Флуоресцентный микроскоп
Флуоресцентный микроскоп — это оптический микроскоп , который использует флуоресценцию вместо или в дополнение к рассеянию , отражению , затуханию или поглощению для изучения свойств органических или неорганических веществ. [ 1 ] [ 2 ] «Флуоресцентный микроскоп» относится к любому микроскопу, который использует флуоресценцию для создания изображения, будь то простая установка, такая как эпифлуоресцентный микроскоп, или более сложная конструкция, такая как конфокальный микроскоп , который использует оптические срезы для получения лучшего разрешения флуоресцентного изображения. . [ 3 ]
Принцип
[ редактировать ]Образец освещается светом определенной длины волны (или длин волн), который поглощается флуорофорами , заставляя их излучать свет с более длинными волнами (т. е. другого цвета, чем поглощаемый свет). Свет освещения отделяется от гораздо более слабой излучаемой флуоресценции с помощью спектрального фильтра излучения. Типичными компонентами флуоресцентного микроскопа являются источник света ( распространены ксеноновая дуговая или ртутная лампа ; более совершенные формы — мощные светодиоды и лазеры ), фильтр возбуждения , дихроичное зеркало (или дихроичный светоделитель ) и излучающий фильтр (см. рисунок ниже). Фильтры и дихроичный светоделитель выбираются в соответствии со спектральными характеристиками возбуждения и излучения флуорофора, используемого для маркировки образца. [ 1 ] Таким образом, одновременно визуализируется распределение одного флуорофора (цвета). Многоцветные изображения нескольких типов флуорофоров необходимо составлять путем объединения нескольких одноцветных изображений. [ 1 ]
Большинство используемых флуоресцентных микроскопов являются эпифлуоресцентными микроскопами, в которых возбуждение флуорофора и обнаружение флуоресценции осуществляются через один и тот же путь света (т.е. через объектив). Эти микроскопы широко используются в биологии и являются основой для более совершенных конструкций микроскопов, таких как конфокальный микроскоп и флуоресцентный микроскоп полного внутреннего отражения (TIRF).
Эпифлуоресцентная микроскопия
[ редактировать ]
Большинство флуоресцентных микроскопов, особенно тех, которые используются в науках о жизни , имеют эпифлуоресцентную конструкцию, показанную на схеме. Свет с длиной волны возбуждения освещает образец через объектив . Флуоресценция , излучаемая образцом, фокусируется на детекторе с помощью того же объектива, который используется для возбуждения; для большего разрешения потребуется объектив с более высокой числовой апертурой . Поскольку большая часть возбуждающего света проходит через образец, только отраженный возбуждающий свет достигает объектива вместе с испускаемым светом, и поэтому метод эпифлуоресценции обеспечивает высокое соотношение сигнал/шум. Дихроичный светоделитель действует как фильтр с определенной длиной волны, пропуская флуоресцентный свет к окуляру или детектору, но отражая любой оставшийся возбуждающий свет обратно к источнику. [ нужна ссылка ]
Источники света
[ редактировать ]Флуоресцентная микроскопия требует интенсивного, почти монохроматического освещения, которое не могут обеспечить некоторые широко распространенные источники света, такие как галогенные лампы . [ 4 ] Используются четыре основных типа источников света, в том числе ксеноновые дуговые лампы или ртутные лампы с фильтром возбуждения , лазеры , источники суперконтинуума и мощные светодиоды . Лазеры наиболее широко используются для более сложных методов флуоресцентной микроскопии, таких как конфокальная микроскопия и флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения, в то время как ксеноновые лампы, ртутные лампы и светодиоды с дихроичным фильтром возбуждения обычно используются для широкопольных эпифлуоресцентных микроскопов. Поместив две матрицы микролинз на путь освещения широкопольного эпифлуоресцентного микроскопа, [ 5 ] высокой равномерности освещения с коэффициентом вариации можно добиться 1-2%.
Подготовка проб
[ редактировать ]Отображает наложения четырех флуоресцентных каналов.
(b) Голубой: [флуоресценция PLL-A546] - общий контрастный краситель для визуализации поверхностей эукариотических клеток.
(в) Синий: [флуоресценция Хехста] - окрашивает ДНК, идентифицирует ядра.
