EPIC-Seq

Рис. 1. На этой блок-схеме показан рабочий процесс EPIC-Seq, комплексного метода анализа бесклеточной ДНК (вкДНК). Начальный этап включает извлечение вкДНК из плазмы пациентов посредством жидкой биопсии. Впоследствии процесс переходит к захвату считываний в области сайта начала транскрипции (TSS) целевых генов с использованием специализированных зондов, обеспечивая точное геномное покрытие. После того, как вкДНК в области TSS целевых генов захвачена, следующий этап включает вычисление фрагментомных характеристик, таких как энтропия фрагментации промотора (PFE) и глубина в областях, обедненных нуклеосомами (NDR), что дает представление о структурных характеристиках фрагментов ДНК. . Наконец, используя NDR и PFE всех целей в качестве функций, создается модель машинного обучения для определения профилей экспрессии генов у пациентов, что облегчает интерпретацию молекулярных сигнатур и помогает в диагностических и прогностических оценках.

EPIC-seq (сокращение от Epigenetic Expression I nference by Cell -free DNA Sequence ) представляет собой высокопроизводительный метод, который специфически воздействует на промоторы генов с помощью секвенирования бесклеточной ДНК (вкДНК). Используя неинвазивные методы, такие как забор крови , он определяет уровни экспрессии целевых генов . Он состоит из влажного и сухого лабораторных этапов.

EPIC-seq включает глубокое секвенирование сайтов начала транскрипции (TSS). Он предполагает, что при глубоком секвенировании этих TSS использование фрагментомных признаков, паттернов или свойств фрагментации хроматина может позволить проводить анализ с высоким разрешением, в отличие от его альтернатив.

Метод оказался эффективным для определения экспрессии на уровне генов , молекулярного подтипирования диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы (DLBCL), гистологической классификации немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ), оценки результатов иммунотерапевтических агентов и оценки генов. прогностическое значение. EPIC-seq использует машинное обучение для определения экспрессии РНК генов и предлагает два новых показателя: энтропию фрагментации промотора (PFE), скорректированный индекс Шеннона для энтропии , и показатель региона с обедненными нуклеосомами (NDR), глубина секвенирования в регионах NDR. PFE показал превосходную производительность по сравнению с более ранними метриками для фрагментированных функций.

Кроме того, EPIC-seq упоминается как возможное решение для выявления повреждений тканей и рака пищевода с использованием профилей метилирования вкДНК. профилирование молекулярных сетей донорской печени, и воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) обнаружение.

Фон

Историческое использование вкДНК и фрагментомных особенностей

cfDNA , молекулы ДНК, связанные со смертью клеток и фрагментированные хроматином, содержащиеся в плазме крови , в предыдущих исследованиях использовались для обнаружения отторжения трансплантированной ткани , пренатального тестирования анеуплоидии плода , профилирования опухолей и раннего выявления рака. Тем не менее, распространенные методы жидкой биопсии для профилирования вкДНК зависят от обнаружения зародышевых или соматических генетических вариаций , которые могут отсутствовать даже у пациентов с тяжелым бременем заболевания и раком с высокой частотой мутаций опухоли.

Исторически было показано, что использование фрагментарных свойств образцов вкДНК является еще одним методом решения упомянутых проблем. Они продемонстрировали способность информировать о возникшей тканевой классификации молекул вкДНК связанные с опухолью , что может помочь выделить соматические мутации, . Однако современные методы, использующие фрагментомные функции, такие как поверхностное полногеномное секвенирование (WGS) на вкДНК, не полностью охватывают все эффекты тканей и обеспечивают низкую глубину и широту секвенирования, чтобы сделать вывод о низкоуровневых, например, уровне генов, свойствах. . Следовательно, эти методы требуют высокой опухолевой нагрузки у пациентов.

Профилирование ДНК циркулирующей опухоли

Молекулы циркулирующей опухолевой ДНК (цДНК) представляют собой внеклеточную ДНК опухолевого происхождения (вкДНК), циркулирующую в кровотоке и не связанную с клетками. ЦтДНК в первую очередь возникает в результате фрагментации хроматина, сопровождающей гибель опухолевых клеток. и может быть извлечен с помощью жидкой биопсии. Анализ CtDNA реализован для неинвазивной идентификации генетических характеристик опухолей и раннего распознавания различных форм рака. Большая часть текущего анализа ктДНК зависит от генетических различий в зародышевых или соматических клетках для диагностики заболеваний и обнаружения опухолевых клеток на ранней стадии. Хотя изучение генетических вариаций ктДНК может быть полезным, не все ктДНК содержат генетические мутации. EPIC-seq объединил эпигенетические особенности ктДНК, чтобы информировать ткань происхождения об этих немутантных молекулах, что полезно для классификации рака.

