Двумерный гель-электрофорез

Двумерный гель-электрофорез , сокращенный как 2-DE или 2-D-электрофорез , является формой гелевого электрофореза, обычно используемого для анализа белков . Смеси белков разделены двумя свойствами в двух измерениях на 2D -гелях. 2-de был впервые независимо представлен О'Фарреллом ^{[ 1 ]} и Klose ^{[ 2 ]} в 1975 году.

Основа для разделения

2-D электрофорез начинается с электрофореза в первом измерении, а затем отделяет молекулы перпендикулярно от первого, чтобы создать электроферограмму во втором измерении. В электрофорезе в первом измерении молекулы разделяются линейно в соответствии с их изоэлектрической точкой. Во втором измерении молекулы затем отделяются на 90 градусов от первой электроферограммы в соответствии с молекулярной массой. Поскольку маловероятно, что две молекулы будут одинаковыми в двух различных свойствах, молекулы более эффективно разделены на двухмерном электрофорезе, чем при 1-D электрофорезе. ^{[ Цитация необходима ]}

Два измерения, которые белки разделены на использование этой техники, могут быть изоэлектрической точкой , белковой комплексной массой в нативном состоянии или массы белка . ^{[ Цитация необходима ]}

Разделение по изоэлектрической точке называется изоэлектрической фокусировкой . Таким образом, градиент pH применяется к гелу, и на геле применяется электрический потенциал, что делает один конец более положительным, чем другой. При всех значениях pH, кроме их изоэлектрической точки, белки будут заряжены. Если они будут положительно заряжены, они будут подтянуты к более негативному концу геля, и если они будут заряжены отрицательно, они будут подтянуты к более позитивному концу геля. Белки, применяемые в первом измерении, будут двигаться вдоль геля и будут накапливаться в их изоэлектрической точке; то есть точка, в которой общий заряд на белке составляет 0 (нейтральный заряд).
Разделение белковой комплексной массой осуществляется через нативную страницу , в которой белки остаются в их родном состоянии и разделены в электрическом поле после их массы и массы их комплексов соответственно. Чтобы получить разделение по размеру, а не чистым зарядом, как в IEF, дополнительный заряд передается белкам с помощью Coomassie Brilliant Blue или Lithium Dodecylfate. Знание белкового комплекса важно для анализа функционирования белков в клетке , поскольку белки в основном действуют вместе в комплексах, чтобы быть полностью функциональными. Анализ этой организации суб -органелле клетки требует методов, сохраняющих нативное состояние белковых комплексов .
Отдельное только по массе обычно достигается с использованием SDS-PAGE . SDS денаюры белков, разбивают большинство комплексов и приблизительно выравнивают соотношения массы к заряду. SDS должен быть выполнен в качестве второго, перпендикулярного измерения, поскольку оно разрывает комплексы на части (невозможна нативная страница) и выравнивает соотношения массы к заряду (делая IEF невозможным).

Обнаружение белков

Результатом этого является гель с белками, распространяющимися на ее поверхности. Эти белки могут затем быть обнаружены различными средствами, но наиболее часто используемыми пятнами являются серебро и кумасси блестящее синее окрашивание. В первом случае к гелу применяется серебряный коллоид. Серебро связывается с цистеиновыми группами в белке. Серебро затемняется воздействием ультрафиолетового света. Количество серебра может быть связано с темнотой и, следовательно, количество белка в данном месте на геле. Это измерение может дать только приблизительные суммы, но для большинства целей является адекватным. Окрашивание серебра в 100 раз более чувствительно, чем Coomassie Brilliant Blue с 40-кратным диапазоном линейности. ^{[ 3 ]}

Молекулы, отличные от белков, могут быть разделены с помощью 2D -электрофореза. В суперклейки анализах спиральная ДНК отделяется в первом измерении и денатурируется интеркалатором ДНК (например, бромид этидия или менее канцерогенный хлорохин ) во втором. Это сопоставимо с комбинацией нативного страницы/SDS-PAGE в разделении белка. ^{[ Цитация необходима ]}

