✖


Jump to content

Одноклеточное секвенирование

(Перенаправлено из «Геномика одиночных клеток »)

Секвенирование отдельных клеток нуклеиновых кислот исследует информацию о последовательности из отдельных клеток с помощью оптимизированных технологий секвенирования нового поколения , обеспечивая более высокое разрешение клеточных различий и лучшее понимание функции отдельной клетки в контексте ее микроокружения. [1] Например, при раке секвенирование ДНК отдельных клеток может дать информацию о мутациях, переносимых небольшими популяциями клеток. В ходе разработки секвенирование РНК, экспрессируемых отдельными клетками, может дать представление о существовании и поведении различных типов клеток. [2] В микробных системах популяция одного и того же вида может оказаться генетически клональной. Тем не менее, одноклеточное секвенирование РНК или эпигенетические модификации могут выявить межклеточную изменчивость, которая может помочь популяциям быстро адаптироваться к выживанию в меняющихся условиях окружающей среды. [3]

Фон

[ редактировать ]

Типичная человеческая клетка состоит примерно из 2х3,3 миллиардов пар оснований ДНК и 600 миллионов оснований мРНК. Обычно для секвенирования ДНК или РНК используется смесь миллионов клеток с использованием традиционных методов, таких как секвенирование по Сэнгеру или секвенирование следующего поколения . Путем глубокого секвенирования ДНК и РНК из одной клетки можно широко исследовать клеточные функции. [1] Как и типичные эксперименты по секвенированию следующего поколения, протоколы секвенирования отдельных клеток обычно содержат следующие этапы: выделение одной клетки, извлечение и амплификация нуклеиновой кислоты, подготовка библиотеки секвенирования , секвенирование и биоинформационный анализ данных. Выполнить секвенирование отдельных клеток сложнее, чем секвенирование целых клеток. Минимальное количество исходных материалов из одной клетки приводит к тому, что деградация, потеря образцов и загрязнение оказывают заметное влияние на качество данных секвенирования. Кроме того, из-за пикограммового уровня количества используемых нуклеиновых кислот, [4] во время подготовки проб для секвенирования отдельных клеток часто требуется сильная амплификация, что приводит к неравномерному охвату, шуму и неточной количественной оценке данных секвенирования.

Недавние технические усовершенствования делают секвенирование отдельных клеток многообещающим инструментом для решения ряда, казалось бы, недоступных проблем. Например, гетерогенные образцы, редкие типы клеток, родственные связи клеток, мозаицизм соматических тканей, анализ микробов, которые невозможно культивировать, а также эволюцию заболевания — все это можно выяснить с помощью секвенирования отдельных клеток. [5] Секвенирование одиночных клеток было выбрано издательской группой Nature Publishing Group методом 2013 года. [6]

Секвенирование генома (ДНК)

[ редактировать ]

Секвенирование генома одноклеточной ДНК включает в себя выделение одной клетки, амплификацию всего генома или интересующей области, создание библиотек секвенирования, а затем применение секвенирования ДНК следующего поколения (например, Illumina , Ion Torrent ). Секвенирование одноклеточной ДНК широко применяется в системах млекопитающих для изучения нормальной физиологии и заболеваний. Разрешение одиночных клеток может раскрыть роль генетического мозаицизма или внутриопухолевой генетической гетерогенности в развитии рака или реакции на лечение. [7] В контексте микробиомов геном одного одноклеточного организма называется единым амплифицированным геномом (SAG). Достижения в секвенировании одноклеточной ДНК позволили собрать геномные данные от некультивируемых видов прокариот, присутствующих в сложных микробиомах. [8] Хотя SAG характеризуются низкой полнотой и значительной погрешностью, недавние достижения в области вычислений позволили собрать почти полные геномы из составных SAG. [9] Данные, полученные от микроорганизмов, могут определить процессы культивирования в будущем. [10] Некоторые из инструментов сборки генома, используемых при секвенировании отдельных клеток, включают SPAdes , IDBA-UD, Cortex и HyDA. [11]

Методы

[ редактировать ]
Этот рисунок иллюстрирует рабочий процесс секвенирования генома одной клетки. MDA означает многократное усиление смещения.