Фрагментомные признаки для классификации тканей по происхождению

Большинство циркулирующих молекул вкДНК представляют собой фрагменты, связанные с нуклеосомами, поэтому они представляют собой уникальные структуры хроматина, обнаруженные в ядерных геномах клеток, из которых они происходят. В частности, открытые области j хроматина, тогда как области генома, связанные с нуклеосомными комплексами, часто защищены от активности эндонуклеазы. Несколько исследований выявили специфические фрагментомные характеристики хроматина, которые помогают определить происхождение тканей посредством профилирования вкДНК . Эти функции включают в себя:

1. Уменьшенная глубина покрытия секвенирования
2. Нарушение позиционирования нуклеосом вблизи сайтов начала транскрипции (TSS)
3. Длина фрагментов вкДНК

Принципы EPIC-seq

Рис. 2. Диаграмма, объясняющая энтропию фрагментации промотора (PFE) и область с обеднением нуклеосом (NDR).

В настоящее время большинство методов фрагментомной циркулирующей опухолевой ДНК (ктДНК) не способны обеспечить разрешение на уровне генов и эффективны главным образом для определения экспрессии при повышенных уровнях ктДНК. Следовательно, они в первую очередь применимы к пациентам с заметно развитой опухолевой массой, обычно наблюдаемой на поздних стадиях рака.

Чтобы устранить это ограничение, EPIC-seq использует целевое глубокое секвенирование на основе гибридного захвата областей, фланкирующих сайты начала транскрипции (TSS) в вкДНК. Этот подход позволяет получить характеристики фрагментации ктДНК, имеющие решающее значение для прогнозирования экспрессии генов, такие как энтропия фрагментации промотора (PFE) и область истощения нуклеосом (NDR). Эти ключевые фрагментомные особенности обладают способностью улавливать ассоциации на уровне генов с уровнями экспрессии по всему геному, что позволяет построить прогностическую модель транскрипционных результатов. Это позволит осуществлять мониторинг фрагментации вкДНК с высоким разрешением и анализ на уровне генов.

Энтропия фрагментации промотора

Epic-seq предполагает, что фрагменты вкДНК, происходящие от активных промоторов, которые менее защищены нуклеосомами и, следовательно, более восприимчивы к расщеплению эндонуклеазой, будут демонстрировать более хаотичные паттерны расщепления по сравнению с фрагментами от неактивных промоторов, которые лучше защищены нуклеосомами. PFE — это разновидность индекса Шеннона , который является количественным показателем оценки разнообразия. В контексте Epic-seq PFE вычисляет разнообразие длин фрагментов вкДНК, где оба конца фрагмента расположены внутри фланкирующей области 2 т.п.н. TSS каждого гена. Чем выше PFE TSS гена, тем более вероятно, что ген имеет высокую экспрессию.

Нуклеосомная истощенная область

Активно экспрессируемые гены имеют открытый хроматин в своей TSS-области, они менее экранированы нуклеосомами и, следовательно, более восприимчивы к расщеплению эндонуклеазой. Следовательно, глубина вкДНК, происходящей из TSS активных генов, имеет тенденцию быть меньше по сравнению с глубиной неактивных генов. NDR количественно определяет нормализованную глубину в каждом 2-килобазном окне, окружающем каждый TSS. Чем ниже NDR сайта TSS гена, тем более вероятно, что ген имеет высокую экспрессию.

Методы

Рабочий процесс влажной лаборатории

1. Сбор и обработка плазмы.

Образцы периферической крови получали и обрабатывали для выделения плазмы в соответствии со стандартными протоколами. После центрифугирования образцы плазмы хранили при температуре -80 °C в ожидании выделения цтДНК. Экстракцию вкДНК из объемов плазмы от 2 до 16 мл проводили с использованием установленных лабораторных методик. После выделения концентрацию вкДНК определяли с использованием методов количественного определения, основанных на флуоресценции.