(d) Красный: [автофлуоресценция хлорофилла] - расщепляет хлоропласты. [ 6 ]
Чтобы образец был пригоден для флуоресцентной микроскопии, он должен быть флуоресцентным. Существует несколько методов создания флуоресцентного образца; Основными методами являются маркировка флуоресцентными красителями или, в случае биологических образцов, экспрессия флуоресцентного белка . собственную флуоресценцию образца (т.е. автофлуоресценцию ). Альтернативно можно использовать [ 1 ] В науках о жизни флуоресцентная микроскопия является мощным инструментом, позволяющим специфично и чувствительно окрашивать образец с целью обнаружения распределения белков или других представляющих интерес молекул. В результате существует широкий спектр методов флуоресцентного окрашивания биологических образцов. [ нужна ссылка ]
Биологические флуоресцентные красители
[ редактировать ]Многие флуоресцентные красители были разработаны для целого ряда биологических молекул. Некоторые из них представляют собой небольшие молекулы, которые по своей природе флуоресцентны и связывают интересующую биологическую молекулу. Основными примерами являются пятна нуклеиновых кислот , такие как DAPI и Hoechst (возбуждаемые ультрафиолетовым светом), а также DRAQ5 и DRAQ7 (оптимально возбуждаемые красным светом), которые связывают малую бороздку ДНК , маркируя таким образом ядра клеток. Другие представляют собой лекарства, токсины или пептиды, которые связывают определенные клеточные структуры и были получены с помощью флуоресцентного репортера. Основным примером этого класса флуоресцентных красителей является фаллоидин , который используется для окрашивания актиновых волокон в млекопитающих клетках . Новый пептид, известный как гибридизирующий пептид коллагена , также можно конъюгировать с флуорофорами и использовать для окрашивания денатурированных коллагеновых волокон. Окрашивание стенок растительных клеток производят красителями или красителями, связывающими целлюлозу или пектин . Поиск флуоресцентных зондов с высокой специфичностью, которые также позволяют получать живые изображения растительных клеток, продолжается. [ 7 ]
Существует множество флуоресцентных молекул, называемых флуорофорами или флуорохромами, таких как флуоресцеин , Alexa Fluors или DyLight 488 , которые могут быть химически связаны с другой молекулой, которая связывает интересующую мишень в образце.
Иммунофлуоресценция
[ редактировать ]Иммунофлуоресценция — это метод, который использует высокоспецифическое связывание антитела с его антигеном для маркировки определенных белков или других молекул внутри клетки. Образец обрабатывают первичным антителом, специфичным к интересующей молекуле. Флуорофор можно напрямую конъюгировать с первичным антителом. Альтернативно можно использовать вторичное антитело , конъюгированное с флуорофором, которое специфически связывается с первым антителом. Например, первичное антитело, полученное у мыши и распознающее тубулин , в сочетании со вторичным антимышиным антителом, полученным с помощью флуорофора, можно использовать для мечения микротрубочек в клетке. [ нужна ссылка ]
Флуоресцентные белки
[ редактировать ]Современное понимание генетики и методы, доступные для модификации ДНК, позволяют ученым генетически модифицировать белки, чтобы они также содержали флуоресцентный белок-репортер. В биологических образцах это позволяет ученым напрямую сделать интересующий белок флуоресцентным. Затем местоположение белка можно будет напрямую отслеживать, в том числе в живых клетках.
Ограничения
[ редактировать ]Флуорофоры теряют способность флуоресцировать при освещении в процессе, называемом фотообесцвечиванием . Фотообесцвечивание происходит, когда флуоресцентные молекулы накапливают химические повреждения от электронов, возбужденных во время флуоресценции. Фотообесцвечивание может существенно ограничить время, в течение которого образец можно наблюдать с помощью флуоресцентной микроскопии. Существует несколько методов уменьшения фотообесцвечивания, таких как использование более надежных флуорофоров, минимизация освещения или использование фотозащитных химикатов- поглотителей . [ нужна ссылка ]
Флуоресцентная микроскопия с флуоресцентными репортерными белками позволила анализировать живые клетки с помощью флуоресцентной микроскопии, однако клетки чувствительны к фототоксичности, особенно коротковолновому свету. Кроме того, флуоресцентные молекулы имеют тенденцию генерировать химически активные соединения при освещении, что усиливает фототоксический эффект. [ нужна ссылка ]
В отличие от методов микроскопии в проходящем и отраженном свете, флуоресцентная микроскопия позволяет наблюдать только определенные структуры, помеченные для флуоресценции. Например, наблюдение образца ткани, приготовленного с помощью флуоресцентного окрашивания ДНК, с помощью флуоресцентной микроскопии выявляет только организацию ДНК внутри клеток и ничего больше не говорит о морфологии клеток.