список из более чем 100 различных методов омики отдельных клеток . Опубликован [12]

Множественная амплификация смещения (MDA) — широко используемый метод, позволяющий амплифицировать фемтограммы ДНК бактерий до микрограмм для секвенирования. Реагенты, необходимые для реакций MDA, включают: случайные праймеры и ДНК-полимеразу бактериофага phi29. В 30-градусной изотермической реакции ДНК амплифицируется с включенными реагентами. По мере того как полимеразы производят новые цепи, происходит реакция замещения цепей, в результате которой из каждой матрицы ДНК синтезируется множество копий. При этом пряди, которые были наращены ранее, сместятся. Продукты MDA имеют длину около 12 КБ и варьируются примерно до 100 КБ, что позволяет использовать их для секвенирования ДНК. [10] В 2017 году было представлено значительное усовершенствование этого метода, получившее название WGA-X, за счет использования термостабильного мутанта полимеразы phi29, что привело к лучшему восстановлению генома из отдельных клеток, особенно из клеток с высоким содержанием G+C. [13] MDA также был реализован в микрофлюидной системе на основе капель для достижения высокопараллельной амплификации всего генома одной клетки. Инкапсулируя отдельные клетки в капли для захвата и амплификации ДНК, этот метод обеспечивает снижение систематической ошибки и повышение производительности по сравнению с традиционным MDA. [14]

Другой распространенный метод — MALBAC . [15] Как и в MDA, этот метод начинается с изотермической амплификации, но праймеры фланкируются «общей» последовательностью для последующей ПЦР-амплификации. По мере генерации предварительных ампликонов общая последовательность способствует самолигированию и образованию «петлей», предотвращающих дальнейшую амплификацию. В отличие от MDA, сильно разветвленная сеть ДНК не образуется. Вместо этого петли денатурируются в другом температурном цикле, что позволяет амплифицировать фрагменты с помощью ПЦР. MALBAC также был реализован в микрофлюидном устройстве, но эффективность амплификации не была существенно улучшена за счет инкапсуляции в нанолитровые капли. [16]

Сравнивая MDA и MALBAC, MDA обеспечивает лучшее покрытие генома, но MALBAC обеспечивает более равномерное покрытие по всему геному. MDA может быть более эффективным для идентификации SNP , тогда как MALBAC предпочтительнее для обнаружения вариантов количества копий. Хотя выполнение MDA с помощью микрофлюидного устройства заметно снижает предвзятость и загрязнение, химический состав, используемый в MALBAC, не демонстрирует такого же потенциала для повышения эффективности.

Методом, особенно подходящим для обнаружения структурных вариаций генома, является секвенирование цепей матрицы одноклеточной ДНК (также известное как Strand-seq). [17] Используя принцип трехканальной обработки отдельных клеток, который использует совместное моделирование ориентации чтения, глубины чтения и фазы гаплотипа, Strand-seq позволяет обнаруживать полный спектр классов соматических структурных вариаций размером ≥200 КБ. Strand-seq преодолевает ограничения методов, основанных на амплификации всего генома, для идентификации классов соматических генетических вариаций в отдельных клетках. [18] поскольку он невосприимчив к химерам чтения, приводящим к артефактам вызова (подробно обсуждаемым в разделе ниже), и на него меньше влияют выпадения. Выбор метода зависит от цели секвенирования, поскольку каждый метод имеет разные преимущества. [7]

Ограничения

[ редактировать ]

MDA отдельных клеточных геномов приводит к крайне неравномерному покрытию генома, т.е. к относительному перепредставлению и недопредставленности различных областей матрицы, что приводит к потере некоторых последовательностей. Этот процесс состоит из двух компонентов: а) стохастическое чрезмерное и недостаточное усиление случайных областей; и б) систематическое смещение в отношении регионов с высоким %GC. Стохастический компонент можно устранить путем объединения одноклеточных реакций MDA из одного и того же типа клеток, используя флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH) и/или подтверждение после секвенирования. [10] Склонность MDA к областям с высоким содержанием %GC можно устранить с помощью термостабильных полимераз, например, в процессе, называемом WGA-X. [13]