2. Подготовка библиотеки секвенирования

Для приготовления библиотеки использовали типичное количество вкДНК 32 нг. Ввод ДНК был скорректирован для смягчения последствий загрязнения ДНК высокомолекулярной массой. Процесс подготовки библиотеки включал в себя восстановление концов, А-хвост и лигирование адаптера, что также включало в себя молекулярные штрих-коды при каждом считывании. Эти процедуры проводили в соответствии со стандартизированными протоколами подготовки библиотек, основанными на лигировании, с лигированием в течение ночи при 4 °C. После этого библиотеки вкДНК дробового типа подверглись гибридному захвату, нацеленному на определенные области генома, как подробно описано ниже.

3. Последовательность пользовательских панелей захвата

В EPIC-seq использовались специальные панели захвата, адаптированные к конкретным типам рака или персонализированные селекторы. Панели захвата нацелены на области начала транскрипции интересующих генов. Обогащение для EPIC-seq проводили в соответствии с установленными лабораторными протоколами. Впоследствии гибридизационные захваты были объединены, и объединенные образцы подверглись секвенированию с использованием секвенирования короткого считывания .

Рабочий процесс сухой лаборатории

Поскольку EPIC-seq содержит определенные вычислительные части после части «мокрой лаборатории» для дальнейшей обработки, следующие шаги суммированы на основе шагов разработчиков, представленных в исходной статье.

4. Демультиплексирование и исправление ошибок

Если используется мультиплексированное парное секвенирование, то необходимо выполнить демультиплексирование для сортировки чтений разных образцов в разные файлы. После демультиплексирования можно выполнить коррекцию ошибок и исключение пар чтения на основе уникального идентификатора и сопоставления пар штрих-кодов. Разработчики адаптируют этапы демультиплексирования и исправления ошибок из CAPP-seq. конвейер демультиплексирования.

5. Удаление и обрезка внешней последовательности

Для сохранения чтения более коротких фрагментов удалить штрих-код и обрезать адаптер необходимо . После предварительной обработки чтения согласование прочтений с эталоном генома необходимо выполнить человека. Исходный EPIC-seq использовал hg19 но для получения лучших результатов можно использовать обновленную версию справочника генома человека. Следует быть осторожным с вариантами элайнеров, поскольку некоторые элайнеры могут мешать включению более коротких прочтений в пару с более длинными. Для дедупликации прикрепленные молекулярные индивидуальные штрих-коды следует использовать . Эти штрих-коды включают эндогенные и экзогенные уникальные молекулярные идентификаторы (UMI) и удобны для различения дубликатов полимеразной цепной реакции (ПЦР) от реальных дубликатов и, следовательно, для очистки дубликатов ПЦР . Эта часть особенно важна для онкологических применений, поскольку низкое количество мутаций может быть подавлено дубликатами ПЦР .

6. Прочтите Нормализация и контроль качества.

Если данные для разных выборок будут сравниваться друг с другом, можно выполнить понижающую дискретизацию чтений для достижения сопоставимости. Сообщается, что глубина покрытия секвенирования для получения приемлемых результатов анализа превышает 500 раз, поэтому любой образец, средняя глубина секвенирования которого не превышает это число, может быть исключен для получения более точных результатов. Кроме того, в EPIC-seq используется расчетная ожидаемая вкДНК плотность длины фрагмента 140–185, основанная на длине хроматосом. Выборки, которые имеют слишком высокую плотность длины фрагментов, могут быть исключены для получения более высоких результатов корреляции. В качестве последнего этапа контроля качества следует учитывать качество картирования. Для чтений EPIC-seq может быть установлен более свободный порог по сравнению с WGS , поскольку критерии выбора TSS, налагаемые на этапах проектирования, делают чтения более уникальными для EPIC-seq.

Фрагментомный анализ признаков

7. Энтропия Шеннона

Для измерения разнообразия фрагментированных признаков используется метрика PFE, полученная на основе индекса энтропии Шеннона . разработан. Количество по умолчанию 201 интервал длиной от 100 до 300 используется для оценки плотности методом максимального правдоподобия . Вероятность наличия фрагмента размером $99+i$, ( ${\hat {p_{i}}}$) вычисляется путем деления количества фрагментов на размер $99+i$ по общему количеству фрагментов. Энтропия Шеннона рассчитывается по формуле: ${\textstyle -\sum _{i=1}^{201}({\hat {p_{i}}}\log _{2}({\hat {p_{i}}}))}$.

8. Мультиномиальная модель Дирихле.