Общие методы

IPG-DALT

Общим методом является использование иммобилизованного градиента рН (IPG) в первом измерении. Этот метод называется IPG-DALT . Образец сначала разделен на гель IPG (который является коммерчески доступным), затем гель разрезан на срезы для каждого образца, который затем уравновешивается в SDS-Mercaptoethanol и применяется к гелу SDS-PAGE для разрешения во втором измерении. Обычно IPG-DALT не используется для количественной оценки белков из-за потери компонентов с низкой молекулярной массой во время переноса в гель SDS-PAGE. ^{[ 4 ]}

IEF SDS-PAGE

См. Изоэлектрическая фокусировка

2D -гель -программное обеспечение

В количественной протеомике эти инструменты в первую очередь анализируют биомаркеры путем количественной оценки отдельных белков и показывая разделение между одним или несколькими «пятнами» на сканированном изображении 2-DE-геля. Кроме того, эти инструменты соответствуют пятнам между гелями сходных образцов, чтобы показать, например, протеомные различия между ранними и передовыми стадиями болезни. Пакеты программного обеспечения включают Delta2D (прекращен), ImageMaster (прекращен), Melanie, Pdquest (прекращен), Samespots и Redfin - среди других. ^{[ Цитация необходима ]} Хотя эта технология широко используется, интеллект не был усовершенствован. Например, в то время как PdQuest и Samespots, как правило, согласны с количественным определением и анализом хорошо определенных хорошо разделенных протеиновых пятен, они обеспечивают различные результаты и тенденции анализа с менее определенными менее отделенными пятнами. ^{[ 5 ]} Ранее были опубликованы сравнительные исследования, чтобы направлять исследователей по «лучшему» программному обеспечению для их анализа. ^{[ 6 ]} Несмотря на то, что обычно используется для стандартного гель-электрофореза , Sciugo также может использоваться для создания фигуры и количественной оценки. ^{[ Цитация необходима ]}

Проблемы для автоматического программного анализа включают не полностью разделенные (перекрывающиеся) пятна (менее определенные или разделенные), слабые пятна / шум (например, «пятна-призраки»), работающие различия между гелями (например, белок мигрируют в разные положения в разных гелях. ), непревзойденные/незамеченные пятна, что приводит к пропущенным значениям , ^{[ 7 ]}^{[ 8 ]} Несоответственные пятна, ошибки в количественной оценке (несколько различных пятен могут быть ошибочно обнаружены как одно место в программном обеспечении и частях пятна могут быть исключены из количественной оценки), и различия в алгоритмах программного обеспечения и, следовательно, тенденции анализа

Сгенерированные списки выбора могут быть экспортированы из некоторых программных пакетов ^{[ 9 ]} и используется для автоматического в геле-расщеплении пятен белков и последующей идентификации белков с помощью масс-спектрометрии . Анализ масс -спектрометрии может идентифицировать точные измерения массы наряду с секвенированием пептидов, которые варьируются от 1000–4000 единиц атомной массы. ^{[ 10 ]} Обзор текущего подхода для анализа программного обеспечения 2DE гель -изображений см. В Barth et al. ^{[ 11 ]} или Bandow et al. ^{[ 12 ]}