Однонуклеотидные полиморфизмы (SNP), которые составляют значительную часть генетических вариаций в геноме человека , и вариации числа копий (CNV), создают проблемы при секвенировании одной клетки, а также ограниченное количество ДНК, экстрагируемой из одной клетки. Из-за небольшого количества ДНК точный анализ ДНК создает проблемы даже после амплификации, поскольку охват невелик и подвержен ошибкам. При использовании MDA средний охват генома составляет менее 80%, и SNP, которые не охвачены считыванием секвенирования, будут исключены. Кроме того, MDA показывает высокий процент выпадения аллелей , не обнаруживая аллелей в гетерозиготных образцах. В настоящее время используются различные алгоритмы SNP, но ни один из них не предназначен для секвенирования одиночных клеток. MDA с CNV также создает проблему выявления ложных CNV, скрывающих настоящие CNV. Чтобы решить эту проблему, когда на основе ложных CNV можно генерировать шаблоны, алгоритмы могут обнаруживать и устранять этот шум, создавая истинные варианты. [19]

Strand-seq преодолевает ограничения методов, основанных на амплификации всего генома, для вызова генетических вариантов: поскольку Strand-seq не требует операций чтения (или пар чтения), пересекающих границы (или точки останова) CNV или классов структурных вариантов со сбалансированным копированием, он требует меньше усилий. восприимчивы к обычным артефактам одноклеточных методов, основанным на амплификации всего генома, которые включают в себя пропуски вызова вариантов из-за отсутствия чтений в точке останова варианта и химеру чтения. [7] [18] Strand-seq обнаруживает полный спектр классов структурных вариаций размером не менее 200 КБ, включая циклы разрыв-слияние-мост и события хромотрипсиса , а также сбалансированные инверсии и сбалансированные или несбалансированные транслокации по числу копий. [18] «Вызовы структурных вариантов, выполняемые Strand-seq, разрешаются гаплотипом длины хромосомы , что обеспечивает дополнительную специфичность вызова вариантов. [18] В качестве текущего ограничения Strand-seq требует деления клеток для специфического мечения цепи с использованием бромдезоксиуридина (BrdU), и этот метод не обнаруживает варианты размером менее 200 КБ, такие как вставки мобильных элементов .

Приложения

[ редактировать ]

Микробиомы являются одной из основных целей геномики отдельных клеток из-за сложности культивирования большинства микроорганизмов в большинстве сред. Геномика одиночных клеток — мощный способ получить последовательности микробного генома без культивирования. Этот подход широко применялся к морским, почвенным, подповерхностным, организменным и другим типам микробиомов для решения широкого спектра вопросов, связанных с микробной экологией, эволюцией, общественным здравоохранением и биотехнологическим потенциалом. [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28]

Секвенирование рака также является новым применением scDNAseq. Свежие или замороженные опухоли можно довольно хорошо проанализировать и классифицировать в отношении SCNA, SNV и перестроек, используя подходы полногеномной ДНК. [29] scDNAseq рака особенно полезен для изучения глубины сложности и сложных мутаций, присутствующих в амплифицированных терапевтических мишенях, таких как гены рецепторной тирозинкиназы (EGFR, PDGFRA и т. д.), когда традиционные подходы на популяционном уровне к объемной опухоли не могут разрешить совместную проблему. закономерности возникновения этих мутаций внутри одиночных клеток опухоли. Такое перекрытие может обеспечить избыточность активации пути и устойчивости опухолевых клеток.

Секвенирование метилома ДНК

[ редактировать ]
Один из методов секвенирования метилирования ДНК отдельных клеток. [30]

Секвенирование метилома одноклеточной ДНК позволяет количественно оценить метилирование ДНК . Существует несколько известных типов метилирования, встречающихся в природе, в том числе 5-метилцитозин (5mC), 5-гидроксиметилцитозин (5hmC), 6-метиладенин (6mA) и 4-метилцитозин 4mC (4mC). У эукариот, особенно животных, 5mC широко распространен по геному и играет важную роль в регуляции экспрессии генов путем репрессии мобильных элементов . [31] Секвенирование 5mC в отдельных клетках может выявить, как эпигенетические изменения в генетически идентичных клетках из одной ткани или популяции приводят к появлению клеток с разными фенотипами.