Далее, в качестве очистки от различной глубины секвенирования в разных сериях и других факторов, которые могут помешать правильному распределению длин фрагментов, байесовскую нормализацию с помощью мультиномиальной модели Дирихле следует выполнить . Для каждой выборки на основе длин фрагментов, наблюдаемых в этой выборке, генерируется полиномиальное распределение длин фрагментов на основе оценки максимального правдоподобия. Используют два интервала длиной 250 пар оснований, расположенные между -1000-й парой оснований и -750-й парой оснований и между местоположениями между 750-й и 1000-й парами оснований до центра TSS. Это сделано для предотвращения влияния экспрессии генов на генерируемое распределение, поскольку выбранные интервалы находятся относительно далеко от TSS. Затем плотности длин фрагментов из этого распределения выбираются для каждого размера 201 фрагмента и используются в качестве параметра для генерации распределения Дирихле.

Начальный параметр распределения Дирихле установлен равным 20. Из полученного распределения Дирихле выбираются 2000 фрагментов, а энтропия Шеннона рассчитывается для тех. Шеннона Энтропия впоследствии сравниваются с энтропией Шеннона значения пяти случайно выбранных фоновых наборов ( $e_{i}$ где $1\leq i\leq 5$).

9. Расчет PFE

PFE рассчитывается как вероятность того, что ген-специфическая энтропия будет выше, чем $(1+k)$ раз все остальные фоновые значения энтропии устанавливаются индивидуально. Переменная $k$ выбирается из гамма-распределения с формой 1 и скоростью 0,5. Кроме того, на последнем этапе ожидаемое значение суммы вероятностей энтропии, специфичной для гена, для каждого фона указывается как PFE. Эта вероятность основана на распределении Дирихле , полученном на предыдущем шаге.

10. Расчет NDR

NDR — это нормализованная мера глубины секвенирования, которая по умолчанию была уменьшена до 2000 складок в окнах с 2000 парами оснований на этапах предварительной обработки считывания и контроля качества.

11. Машинное обучение для прогнозирования выражений

Используя глубокие WGS данные о вкДНК из карциномы неизвестного первичного пациента с количественной оценкой очень низкой концентрации ктДНК , они обучили модель машинного обучения с использованием начальной загрузки . Результаты секвенирования РНК на PBMC для 5 различных пациентов регистрируются, и среднее значение 3 уровней экспрессии этих людей используется в качестве эталона для экспрессии генов . Гены группируются в 10 кластеров на основе экспрессии эталонных генов для увеличения разрешения основных промоторов . Затем гены, используемые в качестве фонового значения для расчета PFE, удаляются. Затем объединяются все фрагменты в расширенных регионах TSS, которые имеют центр как центр регионов TSS и длину 2000 пар оснований. Оценки PFE и NDR рассчитываются для объединенных фрагментов. Дальнейшая нормализация этих показателей осуществляется на основе их 95-го процентиля .

Используя эти две функции, они загрузили и использовали взвешенным образом 600 моделей прогнозирования экспрессии, разработанных для данных WGS . Среди этих моделей есть 200 одновариантных автономных NDR, 200 одновариантных автономных PFE и 200 интегрированных моделей NDR-PFE.

Преимущества

Высокая пропускная способность

EPIC-seq унаследовал преимущества высокопроизводительного секвенирования: быстрое время секвенирования, высокую масштабируемость, большую глубину секвенирования, более низкие затраты и низкий уровень ошибок. Еще одним преимуществом EPIC-seq является его неинвазивность. Это также устраняет риски применения инвазивных методов на рискованных тканях и позволяет ученым изучать ткани, которые слишком опасны или трудны для этого.

Требование независимости от высокой опухолевой нагрузки

Как упоминалось во введении, два основных ограничения методов-предшественников не унаследованы EPIC-Seq: зависимость от зародышевой линии или соматических вариантов обычных методов жидкой биопсии, которую также нельзя обнаружить даже у пациентов с высоким бременем заболевания, и таких методов, как поверхностная биопсия. , геномной ширины и глубины генома, используемый WGS Недостаточный диапазон рассмотрения ткани вкДНК , приводит к низкому разрешению и уровню вывода об экспрессии генов и, опять же, требует высокой опухолевой нагрузки для более высокого разрешения. EPIC-seq использует фрагментированные функции вместо вызова вариантов, поэтому он не связан существованием варианта. Кроме того, поскольку он выполняет целенаправленное секвенирование, а не весь геном, он позволяет ученым увеличить глубину секвенирования и, следовательно, обеспечить лучшее разрешение. Более того, он также предоставляет более чувствительную и полную информацию о происхождении ткани.