Вычислительные методы, которые предлагают оценивать флуоресцентный сигнал по нефлуоресцентным изображениям (например, светлому полю), могут уменьшить эти проблемы. [ 8 ] В целом эти подходы включают обучение глубокой сверточной нейронной сети на окрашенных клетках и последующую оценку флуоресценции на неокрашенных образцах. Таким образом, отделив исследуемые клетки от клеток, используемых для обучения сети, визуализацию можно выполнять быстрее и с меньшей фототоксичностью.
Методы субдифракции
[ редактировать ]Волновая природа света ограничивает размер пятна, в которое может быть сфокусирован свет, из-за дифракционного предела . Это ограничение было описано в 19 веке Эрнстом Аббе и «ограничивает разрешение оптического микроскопа примерно половиной длины волны используемого света». Флуоресцентная микроскопия занимает центральное место во многих методах, целью которых является преодоление этого предела с помощью специализированных оптических конфигураций. [ нужна ссылка ]
В 20 веке было изобретено несколько усовершенствований в методах микроскопии, которые в некоторой степени привели к увеличению разрешения и контрастности. Однако они не преодолели дифракционный предел. В 1978 году были разработаны первые теоретические идеи, позволяющие преодолеть этот барьер путем использования микроскопа 4Pi в качестве конфокального лазерного сканирующего флуоресцентного микроскопа, где свет идеально фокусируется со всех сторон в общий фокус, который используется для сканирования объекта «поточечно». «точечное» возбуждение в сочетании с «поточечным» обнаружением. [ 9 ] Однако первая экспериментальная демонстрация 4пи-микроскопа состоялась в 1994 году. [ 10 ] Микроскопия 4Pi максимизирует количество доступных направлений фокусировки за счет использования двух противоположных объективов или микроскопии с двухфотонным возбуждением с использованием красного смещения света и многофотонного возбуждения. [ нужна ссылка ]
Интегрированная корреляционная микроскопия сочетает в себе флуоресцентный и электронный микроскоп. Это позволяет визуализировать ультраструктуру и контекстную информацию с помощью электронного микроскопа, используя данные флуоресцентного микроскопа в качестве инструмента маркировки. [ 11 ]
Первым методом, действительно достигшим субдифракционного разрешения, была STED-микроскопия , предложенная в 1994 году. Этот метод и все методы, следующие за концепцией RESOLFT, основаны на сильном нелинейном взаимодействии между светом и флуоресцирующими молекулами. Молекулы сильно перемещаются между различимыми молекулярными состояниями в каждом конкретном месте, так что, в конечном итоге, свет может излучаться только в небольшой части пространства, что приводит к увеличению разрешения.
Также в 1990-е годы был разработан еще один метод микроскопии сверхвысокого разрешения, основанный на широкопольной микроскопии. Существенно улучшенное размерное разрешение клеточных наноструктур, окрашенных флуоресцентным маркером, было достигнуто за счет развития локализационной СПДМ-микроскопии и структурированного лазерного освещения (пространственно-модулированное освещение, SMI). [ 12 ] Сочетание принципа SPDM с SMI привело к разработке микроскопа Vertico SMI . [ 13 ] [ 14 ] Обнаружение одиночной молекулы нормальных мигающих флуоресцентных красителей, таких как зеленый флуоресцентный белок (GFP), может быть достигнуто с помощью дальнейшего развития SPDM, так называемой технологии SPDMphymod, которая позволяет обнаруживать и подсчитывать два разных типа флуоресцентных молекул на молекулярном уровне (это технология называется двухцветной локализационной микроскопией или 2CLM). [ 15 ]
В качестве альтернативы, появление фотоактивируемой локализационной микроскопии могло бы достичь аналогичных результатов, полагаясь на мигание или переключение отдельных молекул, где доля флуоресцирующих молекул в каждый момент времени очень мала. Эта стохастическая реакция молекул на приложенный свет также соответствует сильно нелинейному взаимодействию, приводящему к субдифракционному разрешению.
