Флуоресцентный микроскоп
Флуоресцентный микроскоп - это оптический микроскоп , который использует флуоресценцию вместо или в дополнение к рассеянию , отражению и ослаблению или поглощению , для изучения свойств органических или неорганических веществ. [ 1 ] [ 2 ] «Флуоресцентный микроскоп» относится к любому микроскопу, который использует флуоресценцию для генерации изображения, будь то простая настройка, например, эпифлуоресцентный микроскоп или более сложный конструкция, такой как конфокальный микроскоп , который использует оптическое разрешение для получения лучшего разрешения изображения флуоресценции Полем [ 3 ]
Принцип
[ редактировать ]Образец освещается светом определенной длины волны (или длины волн), который поглощается флуорофорами , заставляя их излучать свет более длинных длин волн (то есть от другого цвета, чем поглощенный свет). Свет освещения отделяется от гораздо более слабой излучаемой флуоресценции за счет использования спектрального эмиссионного фильтра. Типичными компонентами флуоресцентного микроскопа являются источник света ( ксеноновая дуговая лампа или лампа ртути распространены; более продвинутые формы являются мощными светодиодами и лазерами ), фильтр возбуждения , дихроичное зеркало ( дихроичный или луче Фильтр (см. Рисунок ниже). Фильтры и дихроичный пучков выбираются для соответствия спектральным характеристикам возбуждения и излучения флуорофора, используемого для маркировки образца. [ 1 ] Таким образом, распределение одного флуорофора (цвет) отображается одновременно. Многоцветные изображения нескольких типов флуорофоров должны быть составлены путем объединения нескольких одноцветных изображений. [ 1 ]
Большинство используемых флуоресцентных микроскопов представляют собой эпифлуоресцентные микроскопы, где возбуждение флуорофора и обнаружение флуоресценции осуществляются с помощью одного и того же светового пути (т.е. через цель). Эти микроскопы широко используются в биологии и являются основой для более продвинутых конструкций микроскопа, таких как конфокальный микроскоп и общий флуоресцентный микроскоп внутреннего отражения (TIRF).
Эпифлуоресцентная микроскопия
[ редактировать ]
Большинство флуоресцентных микроскопов, особенно тех, которые используются в науках о жизни , имеют эпифлуоресцентную конструкцию, показанную на диаграмме. Свет длины волны возбуждения освещает образец через объективную линзу. Флуоресценция , излучаемая образцом, сосредоточена на детекторе с помощью той же цели, которая используется для возбуждения, которое для большего разрешения потребует объектива объектива с более высокой численной апертурой . Поскольку большая часть света возбуждения передается через образцы, только отраженный возбуждающий свет достигает цели вместе с испускаемым светом, а метод эпифлуоресценции, следовательно, дает высокое отношение сигнал / шум. Дихроичный лучевой ссаживание действует как специфический фильтр длины волны, передающий флуоресцентный свет через окулярный или детектор, но отражает любой оставшийся свет возбуждения обратно в сторону источника. [ Цитация необходима ]
Источники света
[ редактировать ]Флуоресцентная микроскопия требует интенсивного, почти монохроматического освещения, которое не могут обеспечить некоторые широко распространенные источники света, такие как галогенные лампы . [ 4 ] Используются четыре основных типа источника света, в том числе ксеноновые дуговые лампы или лампы ртути с фильтром возбуждения , лазеры , источники суперконтуальных источников и мощные светодиоды . Лазеры наиболее широко используются для более сложных методов флуоресцентной микроскопии, таких как конфокальная микроскопия и общая флуоресцентная микроскопия внутреннего отражения, в то время как ксеноновые лампы и ртутные лампы, а также светодиоды с дихроичным фильтром возбуждения обычно используются для эпифлуоресцентных микроскопов. Поместив два массива микролинза в путь освещения широкоподобного эпифлуоресцентного микроскопа, [ 5 ] высоконимерного освещения с коэффициентом вариации Можно достичь 1-2%.