Различная чувствительность прогнозирования

Кроме того, метод показал стабильную эффективность в решении проблем идентификации, классификации и лечения рака, таких как идентификация НМРЛ и DLBCL , гистологическая классификация подтипов НМРЛ , молекулярная классификация подтипов DLBCL , DLBCL COO обнаружение лиганда 1 смерти , запрограммированное ингибирование иммунной контрольной точки . прогнозирование ответа на распространенные случаи НМРЛ и выявление прогностической ценности отдельных генов.

Обобщаемость

WES был проведен с помощью EPIC-seq и выявил корреляцию между биологическим сигналом и экзонными областями активных генов; это показывает, что EPIC-seq можно обобщить для генов, экспрессии интересующих а не только генов рака.

Устойчивость на уровне вкДНК

В целом результаты анализа EPIC-seq показали значительную корреляцию между проверяемым биологическим эффектом и полученным показателем. Для задач классификации значения площади под кривой ROC (рабочей характеристической кривой приемника) ( AUC ) составляли более 90% с достаточным интервалом значимости. Кроме того, для этих задач уровни вкДНК не влияли неблагоприятно на производительность, даже когда уровни были ниже 1%. Таким образом, метод вкДНК также показывает хорошую устойчивость к уровням . Наконец, EPIC-seq не показал каких-либо существенных изменений при различных преаналитических факторах. что доказывает, что метод устойчив при различных обстоятельствах, которые могут быть вызваны инструментами и инструментами, использованными перед анализом.

Ограничения

Хотя EPIC-seq предлагает значительный потенциал в различных биомедицинских приложениях, он также имеет ограничения, которые требуют рассмотрения при его реализации и интерпретации.

Зависимость от известных генов, связанных с раком

Одним из ограничений EPIC-seq является его зависимость от предварительных знаний о генах, связанных с конкретными видами рака. Эффективность модели EPIC-seq зависит от наличия комплексных профилей экспрессии генов для целевых типов рака. Эта зависимость может ограничить его применимость к раку с хорошо изученными паттернами экспрессии генов, ограничивая его полезность при раке с менее понятными молекулярными характеристиками.

Ограниченная применимость к конкретным типам рака.

EPIC-seq может быть более эффективным при раке с выраженными генами или четко определенными молекулярными подтипами. Следовательно, его полезность может быть ограничена при раке с менее четким генетическим профилем или при раке, характеризующемся значительной межпациентной вариабельностью. Это ограничивает возможность его обобщения на различные типы рака и требует осторожной интерпретации результатов в различных онкологических контекстах.

Ограниченная эффективность при раке на ранней стадии

EPIC-seq может демонстрировать повышенную эффективность при выявлении рака на поздних стадиях благодаря более высоким уровням ctDNA и более выраженным генетическим изменениям. Например, чувствительность EPIC-seq для выявления НМРЛ значительно снижается у пациентов с низкой нагрузкой опухолевой ДНК (ниже 1%), что приводит к снижению показателей обнаружения примерно на 34%.

Приложения

Неинвазивное обнаружение рака

EPIC-seq продемонстрировал замечательный потенциал в неинвазивном обнаружении рака, особенно в диагностике рака легких, основной причины смертности от рака. Используя EPIC-seq, исследователи достигли высокой точности в различении пациентов с НМРЛ , пациентов с DLBCL и здоровых людей.

Неинвазивная классификация подтипов рака

EPIC-seq позволяет разделить НМРЛ на гистологические подтипы, такие как аденокарцинома легких (LUAD) и плоскоклеточный рак легких (LUSC). EPIC-seq также может помочь в классификации подтипов клеток происхождения (COO) при DLBCL . Анализируя эпигенетические и транскрипционные сигнатуры, классификаторы, основанные на EPIC-seq, предоставляют ценную информацию о гетерогенности опухолей и молекулярных подтипах, предоставляя ценную информацию для индивидуальных стратегий лечения.