Галерея флуоресцентных микрофотографий
[ редактировать ]-
Z-проекция клетки остеосаркомы, окрашенная фаллоидином для визуализации актиновых нитей. Изображение было получено на конфокальном микроскопе, а последующая деконволюция проводилась с использованием экспериментально полученной функции рассеяния точки. -
Эпифлуоресцентная визуализация трех компонентов делящейся раковой клетки человека. ДНК окрашена в синий цвет, белок INCENP — в зеленый, а микротрубочки — в красный. Каждый флуорофор визуализируется отдельно с использованием различной комбинации фильтров возбуждения и излучения, а изображения захватываются последовательно с помощью цифровой ПЗС-камеры , а затем накладываются друг на друга, чтобы получить полное изображение. -
Эндотелиальные клетки под микроскопом. Ядра окрашены в синий цвет DAPI, микротрубочки отмечены зеленым антителом, связанным с FITC, а актиновые нити помечены красным фаллоидином, связанным с TRITC. Эндотелиальные клетки легочной артерии крупного рогатого скота (BPAE) -
3D двухцветная микроскопия сверхвысокого разрешения с Her2 и Her3 в клетках молочной железы, стандартные красители: Alexa 488, Alexa 568. Микроскопия LIMON -
Ядро лимфоцита человека, окрашенное DAPI, с гибридизованными центромерными зондами хромосомы 13 (зеленый) и 21 (красный) ( флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)) -
Мембрана дрожжевых клеток визуализируется некоторыми мембранными белками, слитыми с флуоресцентными маркерами RFP и GFP. Наложение света от обоих маркеров приводит к желтому цвету. -
Микроскопия сверхвысокого разрешения: обнаружение одной молекулы YFP в раковой клетке человека. Типичные измерения расстояний в диапазоне 15 нм, измеренные с помощью микроскопа Vertico-SMI/SPDMphymod. -
Микроскопия сверхвысокого разрешения: микроскопия совместной локализации (2CLM) со слитыми белками GFP и RFP (ядро клетки рака кости) 120 000 локализованных молекул в области широкого поля (470 мкм) 2 ) измерено с помощью микроскопа Vertico-SMI/SPDMphymod. -
Флуоресцентная микроскопия экспрессии ДНК у человека дикого типа и мутанта P239S Палладина . -
Изображения флуоресцентной микроскопии патологии солнечных вспышек в клетках крови, показывающие пораженные участки красным цветом.
См. также
[ редактировать ]- Корреляционная светоэлектронная микроскопия
- Элизабет Гарри , пионер методов флуоресцентной микроскопии для визуализации бактериальных субклеточных белков.
- Флуоресцентная визуализация
- Флуоресценция в науках о жизни
- Зеленый флуоресцентный белок (GFP)
- Ртутная лампа
- Микроскоп
- Сканирующий электронный микроскоп § Катодолюминесценция
- сдвиг Стокса
- Ксеноновая дуговая лампа
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Перейти обратно: а б с д Спринг КР, Дэвидсон М.В. «Введение в флуоресцентную микроскопию» . Никонская микроскопияУ . Проверено 28 сентября 2008 г.
- ^ «Флуоресцентный микроскоп» . Микроскопы помогают ученым исследовать скрытые миры . Нобелевский фонд . Проверено 28 сентября 2008 г.
- ^ Хуан Карлос Стокерт, Альфонсо Бласкес-Кастро (2017). Флуоресцентная микроскопия в науках о жизни . Издательство Bentham Science. ISBN 978-1-68108-519-7 . Архивировано из оригинала 14 мая 2019 года . Проверено 17 декабря 2017 г.
- ^ Хуан Б. (март 2010 г.). «Флуоресцентная микроскопия сверхразрешения» . Ежегодный обзор биохимии . 78 : 993–1016. doi : 10.1146/annurev.biochem.77.061906.092014 . ПМЦ 2835776 . ПМИД 19489737 .
- ^ ФАВ Куманс; Э. ван дер Пол; LWMM Терстаппен (2012). «Профиль освещения с плоской вершиной в эпифлуоресцентном микроскопе с помощью двойной матрицы микролинз» . Цитометрия Часть А. 81 (4): 324–331. дои : 10.1002/cyto.a.22029 . ПМИД 22392641 . S2CID 13812696 .
- ^ Колин С., Коэльо Л.П., Сунагава С., Боулер К., Карсенти Э., Борк П., Пепперкок Р. и Де Варгас К. (2017) «Количественная 3D-визуализация клеток биология и экология экологических микробных эукариот». eLife , 6 : e26066. два : 10.7554/eLife.26066.002 .
Материал был скопирован из этого источника, который доступен по международной лицензии Creative Commons Attribution 4.0 .
- ^ Биденди, Эй Джей; Чебли, Ю; Гейтманн, А. (май 2020 г.). «Флуоресцентная визуализация целлюлозы и пектина в первичной клеточной стенке растений». Журнал микроскопии . 278 (3): 164–181. дои : 10.1111/jmi.12895 . ПМИД 32270489 . S2CID 215619998 .
