Флуоресцентная спектроскопия
Флуоресцентная спектроскопия (также известная как флуориметрия или спектрофлюорометрия ) — это тип электромагнитной спектроскопии , который анализирует флуоресценцию образца. Он предполагает использование луча света, обычно ультрафиолетового , который возбуждает электроны в молекулах определенных соединений и заставляет их излучать свет; обычно, но не обязательно, видимый свет . Дополнительным методом является абсорбционная спектроскопия . В частном случае флуоресцентной спектроскопии одиночных молекул флуктуации интенсивности излучаемого света измеряются либо от одиночных флуорофоров, либо от пар флуорофоров.
Приборы, измеряющие флуоресценцию, называются флуориметрами .
Теория
[ редактировать ]Молекулы имеют различные состояния, называемые энергетическими уровнями . Флуоресцентная спектроскопия в первую очередь занимается электронными и колебательными состояниями. Как правило, исследуемый вид имеет представляющее интерес основное электронное состояние (состояние с низкой энергией) и возбужденное электронное состояние с более высокой энергией. Внутри каждого из этих электронных состояний существуют различные колебательные состояния. [ 1 ]
При флуоресценции вид сначала возбуждается путем поглощения фотона из основного электронного состояния в одно из различных колебательных состояний в возбужденном электронном состоянии. Столкновения с другими молекулами заставляют возбужденную молекулу терять колебательную энергию до тех пор, пока она не достигнет самого низкого колебательного состояния из возбужденного электронного состояния. Этот процесс часто визуализируют с помощью диаграммы Яблонского . [ 1 ]
Затем молекула снова опускается на один из различных колебательных уровней основного электронного состояния, испуская при этом фотон. [ 1 ] Поскольку молекулы могут опускаться на любой из нескольких колебательных уровней основного состояния, испускаемые фотоны будут иметь разные энергии и, следовательно, частоты. Следовательно, анализируя различные частоты света, излучаемого при флуоресцентной спектроскопии, а также их относительную интенсивность, можно определить структуру различных колебательных уровней.
Для атомарных видов процесс аналогичен; однако, поскольку атомные виды не имеют колебательных уровней энергии, испускаемые фотоны часто имеют ту же длину волны, что и падающее излучение. Этот процесс повторного испускания поглощенного фотона называется «резонансной флуоресценцией», и, хотя он характерен для атомной флуоресценции, он также наблюдается и в молекулярной флуоресценции. [ 2 ]
При типичном измерении флуоресценции (эмиссии) длина волны возбуждения фиксирована, а длина волны обнаружения варьируется, тогда как при измерении возбуждения флуоресценции длина волны обнаружения фиксирована, а длина волны возбуждения варьируется в интересующей области. Карта излучения измеряется путем записи спектров излучения, возникающих в диапазоне длин волн возбуждения, и объединения их всех вместе. Это трехмерный набор данных о поверхности: интенсивность излучения как функция длин волн возбуждения и излучения, который обычно изображается в виде контурной карты.
Инструментарий
[ редактировать ]Существуют два основных типа приборов: флуорометры с фильтрами , в которых используются фильтры для изоляции падающего света и флуоресцентного света, и спектрофлуориметры , в которых используются с дифракционной решеткой монохроматоры для изоляции падающего света и флуоресцентного света.
Оба типа используют следующую схему: свет от источника возбуждения проходит через фильтр или монохроматор и попадает на образец. Часть падающего света поглощается образцом, а некоторые молекулы в образце флуоресцируют. Флуоресцентный свет излучается во всех направлениях. Часть этого флуоресцентного света проходит через второй фильтр или монохроматор и достигает детектора, который обычно располагается под углом 90° к лучу падающего света, чтобы минимизировать риск попадания прошедшего или отраженного падающего света на детектор.
В качестве источников возбуждения могут использоваться различные источники света, в том числе лазеры, светодиоды и лампы; ксеноновые дуги и ртутные лампы в частности . Лазер излучает свет высокой интенсивности излучения только в очень узком интервале длин волн, обычно менее 0,01 нм, что делает ненужным монохроматор возбуждения или фильтр. Недостатком этого метода является то, что длину волны лазера невозможно существенно изменить. Ртутная лампа представляет собой линейную лампу, то есть она излучает свет с пиковыми длинами волн. Напротив, ксеноновая дуга имеет непрерывный спектр излучения с почти постоянной интенсивностью в диапазоне 300–800 нм и достаточную интенсивность излучения для измерений вплоть до чуть выше 200 нм.