Смотрите также

Ссылки

^ О'Фаррелл, PH (1975). «Двумерный электрофорез с высоким разрешением белков» . Дж. Биол. Химический 250 (10): 4007–21. doi : 10.1016/s0021-9258 (19) 41496-8 . PMC 2874754 . PMID 236308 .
^ Клос, Дж. (1975). «Картирование белка комбинированной изоэлектрической фокусировкой и электрофорезом тканей мыши. Новый подход к тестированию индуцированных точечных мутаций у млекопитающих» . Humangenetik . 26 (3): 231–43. doi : 10.1007/bf00281458 . PMID 1093965 . S2CID 30981877 .
^ Switzer RC 3 -й, Merril CR, Shifrin S (1979). «Очень чувствительное пятно серебра для обнаружения белков и пептидов в полиакриламидных гелях». Аналитическая биохимия . 98 (1): 231–37. doi : 10.1016/0003-2697 (79) 90732-2 . PMID 94518 .
^ Микельсен, Сьюзен; Cortón, Eduardo (2004). Биоаналитическая химия John Wiley & Sons, Inc. п. 224 ISBN 978-0-471-62386-1 .
^ Arora PS, Yamagiwa H, Srivastava A, Bolander ME, Sarkar G (2005). «Сравнительная оценка двух двухмерных программных применений для анализа изображений гель-электрофореза с использованием синовиальных жидкостей от пациентов с заболеванием суставов». J Orthop Sci . 10 (2): 160–66. doi : 10.1007/s00776-004-0878-0 . PMID 15815863 . S2CID 45193214 .
^ Кан, Юни; Techanukul, Tanasit; Mantalaris, Anthanasios; Надь, Джудит М. (февраль 2009 г.). «Сравнение трех коммерчески доступных программных пакетов для анализа DIGE: минимальное пользовательское вмешательство в гелевую протеомику» . Журнал исследований протеома . 8 (2): 1077–1084. doi : 10.1021/pr800588f . ISSN 1535-3893 . PMID 19133722 .
^ Pedreschi R, Hertog ML, Carpentier SC, et al. (Апрель 2008 г.). «Лечение пропущенных значений для многомерного статистического анализа данных протеомики на основе геля». Протеомика . 8 (7): 1371–83. doi : 10.1002/pmic.200700975 . HDL : 1942/8262 . PMID 18383008 . S2CID 21152053 .
^ Что отсутствуют значения и почему они проблема?
^ «Программное обеспечение для анализа протеомики 2-D гель. | Samespots» . Тоталлаб . Получено 2024-07-08 .
^ Lepedda, Antonio J и Marilena Formato. «Применение двухмерного технологии электрофореза для изучения атеросклероза». Ejifcc vol. 19,3 146–159. 20 декабря 2008 г.
^ Barth M, Moser FM, Kolbe M, Bernhardt J (октябрь 2007 г.). «Состояние искусства в анализе двухмерных изображений электрофореза геля» . Приложение Микробиол. Биотехнол . 76 (6): 1223–43. doi : 10.1007/s00253-007-1128-0 . PMC 2279157 . PMID 17713763 .
^ Bandow JE, Baker JD, Barth M, et al. (Август 2008 г.). «Улучшенный рабочий процесс анализа изображений для двухмерных гелей обеспечивает крупномасштабные протеомические исследования на основе 2-D-исследование Biomarker Discovery». Протеомика . 8 (15): 3030–41. doi : 10.1002/pmic.200701184 . PMID 18618493 . S2CID 206361897 .

Внешние ссылки

Библиотечные ресурсы о
Двумерный гель-электрофорез

SAMESPOTS 2-D Протеомическое программное обеспечение.
JVirgel Создание виртуальных двухмерных гелей из данных последовательности.
GEL IQ Свободно загружаемый программный инструмент для оценки качества двухмерного гелевого анализа изображений.
2-D Electrophores

[1] О'Фаррелл, PH (1975). «Двумерный электрофорез с высоким разрешением белков» . Дж. Биол. Химический 250 (10): 4007–21. doi : 10.1016/s0021-9258 (19) 41496-8 . PMC 2874754 . PMID 236308 .

[2] Клос, Дж. (1975). «Картирование белка комбинированной изоэлектрической фокусировкой и электрофорезом тканей мыши. Новый подход к тестированию индуцированных точечных мутаций у млекопитающих» . Humangenetik . 26 (3): 231–43. doi : 10.1007/bf00281458 . PMID 1093965 . S2CID 30981877 .