- ^ Кандель Михаил Евгеньевич; Он, Ючен Р.; Ли, Ён Джэ; Чен, Тейлор Сюань-Ю; Салливан, Кэтрин Мишель; Айдын, Онур; Саиф, М. Тахер А.; Конг, Хёнджун; Собх, Нахиль; Попеску, Габриэль (2020). «Фазовая визуализация с вычислительной специфичностью (PICS) для измерения изменений сухой массы в субклеточных компартментах» . Природные коммуникации . 11 (1): 6256. arXiv : 2002.08361 . Бибкод : 2020NatCo..11.6256K . дои : 10.1038/s41467-020-20062-x . ПМЦ 7721808 . ПМИД 33288761 . S2CID 212725023 .
- ^ Кремер, К; Кремер, Т. (1978). «Соображения относительно лазерного сканирующего микроскопа с высоким разрешением и глубиной резкости» (PDF) . Микроскопика Акта . 81 (1): 31–44. ПМИД 713859 . Архивировано из оригинала (PDF) 4 марта 2016 года . Проверено 12 августа 2013 г.
- ^ С.В. Хелл, ЭХК Стельцер, С. Линдек, К. Кремер; Штельцер; Линдек; Кремер (1994). «Конфокальная микроскопия с увеличенной апертурой обнаружения: конфокальная микроскопия типа B 4Pi». Оптические письма . 19 (3): 222–224. Бибкод : 1994OptL...19..222H . CiteSeerX 10.1.1.501.598 . дои : 10.1364/OL.19.000222 . ПМИД 19829598 .
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ) - ^ Барле, Кейтлин ван. «Корреляционная микроскопия: открывая мир информации с помощью флуоресценции» . Проверено 16 февраля 2017 г.
- ^ Хаусманн, Майкл; Шнайдер, Бернхард; Брэдл, Иоахим; Кремер, Кристоф Г. (1997), «Высокоточная дистанционная микроскопия трехмерных наноструктур с помощью флуоресцентного микроскопа с пространственно-модулированным возбуждением» (PDF) , в Биджио, Ирвинг Дж.; Шнекенбургер, Герберт; Славик, Ян; и др. (ред.), Оптическая биопсия и микроскопические методы II , том. 3197, с. 217, doi : 10.1117/12.297969 , S2CID 49339042 , заархивировано из оригинала (PDF) 4 марта 2016 г. , получено 12 августа 2013 г.
- ^ Рейманн, Дж; Бэддели, Д; Гункель, М; Леммер, П; Штадтер, В; Джегу, Т; Риппе, К; Кремер, К; Бирк, Ю (2008). «Высокоточный структурный анализ субъядерных комплексов в фиксированных и живых клетках с помощью микроскопии с пространственно-модулированным освещением (SMI)» (PDF) . Хромосомные исследования . 16 (3): 367–82. дои : 10.1007/s10577-008-1238-2 . ПМИД 18461478 . S2CID 22811346 . Архивировано из оригинала (PDF) 4 марта 2016 года . Проверено 12 августа 2013 г.
- ^ Бэддели, Д; Батрам, К; Вейланд, Ю; Кремер, К; Бирк, UJ (2003). «Анализ наноструктур с использованием микроскопии с пространственно-модулированным освещением» (PDF) . Протоколы природы . 2 (10): 2640–6. дои : 10.1038/nprot.2007.399 . ПМИД 17948007 . S2CID 22042676 . [ мертвая ссылка ]
- ^ Гункель, М; Эрдель, Ф; Риппе, К; Леммер, П; Кауфманн, Р; Хёрманн, К; Амбергер, Р; Кремер, К. (2009). «Двухцветная локализационная микроскопия клеточных наноструктур» (PDF) . Биотехнологический журнал . 4 (6): 927–38. дои : 10.1002/biot.200900005 . ПМИД 19548231 . S2CID 18162278 . Архивировано из оригинала (PDF) 4 марта 2016 года . Проверено 12 августа 2013 г.
Внешние ссылки
[ редактировать ]
- Fluorophores.org [ постоянная мертвая ссылка ] , база данных флуоресцентных красителей
- Ресурсный центр по микроскопии. Архивировано 22 октября 2014 г. в Wayback Machine.
- анимация и пояснения по различным типам микроскопов, включая флуоресцентные и конфокальные микроскопы (Université Paris Sud)
| Освещение и контрастные методы |
|  |
|---|---|---|
| Флуоресцентные методы | ||
| субдифракция предельные методы | ||
| Базы данных органов управления : Национальные |
|---|