Во флуориметрах можно использовать фильтры и/или монохроматоры. Монохроматор передает свет регулируемой длины волны с регулируемым допуском. В наиболее распространенном типе монохроматора используется дифракционная решетка, то есть коллимированный свет освещает решетку и выходит под разным углом в зависимости от длины волны. Затем монохроматор можно настроить, чтобы выбрать длину волны для передачи. Для обеспечения возможности измерения анизотропии необходимо добавить два поляризационных фильтра: один после монохроматора или фильтра возбуждения и один перед монохроматором или фильтром излучения.
Как упоминалось ранее, флуоресценцию чаще всего измеряют под углом 90° относительно возбуждающего света. Эта геометрия используется вместо размещения датчика на линии возбуждающего света под углом 180°, чтобы избежать интерференции передаваемого возбуждающего света. Ни один монохроматор не идеален и будет передавать некоторое количество рассеянного света , то есть света с длинами волн, отличными от заданных. Идеальный монохроматор должен передавать свет только в указанном диапазоне и иметь высокую передачу, независимую от длины волны. При измерении под углом 90° только свет, рассеянный образцом, вызывает рассеянный свет. Это приводит к лучшему соотношению сигнал/шум и снижает предел обнаружения примерно в 10 000 раз. [ 3 ] по сравнению с геометрией 180°. Кроме того, флуоресценцию можно измерить и спереди, что часто делается для мутных или непрозрачных образцов. . [ 4 ]
Детектор может быть одноканальным или многоканальным. Одноканальный детектор может обнаруживать интенсивность только одной длины волны за раз, тогда как многоканальный детектор обнаруживает интенсивность всех длин волн одновременно, что делает ненужным монохроматор или фильтр излучения.
Наиболее универсальные флуориметры с двойными монохроматорами и источником непрерывного возбуждающего света могут регистрировать как спектр возбуждения, так и спектр флуоресценции. При измерении спектров флуоресценции длину волны возбуждающего света поддерживают постоянной, предпочтительно на длине волны высокого поглощения, а эмиссионный монохроматор сканирует спектр. Для измерения спектров возбуждения длина волны, проходящая через эмиссионный фильтр или монохроматор, поддерживается постоянной, а монохроматор возбуждения сканирует. Спектр возбуждения обычно идентичен спектру поглощения, поскольку интенсивность флуоресценции пропорциональна поглощению. [ 5 ]
Анализ данных
[ редактировать ]
При низких концентрациях обычно флуоресценции пропорциональна концентрации флуорофора интенсивность .
В отличие от УФ/видимой спектроскопии, «стандартные», независимые от устройства спектры получить непросто. Несколько факторов влияют и искажают спектры, и для достижения «истинных», то есть машинно-независимых спектров, необходимы поправки. Различные типы искажений здесь будут классифицированы как связанные с инструментом или семплом. Во-первых, обсуждаются искажения, возникающие из-за прибора. Во-первых, интенсивность источника света и характеристики длины волны меняются со временем во время каждого эксперимента и между каждым экспериментом. Более того, ни одна лампа не имеет постоянной интенсивности на всех длинах волн. Чтобы исправить это, после монохроматора возбуждения или фильтра можно установить светоделитель, чтобы направить часть света на эталонный детектор.
Кроме того, необходимо учитывать эффективность пропускания монохроматоров и фильтров. Они также могут меняться со временем. Эффективность пропускания монохроматора также варьируется в зависимости от длины волны. По этой причине дополнительный эталонный детектор следует размещать после монохроматора или фильтра возбуждения. Процент флуоресценции, улавливаемой детектором, также зависит от системы. Кроме того, квантовая эффективность детектора, то есть процент обнаруженных фотонов, варьируется в зависимости от длины волны и времени, поскольку детектор неизбежно ухудшается.
Две другие темы, которые необходимо рассмотреть, включают оптику, используемую для направления излучения, и средства хранения или хранения материала образца (называемые кюветой или ячейкой). Для большинства измерений в УФ-, видимом и ближнем ИК-диапазоне необходимо использование прецизионных кварцевых кювет. В обоих случаях важно выбирать материалы, которые имеют относительно небольшое поглощение в интересующем диапазоне длин волн. Кварц идеален, поскольку он пропускает свет в диапазоне 200–2500 нм; Кварц более высокого качества может передавать длину волны даже до 3500 нм, тогда как поглощающие свойства других материалов могут маскировать флуоресценцию образца.