Методы

[ редактировать ]

Бисульфитное секвенирование стало золотым стандартом обнаружения и секвенирования 5mC в отдельных клетках. [32] Обработка ДНК бисульфитом превращает остатки цитозина в урацил, но не затрагивает остатки 5-метилцитозина. Следовательно, ДНК, обработанная бисульфитом, сохраняет только метилированные цитозины. Чтобы получить показания метилома, обработанную бисульфитом последовательность выравнивают по немодифицированному геному. Полногеномное бисульфитное секвенирование было достигнуто в отдельных клетках в 2014 году. [33] Этот метод позволяет избежать потери ДНК, связанной с типичной процедурой, когда адаптеры секвенирования добавляются до фрагментации бисульфита. Вместо этого адаптеры добавляются после обработки и фрагментации ДНК бисульфитом, что позволяет амплифицировать все фрагменты с помощью ПЦР. [34] Используя глубокое секвенирование, этот метод захватывает ~ 40% общего количества CpG в каждой ячейке. С помощью существующей технологии ДНК не может быть амплифицирована до обработки бисульфитом, поскольку метки 5mC не будут копироваться полимеразой.

Еще одним методом является бисульфитное секвенирование с уменьшенным представлением отдельных клеток (scRRBS). [35] Этот метод использует тенденцию метилированных цитозинов группироваться на CpG-островках (CGI) для обогащения областей генома с высоким содержанием CpG. Это снижает стоимость секвенирования по сравнению с полногеномным бисульфитным секвенированием, но ограничивает охват этого метода. Когда RRBS применяется к объемным образцам, обнаруживается большинство сайтов CpG в промоторах генов, но сайты в промоторах генов составляют только 10% сайтов CpG во всем геноме. [36] В одиночных клетках обнаруживается 40% сайтов CpG из основной выборки. Чтобы увеличить охват, этот метод также можно применить к небольшому пулу одиночных ячеек. В образце из 20 объединенных одиночных клеток было обнаружено 63% сайтов CpG из основной выборки. Объединение отдельных клеток является одной из стратегий увеличения покрытия метиломов, но за счет сокрытия гетерогенности в популяции клеток.

Ограничения

[ редактировать ]

Хотя бисульфитное секвенирование остается наиболее широко используемым подходом для обнаружения 5 мС, химическая обработка является жесткой, фрагментирует и разрушает ДНК. Этот эффект усугубляется при переходе от объемных образцов к одиночным клеткам. Другие методы обнаружения метилирования ДНК включают чувствительные к метилированию ферменты рестрикции. Ферменты рестрикции также позволяют обнаруживать другие типы метилирования, например, 6 мА с помощью DpnI. [37] Секвенирование на основе нанопор также предлагает путь для прямого секвенирования метилирования без фрагментации или модификации исходной ДНК. Секвенирование нанопор использовалось для секвенирования метиломов бактерий, в которых доминируют 6mA и 4mC (в отличие от 5mC у эукариот), но этот метод еще не масштабирован до отдельных клеток. [38]

Приложения

[ редактировать ]

Секвенирование метилирования одноклеточной ДНК широко используется для изучения эпигенетических различий в генетически сходных клетках. Чтобы проверить эти методы во время их разработки, данные о метиломе отдельных клеток смешанной популяции были успешно классифицированы с помощью иерархической кластеризации для идентификации различных типов клеток. [35] Другое применение — изучение отдельных клеток во время первых нескольких клеточных делений на ранних стадиях развития, чтобы понять, как разные типы клеток возникают из одного эмбриона. [39] Одноклеточное полногеномное бисульфитное секвенирование также использовалось для изучения редких, но высокоактивных типов клеток при раке, таких как циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК). [40]

Сравнение методов секвенирования метилирования отдельных клеток с точки зрения охвата по состоянию на 2015 год на Mus musculus

Секвенирование хроматина, доступного для транспозазы (scATAC-seq)

[ редактировать ]
Основная статья: ATAC-seq

Секвенирование одноклеточного хроматина, доступного для транспозазы, отображает доступность хроматина по всему геному. Транспозаза вставляет адаптеры секвенирования непосредственно в открытые области хроматина, позволяя амплифицировать и секвенировать эти области. [41]

Методы

[ редактировать ]

Два метода подготовки библиотеки в scATAC-Seq основаны на клеточном индексировании разделенного пула и микрофлюидике.