Приготовление образца
[ редактировать ]Отображает наложения из четырех флуоресцентных каналов
(B) Cyan: [PLL -A546 флуоресценция] - общая контратака для визуализации поверхностей эукариотических клеток
(c) Синий: [Hoechst Fluorescencess] - ДНК пятна, идентифицирует ядра
(D) Красный: [АВТОФЛУАРЕССОВАНИЕ ХОЛОФИЛЛЯ [ 6 ]
Чтобы образец был подходящим для флуоресцентной микроскопии, он должен быть флуоресцентным. Есть несколько методов создания флуоресцентного образца; Основными методами являются маркировка флуоресцентными пятнами или, в случае биологических образцов, экспрессией флуоресцентного белка . внутреннюю флуоресценцию образца (т. Е. Автофлуоресценция ). В качестве альтернативы можно использовать [ 1 ] В научных науках флуоресцентная микроскопия является мощным инструментом, который позволяет специфическому и чувствительному окрашиванию образца, чтобы обнаружить распределение белков или других интересующих молекул. В результате существует множество методов флуоресцентного окрашивания биологических образцов. [ Цитация необходима ]
Биологические флуоресцентные пятна
[ редактировать ]Многие флуоресцентные пятна были разработаны для ряда биологических молекул. Некоторые из них представляют собой небольшие молекулы, которые по своей природе являются флуоресцентными и связывают биологическую молекулу, представляющую интерес. Основными примерами этого являются пятна нуклеиновых кислот , такие как DAPI и Hoechst (возбужденный светом ультрафиолетовой длины), а также DRAQ5 и DRAQ7 (оптимально возбуждая красным светом), которые все связывают незначительную канавку ДНК , таким образом, маркируя ядра клеток. Другие - это лекарства, токсины или пептиды, которые связывают специфические клеточные структуры и были дериватизированы флуоресцентным репортером. Основным примером этого класса флуоресцентного окрашивания является фаллоидин , который используется для окрашивания актиновых волокон в млекопитающих клетках . Новый пептид, известный как гибридизирующий пептид коллагена , также может быть конъюгирован с флуорофорами и используется для окрашивания денатурированных коллагеновых волокон. Окрашивание растений клеточных стен выполняется с использованием пятен или красителей, которые связывают целлюлозу или пектин . Поиск флуоресцентных зондов с высокой специфичностью, которая также позволяет живой визуализации растительных клеток. [ 7 ]
Существует много флуоресцентных молекул, называемых флуорофорами или флуорохромами, такими как флуоресцеин , Alexa Fluors или Dylight 488 , которые могут быть химически связаны с другой молекулой, которая связывает интересующую мишень в образце.
Иммунофлуоресценция
[ редактировать ]Иммунофлуоресценция - это метод, который использует очень специфическое связывание антитела со своим антигеном для маркировки специфических белков или других молекул в клетке. Образец обрабатывается первичным антителом, специфичным для интересующей молекулы. Флуорофор может быть непосредственно конъюгирован с первичным антителом. В качестве альтернативы можно использовать вторичное антитело , конъюгированное с флуорофором, которое специально связывается с первым антителом. Например, первичное антитело, поднятое у мыши, которое распознает тубулин в сочетании с вторичным антиммуным антителом, дериватизированным флуорофором, можно использовать для маркировки микротрубочек в клетке. [ Цитация необходима ]
Флуоресцентные белки
[ редактировать ]Современное понимание генетики и методов, доступных для модификации ДНК, позволяет ученым генетически модифицировать белки, чтобы также носить репортер флуоресцентного белка. В биологических образцах это позволяет ученому напрямую делать интересный белок флуоресцентно. Местоположение белка может затем быть непосредственно отслежено, в том числе в живых клетках.
Ограничения
[ редактировать ]Флуорофоры теряют свою способность к флуоресции, поскольку они освещены в процессе, называемом фотообесцвечиванием . Флуоресцентное молекулы происходит, когда флуоресцентные молекулы накапливают химические повреждения от электронов, возбужденных во время флуоресценции. Фотобличков может серьезно ограничить время, в течение которого образец может наблюдаться с помощью флуоресцентной микроскопии. Существует несколько методов, чтобы уменьшить фотообесцентрирование, такие как использование более надежных флуорофоров, путем минимизации освещения или с использованием фотозащитных химикатов мусорщика . [ Цитация необходима ]
Флуоресцентная микроскопия с флуоресцентными репортерными белками позволила анализировать живые клетки с помощью флуоресцентной микроскопии, однако клетки подвержены фототоксичности, особенно при короткой длине волны. Кроме того, флуоресцентные молекулы имеют тенденцию генерировать реактивные химические виды при освещении, что усиливает фототоксичный эффект. [ Цитация необходима ]
В отличие от передачи и отраженных методов световой микроскопии, флуоресцентная микроскопия позволяет только наблюдать специфические структуры, которые были помечены для флуоресценции. Например, наблюдение за образцом ткани, приготовленного с флуоресцентным окрашиванием ДНК с помощью флуоресцентной микроскопии только выявляет организацию ДНК в клетках и не выявляет ничего и другого о морфологии клеток.