Коррекция всех этих инструментальных факторов для получения «стандартного» спектра — трудоемкий процесс, который применяется на практике лишь в случае крайней необходимости. Это происходит, например, при измерении квантового выхода или при определении длины волны с наибольшей интенсивностью излучения.
Как уже говорилось ранее, искажения возникают и со стороны семпла. Поэтому необходимо учитывать и некоторые аспекты выборки. Во-первых, фоторазложение может со временем уменьшить интенсивность флуоресценции. Также необходимо учитывать рассеяние света. Наиболее значимыми типами рассеяния в этом контексте являются рэлеевское и комбинационное рассеяние. Свет, рассеянный в результате рэлеевского рассеяния, имеет ту же длину волны, что и падающий свет, тогда как при комбинационном рассеянии рассеянный свет обычно меняет длину волны в сторону более длинных волн. Комбинационное рассеяние света является результатом виртуального электронного состояния, индуцированного возбуждающим светом. Из этого виртуального состояния молекулы могут релаксировать обратно на колебательный уровень, отличный от основного колебательного состояния. [ 7 ] В спектрах флуоресценции всегда наблюдается постоянная разница волновых чисел относительно волнового числа возбуждения, например, пик появляется при волновом числе 3600 см-1. −1 ниже, чем свет возбуждения в воде.
Другими аспектами, которые следует учитывать, являются эффекты внутреннего фильтра. [ 8 ] [ 9 ] К ним относится реабсорбция. Реабсорбция происходит потому, что другая молекула или часть макромолекулы поглощает волны с той же длиной волны, на которой флуорофор излучает излучение. В этом случае некоторые или все фотоны, испускаемые флуорофором, могут быть снова поглощены. Другой эффект внутреннего фильтра возникает из-за высоких концентраций поглощающих молекул, включая флуорофор. В результате интенсивность возбуждающего света не является постоянной во всем растворе. В результате только небольшой процент возбуждающего света достигает флуорофоров, видимых системой обнаружения. Эффекты внутреннего фильтра изменяют спектр и интенсивность излучаемого света, поэтому их необходимо учитывать при анализе спектра излучения флуоресцентного света. [ 5 ] [ 10 ]
Флуоресценция триптофана
[ редактировать ]Флуоресценция собой представляет свернутого белка смесь флуоресценции отдельных ароматических остатков. Большая часть собственного флуоресцентного излучения свернутого белка обусловлена возбуждением остатков триптофана , а некоторые выбросы связаны с тирозином и фенилаланином; но дисульфидные связи также обладают заметным поглощением в этом диапазоне длин волн. Обычно триптофан имеет длину волны максимального поглощения 280 нм и сольватохромный пик эмиссии в диапазоне от ок. От 300 до 350 нм в зависимости от полярности местной среды [ 11 ] Следовательно, флуоресценция белка может использоваться в качестве диагностики конформационного состояния белка. [ 12 ] Кроме того, на флуоресценцию триптофана сильно влияет близость других остатков ( т.е. близлежащие протонированные группы, такие как Asp или Glu, могут вызывать тушение флуоресценции Trp). Кроме того, возможен перенос энергии между триптофаном и другими флуоресцентными аминокислотами, что может повлиять на анализ, особенно в случаях, когда используется кислотный подход Фёрстера. Кроме того, триптофан — относительно редкая аминокислота; многие белки содержат только один или несколько остатков триптофана. Следовательно, флуоресценция триптофана может быть очень чувствительным показателем конформационного состояния отдельных остатков триптофана. Преимущество по сравнению с внешними зондами состоит в том, что сам белок не изменяется. Использование собственной флуоресценции для изучения конформации белка на практике ограничивается случаями с небольшим количеством (или, возможно, только одним) остатками триптофана, поскольку каждый из них находится в различном локальном окружении, что приводит к различным спектрам излучения.