[3] Switzer RC 3 -й, Merril CR, Shifrin S (1979). «Очень чувствительное пятно серебра для обнаружения белков и пептидов в полиакриламидных гелях». Аналитическая биохимия . 98 (1): 231–37. doi : 10.1016/0003-2697 (79) 90732-2 . PMID 94518 .

[4] Микельсен, Сьюзен; Cortón, Eduardo (2004). Биоаналитическая химия John Wiley & Sons, Inc. п. 224 ISBN 978-0-471-62386-1 .

[5] Arora PS, Yamagiwa H, Srivastava A, Bolander ME, Sarkar G (2005). «Сравнительная оценка двух двухмерных программных применений для анализа изображений гель-электрофореза с использованием синовиальных жидкостей от пациентов с заболеванием суставов». J Orthop Sci . 10 (2): 160–66. doi : 10.1007/s00776-004-0878-0 . PMID 15815863 . S2CID 45193214 .

[6] Кан, Юни; Techanukul, Tanasit; Mantalaris, Anthanasios; Надь, Джудит М. (февраль 2009 г.). «Сравнение трех коммерчески доступных программных пакетов для анализа DIGE: минимальное пользовательское вмешательство в гелевую протеомику» . Журнал исследований протеома . 8 (2): 1077–1084. doi : 10.1021/pr800588f . ISSN 1535-3893 . PMID 19133722 .

[7] Pedreschi R, Hertog ML, Carpentier SC, et al. (Апрель 2008 г.). «Лечение пропущенных значений для многомерного статистического анализа данных протеомики на основе геля». Протеомика . 8 (7): 1371–83. doi : 10.1002/pmic.200700975 . HDL : 1942/8262 . PMID 18383008 . S2CID 21152053 .

[8] Что отсутствуют значения и почему они проблема?

[9] «Программное обеспечение для анализа протеомики 2-D гель. | Samespots» . Тоталлаб . Получено 2024-07-08 .

[10] Lepedda, Antonio J и Marilena Formato. «Применение двухмерного технологии электрофореза для изучения атеросклероза». Ejifcc vol. 19,3 146–159. 20 декабря 2008 г.

[11] Barth M, Moser FM, Kolbe M, Bernhardt J (октябрь 2007 г.). «Состояние искусства в анализе двухмерных изображений электрофореза геля» . Приложение Микробиол. Биотехнол . 76 (6): 1223–43. doi : 10.1007/s00253-007-1128-0 . PMC 2279157 . PMID 17713763 .

[12] Bandow JE, Baker JD, Barth M, et al. (Август 2008 г.). «Улучшенный рабочий процесс анализа изображений для двухмерных гелей обеспечивает крупномасштабные протеомические исследования на основе 2-D-исследование Biomarker Discovery». Протеомика . 8 (15): 3030–41. doi : 10.1002/pmic.200701184 . PMID 18618493 . S2CID 206361897 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]

[ 11 ]

[ 12 ]

v Т и Электрофорез
История электрофореза
Методы	Аффинно -электрофорез Агарозный гель электрофорез Капиллярная электрохроматография Капиллярный электрофорез Диэлектрофорез Разница гель электрофорез Прерывистый электрофорез Электроблоттинг Электрохроматография Анализ смены электрофоретической мобильности Гелевый электрофорез Иммуноэлектрофорез Ионтофорез Изотахофорез Перемещающийся электрофорез Полиакриламидный гель электрофорез Гель-электрофорез с импульсным полетом Гель температуры электрофорез Двумерный гель-электрофорез
Приложения	ДНК лестница Разделение ДНК адсорбцией кремнезема Гелевой электрофорез нуклеиновых кислот Гелевой электрофорез белков Электрофорез сывороточного белка
Теория	Электрическая подвижность Изоэлектрическая фокусировка
Журналы	Электрофорез (журнал)
Категория Общеизвестное Аналитическая химия