Вычислительные методы, которые предлагают оценить флуоресцентный сигнал из нефлюоресцентных изображений (таких как Brightfield), могут уменьшить эти проблемы. [ 8 ] В целом, эти подходы включают в себя обучение глубокой сверточной нейронной сети на окрашенных клетках, а затем оценивают флуоресценцию на неокрашенных образцах. Таким образом, путем отделения исследуемых ячеек из ячеек, используемых для обучения сети, визуализация может работать быстрее и с пониженной фототоксичностью.
Методы подразделения
[ редактировать ]Волновая природа света ограничивает размер пятна, на которое можно сфокусировать свет из -за предела дифракции . Это ограничение было описано в 19 веке Эрнстом Аббе и «ограничивает разрешение оптического микроскопа примерно до половины длины волны используемого света». Флуоресцентная микроскопия является центральной для многих методов, которые направлены на достижение этого предела с помощью специализированных оптических конфигураций. [ Цитация необходима ]
Несколько улучшений в методах микроскопии были изобретены в 20 -м веке и привели к увеличению разрешения и в некоторой степени контрастировать. Однако они не преодолели предел дифракции. В 1978 году были разработаны первые теоретические идеи, чтобы преодолеть этот барьер, используя микроскоп 4PI в качестве конфокального лазерного сканирующего флуоресцентного микроскопа, где свет идеально сфокусирован от всех сторон до общего фокуса, который используется для сканирования объекта по точечным пустям. Точка «возбуждение в сочетании с обнаружением« точка на точке ». [ 9 ] Однако первая экспериментальная демонстрация микроскопа 4PI состоялась в 1994 году. [ 10 ] 4PI-микроскопия максимизирует количество доступных направлений фокусировки, используя две противоположные объективы или двухфотонную возбуждающую микроскопию с использованием красного смещения света и мультифотонного возбуждения. [ Цитация необходима ]
Интегрированная коррелятивная микроскопия объединяет флуоресцентный микроскоп с электронным микроскопом. Это позволяет визуализировать ультраструктуру и контекстную информацию с помощью электронного микроскопа при использовании данных из флуоресцентного микроскопа в качестве инструмента маркировки. [ 11 ]
Первым методом, направленным на то, чтобы действительно достичь разрешения субмадромного диапазона была микроскопия STED , предложенная в 1994 году. Этот метод и все методы после концепции разрешения зависят от сильного нелинейного взаимодействия между светом и флуоресцирующими молекулами. Молекулы сильно проводятся между различимыми молекулярными состояниями в каждом конкретном месте, так что, наконец, свет может быть излучен только на небольшой доли пространства, следовательно, повышенное разрешение.
Также в 1990 -х годах был разработан еще один метод микроскопии суперрезоляции, основанный на широкой полевой микроскопии. Значительно улучшенное разрешение размера клеточных наноструктур, окрашенных флуоресцентным маркером, было достигнуто путем развития микроскопии локализации SPDM и структурированного лазерного освещения (пространственно модулированное освещение, SMI). [ 12 ] Сочетание принципа SPDM с SMI привело к развитию микроскопа Vertico SMI . [ 13 ] [ 14 ] Одномолекула обнаружение нормальных мигающих флуоресцентных красителей, таких как зеленый флуоресцентный белок (GFP), может быть достигнуто с использованием дальнейшего развития SPDM так называемой технологии SPDMphymod, которая позволяет обнаружить и считать два различных типа флуоресцентных молекул на молекулярном уровне (это Технология называется двухцветной микроскопией локализации или 2CLM). [ 15 ]
Альтернативно, появление фотоактивированной локализационной микроскопии может достичь аналогичных результатов, полагаясь на мигание или переключение отдельных молекул, где доля флуоресцирующих молекул в каждый раз очень мала. Этот стохастический отклик молекул на приложенном свете также соответствует сильно нелинейному взаимодействию, что приводит к разрешению подразделения.