Триптофан является важной внутренней флуоресцентной аминокислотой, которую можно использовать для оценки природы микроокружения триптофана. При проведении экспериментов с денатурантами, поверхностно-активными веществами или другими амфифильными молекулами микроокружение триптофана может измениться. Например, если белок, содержащий один триптофан в своем «гидрофобном» ядре, денатурируется с повышением температуры, появится спектр излучения, смещенный в красную сторону. Это происходит из-за воздействия на триптофан водной среды, а не гидрофобной внутренней части белка. Напротив, добавление поверхностно-активного вещества к белку, содержащему триптофан, который подвергается воздействию водного растворителя, приведет к смещению спектра излучения в синюю сторону, если триптофан внедрен в везикулу или мицеллу поверхностно-активного вещества . [ 13 ] Белки, в которых отсутствует триптофан, могут быть связаны с флуорофором .
При возбуждении флуоресценции при 295 нм спектр эмиссии триптофана доминирует над более слабой флуоресценцией тирозина и фенилаланина .
Приложения
[ редактировать ]Флуоресцентная спектроскопия используется, в частности, в биохимических, медицинских и химических исследованиях для анализа органических соединений . Также сообщалось о его использовании для дифференциации злокачественных опухолей кожи от доброкачественных.
Методы атомно-флуоресцентной спектроскопии (AFS) полезны в других видах анализа/измерения соединений, присутствующих в воздухе, воде или других средах, таких как CVAFS , который используется для обнаружения тяжелых металлов, таких как ртуть.
Флуоресценцию также можно использовать для перенаправления фотонов, см. флуоресцентный солнечный коллектор .
Кроме того, флуоресцентную спектроскопию можно адаптировать к микроскопическому уровню с помощью микрофлуориметрии.
В аналитической химии детекторы флуоресценции используются с ВЭЖХ .
В области исследования воды флуоресцентная спектроскопия может использоваться для контроля качества воды путем обнаружения органических загрязнителей. [ 14 ] Последние достижения в области информатики и машинного обучения позволили даже обнаружить бактериальное загрязнение воды. [ 15 ]
В биомедицинских исследованиях флуоресцентная спектроскопия используется для оценки эффективности распределения лекарств путем перекрестного связывания флуоресцентных агентов с различными лекарствами. [ 16 ]
Флуоресцентная спектроскопия в биофизических исследованиях позволяет людям визуализировать и характеризовать липидные домены внутри клеточных мембран. [ 17 ]
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Перейти обратно: а б с Анимация принципа флуоресценции и поглощения в УФ-видимой области.
- ^ Принципы инструментального анализа Ф. Джеймс Холлер, Дуглас А. Скуг и Стэнли Р. Крауч, 2006 г.
- ^ Ренделл, Д. (1987). Флуоресценция и фосфоресценция. Корона
- ^ Эйзингер, Йозеф; Флорес, Хорхе (1979). «Фронтальная флюорометрия жидких проб». Аналитическая биохимия . 94 (1): 15–21. дои : 10.1016/0003-2697(79)90783-8 . ISSN 0003-2697 . ПМИД 464277 .
- ^ Перейти обратно: а б Ашутош Шарма; Стивен Г. Шульман (21 мая 1999 г.). Введение в флуоресцентную спектроскопию . Уайли. ISBN 978-0-471-11098-9 .
- ^ Мерфи, Кэтлин Р.; Стедмон, Колин А.; Вениг, Филип; Бро, Расмус (2014). «OpenFluor – онлайн-спектральная библиотека автофлуоресценции органических соединений в окружающей среде» (PDF) . Анальный. Методы . 6 (3): 658–661. дои : 10.1039/C3AY41935E .
- ^ Гауглиц, Г. и Во-Дин, Т. (2003). Справочник по спектроскопии. Вайли-ВЧ.
- ^ Кимбалл, Джозеф; Чавес, Хосе; Сереса, Лука; Китчнер, Эмма; Нурекеев, Жангатай; Доан, Хунг; Сабельски, Мариуш; Борейдо, Джулиан; Грычинский, Игнаций; Грычинский, Зигмунт (01.06.2020). «О происхождении и коррекции эффектов внутреннего фильтра во флуоресценции. Часть I: эффект первичного внутреннего фильтра - правильный подход к коррекции оптической плотности образца» . Методы и приложения во флуоресценции . 8 (3): 033002. Бибкод : 2020MApFl...8c3002K . дои : 10.1088/2050-6120/ab947c . ISSN 2050-6120 . ПМИД 32428893 . S2CID 218758981 .