Прогноз терапевтического ответа

Помимо диагностики и классификации, EPIC-seq обещает прогнозировать реакцию пациентов на различные методы лечения рака, включая ингибирование иммунных контрольных точек (ICI). Анализируя изменения в моделях экспрессии генов, зафиксированные с помощью EPIC-seq, исследователи могут прогнозировать реакцию пациентов на блокаду PD-(L)1, что может оказать большую помощь в персонализированном лечении рака. Индексы, полученные с помощью EPIC-seq, показали значительную корреляцию с ответом на лечение, предлагая потенциальные прогностические маркеры для прогнозирования результатов терапии.

Иммунотранскриптомное профилирование классической лимфомы Ходжкина

Было показано, что EPIC-seq эффективен для определения эпигенетической экспрессии подтипов классической лимфомы Ходжкина (cHL). Клетки Ходжкина и Рида/Штернберга и экспрессия соответствующих им Т-клеток были выявлены с помощью EPIC-seq. Результаты массового секвенирования одноклеточной РНК демонстрируют значительную корреляцию с профилями этих типов клеток EPIC-seq.

Возможные варианты использования

Исследования в различных областях упоминают возможные варианты использования EPIC-seq. Комплексный инструментарий для анализа полногеномных особенностей вкДНК (INAC) объединяет различные инструменты, в том числе оценки PFE и NDR EPIC-seq, для обеспечения комплексного силико-анализа вкДНК, который может служить примером состояния заболевания и вывода клинических исходов, моделирования транскриптома и профилирования числа копий. Также упоминается, что EPIC-seq может быть использован в клинических случаях ВЗК . Его можно использовать для профилактики ВЗК в группах высокого риска и предракового развития, вызванного ВЗК . Его также называют возможным лучшим методом клинического выявления повреждений кишечника при ВЗК по сравнению с нынешними методами.

Альтернативы

Поскольку EPIC-seq изучает эпигенетические маркеры, чтобы сделать вывод об экспрессии генов, можно изучить такие методы эпигенетического секвенирования, как ChIP-seq , ATAC-последовательность , MeDIP-сек, и секвенирование метилирования ДНК без бисульфитов в сочетании с методами определения профиля экспрессии РНК , такими как RNA-seq и scRNA-seq .

Учитывая, что этот метод в основном разработан для раннего выявления рака или его подгруппирования, методы жидкой биопсии , такие как Twist cfDNA Pan-Cancer Reference Standard в качестве альтернативы можно использовать . Различные методы жидкой биопсии фокусируются на бесклеточных опухолевых маркерах, маркерах метилирования опухоли, экзомах , белках, липидах , углеводах , электролитах , метаболитах , РНК , внеклеточных везикулах , циркулирующих опухолевых клетках и тромбоцитах , образованных опухолью, для раннего неинвазивного выявления рака. . Некоторые из предлагаемых методов жидкой биопсии обеспечивают комплексное обнаружение типов рака, например, ATR-FTIR-спектроскопия. и РакSEEK, в то время как другие, такие как Dxcover и SelectMdx действуют на более конкретные (даже отдельные) мишени рака.

EPIC-seq использует фрагментомные признаки для определения уровней экспрессии генов. В некоторых исследованиях также используются фрагментарные признаки, чтобы сделать вывод о существовании рака, гибели клеток и обнаружить другие клинические состояния, такие как отказ трансплантата .

ctDNA по анализу размера фрагмента

Этот метод использует выбор длины фрагмента ctDNA in vivo и silico для увеличения доли вариантов в плазме . Выбор метода основан на критериях выбора размера, основанных на свойствах длины фрагмента цтДНК крови , поэтому он не может быть хорошо обобщен для других неинвазивных методов отбора проб. Кроме того, он использует контролируемые методы машинного обучения, такие как случайный лес и логистическая регрессия на мелкой WGS, для классификации раковых и здоровых пациентов. Метод может быть использован при различных типах рака.

Профилирование концевых мотивов плазменной ДНК

Этот метод пытается идентифицировать мотивы длинного конца длиной 4 п.н. с 5'-конца каждого стенда при бисульфитного секвенирования чтении плазмы вкДНК . Иерархическая кластеризация мотивов проводится для обнаружения любого недостаточного или чрезмерного представления этих мотивов из-за существования рака. Этот метод включает в себя машины опорных векторов и логистическую регрессию для прогнозирования онкологических больных от здоровых. Этот метод также применяется к пациентам, перенесшим трансплантацию, с помощью анализа кластеризации и многомерного масштабирования (MDS) и показывает применимость. Те же виды анализа также доказали, что этот метод применим и к пренатальному тестированию. Этот метод также информативен для определения происхождения типов клеток.