Флуоресцентная микрофотография галерея
[ редактировать ]-
Z-проекция клетки остеосаркомы, окрашенная фаллоидином для визуализации актиновых филаментов. Изображение было снято на конфокальном микроскопе, и последующая деконволюция была выполнена с использованием экспериментально полученной функции разброса точки. -
Эпифлуоресцентная визуализация трех компонентов в разделении раковой клетки человека. ДНК окрашивается синим, белок, называемый incenp , является зеленым, а микротрубочки красные. Каждый флуорофор визуализируется отдельно с использованием различной комбинации фильтров возбуждения и эмиссии, и изображения снимаются последовательно с использованием цифровой CCD -камеры , а затем наложены на получение полного изображения. -
Эндотелиальные клетки под микроскопом. Ядра окрашиваются синими с помощью DAPI, микротрубочки отмечены зелеными с помощью антитела, связанного с FITC, а актиновые филаменты мечены красным цветом с помощью фаллоидина, связанного с TRITC. Клетки эндотелиальных (BPAE) бычьей легочной артерии (BPAE) -
Трехмерная микроскопия с двойным разрешением с двойным разрешением с HER2 и HER3 в клетках молочной железы, стандартные красители: Alexa 488, Alexa 568. Лимонская микроскопия -
Ядро лимфоцитов человека, окрашенное DAPI с хромосомой 13 (зеленый) и 21 (красный) Центромерные зонды, гибридизованные ( флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)) -
Мембрана дрожжевых клеток, визуализированная некоторыми мембранными белками, слитыми с флуоресцентными маркерами RFP и GFP. Навязывание света из обоих маркеров приводит к желтому цвету. -
Микроскопия сверхразрешения: однократное обнаружение молекул YFP в раковой клетке человека. Типичные измерения расстояния в диапазоне 15 нм, измеренные с помощью микроскопа Vertico-SMI/SPDMPHYMOD -
Микроскопия суперрелюции: микроскопия копатизации (2CLM) с слитых белками GFP и RFP (ядро клетки рака кости) 120 000 локализованных молекул в широкополе (470 мкМ 2 ) измерен с помощью микроскопа Vertico-SMI/SPDMPHYMOD -
Флуоресцентная микроскопия экспрессии ДНК у мутанта дикого типа человека и p239S . -
Флуоресцентная микроскопия изображения солнечной патологии в клетке крови показывают пораженные участки красного цвета.
Смотрите также
[ редактировать ]- Корреляционная светоэлектронная микроскопия
- Элизабет Гарри , пионер методов флуоресцентной микроскопии для визуализации бактериальных субклеточных белков
- Флуоресцентная визуализация
- Флуоресценция в науках о жизни
- Зеленый флуоресцентный белок (GFP)
- Ртуть лампа
- Микроскоп
- Сканирующий электронный микроскоп § Катодолюминесценция
- Стокс сдвигается
- Ксенонная дуговая лампа
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а беременный в дюймовый Весна К.Р., Дэвидсон М.В. «Введение в флуоресцентную микроскопию» . Nikon Microscopyu . Получено 28 сентября 2008 года .
- ^ «Флуоресцентный микроскоп» . Микроскопы - ученые исследуют скрытые миры . Нобелевский фонд . Получено 28 сентября 2008 года .
- ^ Хуан Карлос Стокерт, Альфонсо Бласкес-Кастро (2017). Флуоресцентная микроскопия в науках о жизни . Bentham Science Publishers. ISBN 978-1-68108-519-7 Полем Архивировано из оригинала 14 мая 2019 года . Получено 17 декабря 2017 года .
- ^ Huang B (март 2010 г.). «Флуоресцентная микроскопия супер разрешения» . Ежегодный обзор биохимии . 78 : 993–1016. doi : 10.1146/annurev.biochem.77.061906.092014 . PMC 2835776 . PMID 19489737 .
- ^ Faw Coumans; Э. ван дер Пол; LWMM Terstappen (2012). «Профиль освещения плоской вершины в эпизо-флуоресцентном микроскопе с помощью двух микрообруметочных массивов» . Цитометрия часть а . 81 (4): 324–331. doi : 10.1002/cyto.a.22029 . PMID 22392641 . S2CID 13812696 .
- ^ Colin, S., Coelho, LP, Sunagawa, S., Bowler, C., Karsenti, E., Bork, P., Pepperkok, R. and de Vargas, C. (2017) "Количественное 3D-изображение для клетки Биология и экология экологических микробных эукариот ». Elife , 6 : E26066. два : 10.7554/elife.26066.002 .
Материал был скопирован из этого источника, который доступен по международной лицензии Creative Commons Attribution 4.0 .
- ^ Bidhendi, AJ; Chebli, y; Geitmann, A (май 2020). «Визуализация флуоресценции целлюлозы и пектина в первичной клеточной стенке растений». Журнал микроскопии . 278 (3): 164–181. doi : 10.1111/jmi.12895 . PMID 32270489 . S2CID 215619998 .