- ^ Сереса, Лука; Кимбалл, Джозеф; Чавес, Хосе; Китчнер, Эмма; Нурекеев, Жангатай; Доан, Хунг; Борейдо, Джулиан; Грычинский, Игнаций; Грычинский, Зигмунт (24 мая 2021 г.). «О происхождении и коррекции эффектов внутреннего фильтра во флуоресценции. Часть II: эффект вторичного внутреннего фильтра - правильное использование конфигурации передней панели для сильно поглощающих и рассеивающих образцов» . Методы и приложения во флуоресценции . 9 (3): 035005. Бибкод : 2021MApFl...9c5005C . дои : 10.1088/2050-6120/ac0243 . ISSN 2050-6120 . ПМИД 34032610 . S2CID 235201243 .
- ^ Лакович, младший (1999). Принципы флуоресцентной спектроскопии. Издательство Kluwer Academic / Plenum
- ^ Собственная флуоресценция белков и пептидов. Архивировано 16 мая 2010 г. в Wayback Machine.
- ^ Вивиан Дж. Т., Каллис PR (2001). «Механизмы изменения флуоресценции триптофана в белках» . Биофиз. Дж . 80 (5): 2093–109. Бибкод : 2001BpJ....80.2093V . дои : 10.1016/S0006-3495(01)76183-8 . ПМК 1301402 . ПМИД 11325713 . Архивировано из оригинала 6 сентября 2008 года.
- ^ Капуто Г.А., Лондон Э. Кумулятивное влияние аминокислотных замен и гидрофобного несоответствия на трансмембранную стабильность и конформацию гидрофобных альфа-спиралей. Биохимия. 25 марта 2003 г.;42(11):3275-85.
- ^ Карстеа, Эльфрида М.; Бриджман, Джон; Бейкер, Энди; Рейнольдс, Даррен М. (15 мая 2016 г.). «Флуоресцентная спектроскопия для мониторинга сточных вод: обзор» (PDF) . Исследования воды . 95 : 205–219. Бибкод : 2016WatRe..95..205C . дои : 10.1016/j.watres.2016.03.021 . ISSN 0043-1354 . ПМИД 26999254 . S2CID 205696150 .
- ^ Накар, Амир; Шмилович, Зеев; Вайзель-Охайон, Далит; Крупицкая, Юлия; Борисовер, Михаил; Села (Салдингер), Шломо (01 февраля 2020 г.). «Количественное определение бактерий в воде с использованием PLS-анализа спектров излучения флуоресценции и матриц возбуждения-излучения». Исследования воды . 169 : 115197. Бибкод : 2020WatRe.16915197N . дои : 10.1016/j.watres.2019.115197 . ISSN 0043-1354 . ПМИД 31670087 . S2CID 204967767 .
- ^ Стейли, Бен; Зинди, Егор; Плуэн, Ален (25 декабря 2010 г.). «Количественная оценка поглощения и распределения пептидов, богатых аргинином, в терапевтических концентрациях с использованием методов флуоресцентной корреляционной спектроскопии и корреляционной спектроскопии изображений» . Открытие наркотиков сегодня . 15 (23–24): 1099–1099. дои : 10.1016/j.drudis.2010.09.402 .
- ^ Хоф, М.; Хаттерер, Р.; Фидлер, В., ред. (2005). Флуоресцентная спектроскопия в биологии: передовые методы и их применение к мембранам, белкам, ДНК и клеткам . Серия Спрингера по флуоресценции. Том. 3. Берлин, Гейдельберг: Springer Berlin Heidelberg. дои : 10.1007/b138383 . ISBN 978-3-540-22338-2 .
Внешние ссылки
[ редактировать ]- Fluorophores.org , база данных флуоресцентных красителей.
- OpenFluor , инструменты сообщества, поддерживающие хемометрический анализ флуоресценции органических веществ.
- База данных флуоресцентных минералов с изображениями, активаторами и спектрами (fluomin.org)
| Вибрационный (ИК) | |
|---|---|
| УФ–Вид–БИК «Оптический» | |
| Рентгеновское и гамма-излучение | |
| Электрон | |
| Нуклон | |
| Радиоволна | |
| Другие | |
| Базы данных органов управления : Национальные |
|---|
