Субклонирование

На этом изображении показана процедура субклонирования, показанная слева.

В молекулярной биологии субклонирование – это метод, используемый для перемещения определенной последовательности ДНК из родительского вектора в целевой вектор .

Субклонирование не следует путать с молекулярным клонированием , родственным методом.

Процедура

Ферменты рестрикции используются для удаления интересующего гена ( вставки ) из родительского элемента. Вставку очищают, чтобы изолировать ее от других молекул ДНК. Распространенным методом очистки является выделение геля . Затем количество копий гена амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Одновременно те же ферменты рестрикции для переваривания (разрезания) назначения используются . Идея использования одних и тех же ферментов рестрикции заключается в создании дополнительных липких концов облегчит лигирование , что в дальнейшем . Фосфатаза щелочная фосфатаза кишечника , обычно теленка (CIAP), также добавляется для предотвращения самолигирования вектора назначения. Переваренный вектор назначения выделяют/очищают.

Затем вставку и целевой вектор смешивают с ДНК-лигазой. Типичное молярное соотношение генов-вставок к векторам назначения составляет 3:1; за счет увеличения концентрации вставки самолигирование еще больше снижается. После того, как реакционная смесь выдержится в течение определенного времени при определенной температуре (в зависимости от размера лигируемых цепей; дополнительную информацию см. в разделе ДНК-лигаза ), вставка должна успешно включиться в целевую плазмиду .

Амплификация продукта плазмиды

Плазмида часто трансформируется в бактерию, подобную E. coli . В идеале, когда бактерия делится, плазмида также должна реплицироваться. В лучшем случае каждая бактериальная клетка должна иметь несколько копий плазмиды. После того как вырастет большое количество бактериальных колоний, их можно подвергнуть минипрепарату для сбора плазмидной ДНК.

Выбор

Чтобы гарантировать рост только трансформированных бактерий (которые несут нужные плазмиды для сбора), маркерный ген используется в целевом векторе для селекции . Типичные гены-маркеры предназначены для устойчивости к антибиотикам или биосинтеза питательных веществ . Так, например, «ген-маркер» может быть связан с устойчивостью к антибиотику ампициллину. Если бы бактерии, которые должны были захватить желаемую плазмиду, подхватили желаемый ген, то они также содержали бы «ген-маркер». Теперь бактерии, подхватившие плазмиду, смогут расти в ампициллине, тогда как бактерии, не подхватившие нужную плазмиду, все равно будут уязвимы для разрушения ампициллином. Следовательно, успешно трансформированные бактерии будут «отобраны».

Пример случая: субклонирование бактериальной плазмиды.

В этом примере ген из библиотеки генов млекопитающих будет субклонирован в бактериальную плазмиду (целевую платформу). Бактериальная плазмида представляет собой часть кольцевой ДНК, которая содержит регуляторные элементы, позволяющие бактериям производить генный продукт ( экспрессию гена ), если он помещен в правильное место в плазмиде. Сайт продукции окружен двумя сайтами разрезания рестриктаз «А» и «В» с несовместимыми липкими концами.

ДНК млекопитающих не содержит этих сайтов рестрикции, поэтому они встраиваются с помощью ПЦР с перекрытием . Праймеры разработаны таким образом, чтобы сайты рестрикции располагались аккуратно, так что кодирование белка находится в рамке считывания и минимум дополнительных аминокислот имплантируется с обеих сторон белка.

Как продукт ПЦР, содержащий ген млекопитающих с новыми сайтами рестрикции, так и целевую плазмиду подвергают рестрикционному расщеплению, а продукты расщепления очищают с помощью гель-электрофореза .

Продукты гидролизата, теперь содержащие совместимые липкие концы друг с другом (но несовместимые липкие концы сами с собой), подвергаются лигированию, создавая новую плазмиду, которая содержит фоновые элементы исходной плазмиды с другой вставкой.

Плазмиду трансформируют в бактерии, и идентичность вставки подтверждают секвенированием ДНК .

См. также

• Клонирование
• Молекулярное клонирование
• Полимеразная цепная реакция
• клонирование ТА