- ^ Кандель, Михаил Э.; Он, Ючен Р.; Ли, Янг Чжэ; Чен, Тейлор Хсуань-Ю; Салливан, Кэтрин Мишель; Айдин, Онур; Саиф, М. Тахер А.; Конг, Хёнджун; Собх, Нахил; Попеску, Габриэль (2020). «Фазовая визуализация с вычислительной специфичностью (PICS) для измерения изменений сухой массы в субклеточных компартментах» . Природная связь . 11 (1): 6256. Arxiv : 2002.08361 . Bibcode : 2020natco..11.6256k . doi : 10.1038/s41467-020-20062-x . PMC 7721808 . PMID 33288761 . S2CID 212725023 .
- ^ Cremer, c; Cremer, T (1978). «Соображения по лазерному сканированию-микроскопе с высоким разрешением и глубиной поля» (PDF) . Microscopica Acta . 81 (1): 31–44. PMID 713859 . Архивировано из оригинала (PDF) 4 марта 2016 года . Получено 12 августа 2013 года .
- ^ SW Hell, EHK Stelzer, S. Lindek, C. Cremer; Стелцер; Линдек; Кремер (1994). «Конфокальная микроскопия с повышенной апертурой обнаружения: конфокальная микроскопия типа B 4PI». Оптические письма . 19 (3): 222–224. Bibcode : 1994optl ... 19..222h . Citeseerx 10.1.1.501.598 . doi : 10.1364/ol.19.000222 . PMID 19829598 .
{{cite journal}}: Cs1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ) - ^ Баарле, Кейтлин Ван. «Корреляционная микроскопия: открытие миров информации с флуоресценцией» . Получено 16 февраля 2017 года .
- ^ Хаусманн, Майкл; Шнайдер, Бернхард; Брэдл, Йоахим; Cremer, Christoph G. (1997), «Высокая дистанционная микроскопия трехмерных наноструктур с помощью пространственно модулируемого возбуждения флуоресцентного микроскопа» (PDF) , в Bigio, Irving J; Schneckenburger, Герберт; Славик, Ян; и др. (ред.), Оптические биопсии и микроскопические методы II , Vol. 3197, с. 217, doi : 10.1117/12.297969 , S2CID 49339042 , архивировано из оригинала (PDF) 4 марта 2016 года , полученная 12 августа 2013 г.
- ^ Рейманн, J; Baddeley, D; Гункель, м; Леммер, P; Stadter, w; Джегу, т; Rippe, K; Cremer, c; Birk, U (2008). «Высокий структурный анализ субнуклеарных комплексов в фиксированных и живых клетках посредством пространственно модулированной микроскопии освещения (SMI)» (PDF) . Исследование хромосом . 16 (3): 367–82. doi : 10.1007/s10577-008-1238-2 . PMID 18461478 . S2CID 22811346 . Архивировано из оригинала (PDF) 4 марта 2016 года . Получено 12 августа 2013 года .
- ^ Baddeley, D; Batram, C; Вейланд, y; Cremer, c; Бирк, UJ (2003). «Анализ наноструктуры с использованием пространственно модулированной микроскопии освещения» (PDF) . Природные протоколы . 2 (10): 2640–6. doi : 10.1038/nprot.2007.399 . PMID 17948007 . S2CID 22042676 . [ мертвая ссылка ]
- ^ Гункель, м; Эрдель, F; Rippe, K; Леммер, P; Кауфманн, R; Hörmann, C; Amberger, R; Cremer, C (2009). «Двухцветная локализационная микроскопия клеточных наноструктур» (PDF) . Биотехнологический журнал . 4 (6): 927–38. doi : 10.1002/biot.200900005 . PMID 19548231 . S2CID 18162278 . Архивировано из оригинала (PDF) 4 марта 2016 года . Получено 12 августа 2013 года .
Внешние ссылки
[ редактировать ]
- Fluorophores.org [ Постоянная мертвая ссылка ] , база данных флуоресцентных красителей
- Микроскопический ресурсный центр архивировал 22 октября 2014 года на машине Wayback
- Анимации и объяснения различных типов микроскопов, включая флуоресцентные и конфокальные микроскопы (Université Paris Sud)
| Освещение и контрастные методы |
|  |
|---|---|---|
| Методы флуоресценции | ||
| Субмарикация Ограниченные методы | ||
