Архив биохимии и биофизики . 477 (1): 155–162. дои : 10.1016/j.abb.2008.04.038 . ISSN 0003-9861 . ПМИД 18498757 .
- ^ Коль, Бастиан; Брюдерлин, Митчелл; Ритц, Данило; Шмидт, Александр; Хиллер, Себастьян (07 августа 2020 г.). «Протокол высокопроизводительного производства меченных фотолейцином белков в Escherichia coli» . Журнал исследований протеома . 19 (8): 3100–3108. doi : 10.1021/acs.jproteome.0c00105 . ISSN 1535-3893 . ПМИД 32412763 . S2CID 218658726 .
- ^ Перейти обратно: а б с д и Пиотровски, Кристина; Илинг, Кристиан Х.; Синц, Андреа (01 ноября 2015 г.). «Расширение стратегии сшивания/масс-спектрометрии: легкое включение фотоактивируемых аминокислот в модельный белок кальмодулин в клетках Escherichia coli» . Методы . Структурная биология, основанная на масс-спектрометрии. 89 : 121–127. дои : 10.1016/j.ymeth.2015.02.012 . ISSN 1046-2023 . ПМИД 25726908 .