Анализ фрагментации бесклеточной ДНК плазмы с учетом ориентации

в полученных сделать вывод о ткани происхождения фрагментов вкДНК, Этот метод позволяет результате бисульфитного секвенирования. с учетом ориентации В методе используется математическая формулировка для генерации сигналов для фрагментации вкДНК на основе эмпирических пиковых периодов и положений верхних/нисходящих концов считываний. Показано, что метод полезен для определения происхождения ткани, идентификации беременности, выявления рака и мониторинга трансплантата . Этот метод также предоставляет информацию о том, какая ткань происхождения в какой степени способствует считыванию вкДНК .

Оценка фрагментов ДНК для раннего перехвата

Метод анализирует неглубокие чтения WGS в окнах, принимая во внимание длину и покрытие фрагмента вкДНК . Полногеномная картина особенностей фрагментации вкДНК затем передается в модель машинного обучения с градиентным деревом для прогнозирования ситуации с раком. Они также использовали классификаторы машинного обучения, чтобы предсказать происхождение ткани. В целом, этот метод можно использовать для определения наличия у пациента рака. Несмотря на то, что этот метод не классифицирует конкретно типы рака во время прогнозирования, он используется для обнаружения различных видов рака.

Нуклеосомный след in vivo

Этот метод создает полногеномные карты занятости нуклеосом in vivo для обнаружения ткани происхождения молекул вкДНК . В этом методе используется выравнивание положения конечной точки считывания, которое, как ожидается, будет близко к сайтам ядерных частиц нуклеосомы (NCP). Показатель оконной защиты (WPS) предлагается для количественной оценки плотности вкДНК, близкой к NCP, с использованием частоты частиц вкДНК, которые охватывают 120 пар оснований с центром в заданном месте, за вычетом частоты фрагментов с конечной точкой в ​​том же интервале. Затем пики эвристически вызываются для WPS для выявления следов. Затем по следам прогнозируются клетки, вносящие вклад в вкДНК. Эти следы можно использовать для идентификации незлокачественных эпигенетических или генетических участков, таких как сайты связывания факторов транскрипции , а также обнаружения биомаркеров , связанных со злокачественными новообразованиями, на основе степени повреждения тканей и гибели клеток.

Использование нуклеосомного паттерна ctDNA для профилирования регуляции транскрипции

Метод в основном был разработан для выявления различных фенотипов метастатического рака предстательной железы , резистентного к кастрации . Это требует использования ксенотрансплантатов, полученных от пациента, для обогащения ктДНК в крови для дальнейшего анализа. После WGS метод использует инструмент Griffin. для проверки локального покрытия промотора , расположения нуклеосом , анализа размера фрагментов и составных сайтов связывания транскрипционных факторов, а также открытых сайтов хроматина считываний ctDNA. Он также проверяет модификации гистонов и применяет уменьшение размерности найденных сайтов для идентификации предполагаемых промоторов, энхансеров и гетерохроматических меток, репрессирующих гены. Для изучения фазировки хроматина и расстояния между открытыми областями хроматина метод использует TritonNP, недавно разработанное программное обеспечение, которое использует преобразования Фурье и полосовые фильтры . XGBoost используется для классификации по подтипу рака с использованием признаков, обнаруженных на предыдущих этапах.

Метилирование вкДНК, анализ количества копий и фрагментации для раннего выявления нескольких типов рака

Этот метод предлагается как анализ, который использует как вкДНК полногеномное секвенирование , так и информацию о фрагментных признаках для классификации мультирака. Соотношения числа копий, рассчитанные для здоровых и раковых тканей, используются в качестве идентификатора типа рака и существования рака. Как и в EPIC-seq, в этом методе также используются длины фрагментов. Соотношение короткого фрагмента к длинному фрагменту используется в методе в качестве показателя идентификатора. на уровне одного основания или области Использование процентного содержания метилирования на обнаруженных маркерах метилирования рака для каждого типа рака, соотношения количества копий и соотношения коротких/длинных фрагментов; метод использует специальный алгоритм машин опорных векторов для классификации типа рака, если он существует. Этот метод сообщает об обнаружении рака и тканях происхождения 4 типов рака. Однако для этого требуется обнаружение конкретных сайтов/областей метилирования , представляющих интерес для типов рака.