Секвенирование транскриптома (scRNA-seq)

[ редактировать ]
Основная статья: Транскриптомика одноклеточных клеток

Стандартные методы, такие как микрочипы и объемное секвенирование РНК, анализируют экспрессию РНК в больших популяциях клеток. Эти измерения могут скрыть критические различия между отдельными клетками в популяциях смешанных клеток. [42] [43]

Секвенирование одноклеточной РНК (scRNA-seq) позволяет получить профили экспрессии отдельных клеток и считается золотым стандартом для определения состояний и фенотипов клеток с 2020 года. [44] Хотя невозможно получить полную информацию о каждой РНК, экспрессируемой каждой клеткой, из-за небольшого количества доступного материала, закономерности экспрессии генов можно определить с помощью анализа кластеризации генов . [45] Это может выявить редкие типы клеток в клеточной популяции, которые, возможно, никогда раньше не наблюдались. Например, одна группа ученых, выполняющая секРНК-секвенирование опухолевой ткани нейробластомы, выявила редкую раковую клетку паннейробластомы, которая может быть привлекательной для новых подходов к терапии. [46]

Методы

[ редактировать ]
Рабочий процесс секвенирования одноклеточной РНК

Текущие протоколы секвенирования scRNA включают выделение отдельных клеток и их РНК, а затем выполнение тех же шагов, что и массовое секвенирование РНК: обратную транскрипцию (RT), амплификацию, создание библиотеки и секвенирование. Ранние методы разделяли отдельные клетки в отдельные лунки; более поздние методы инкапсулируют отдельные клетки в капли в микрофлюидном устройстве, где происходит реакция обратной транскрипции, превращающая РНК в кДНК. Каждая капля несет «штрих-код» ДНК, который однозначно маркирует кДНК, полученные из одной клетки. После завершения обратной транскрипции кДНК из многих клеток можно смешать для секвенирования, поскольку транскрипты из конкретной клетки идентифицируются по уникальному штрих-коду. [47] [48]

Задачи scRNA-Seq включают сохранение первоначального относительного содержания мРНК в клетке и выявление редких транскриптов. [49] Этап обратной транскрипции имеет решающее значение, поскольку эффективность реакции RT определяет, какая часть популяции РНК клетки в конечном итоге будет проанализирована секвенатором. Процессивность . обратных транскриптаз и используемые стратегии прайминга могут влиять на производство полноразмерной кДНК и создание библиотек, смещенных в сторону 3'- или 5'-конца генов

На этапе амплификации в настоящее время для амплификации кДНК используется либо ПЦР, либо транскрипция in vitro (IVT). Одним из преимуществ методов на основе ПЦР является возможность генерировать полноразмерную кДНК. Однако различная эффективность ПЦР для определенных последовательностей (например, содержания GC и структуры snapback) также может экспоненциально усиливаться, создавая библиотеки с неравномерным покрытием. С другой стороны, хотя библиотеки, созданные с помощью IVT, могут избежать смещения последовательностей, вызванного ПЦР, определенные последовательности могут транскрибироваться неэффективно, что приводит к выпадению последовательностей или образованию неполных последовательностей. [1] [42] Опубликовано несколько протоколов scRNA-seq:Тан и др., [50] СТРТ, [51] SMART-последовательность, [52] Сортировка-последовательность, [53] CEL-сек, [54] RAGE-сиквел, [55] Кварц-сек. [56] и C1-КЛЕТКА. [57] Эти протоколы различаются стратегиями обратной транскрипции, синтеза и амплификации кДНК, а также возможностью использования штрих-кодов, специфичных для последовательности (т. е. UMI ), или способностью обрабатывать объединенные образцы. [58]

В 2017 году были представлены два подхода для одновременного измерения одноклеточной экспрессии мРНК и белка с помощью меченных олигонуклеотидами антител, известных как REAP-seq: [59] и CITE-сек. [60] Сбор клеточного содержимого после электрофизиологической записи с использованием патч-клампа также позволил разработать метод Patch-Seq , который неуклонно набирает популярность в нейробиологии. [61]

Пример платформы на основе капель — метод 10X

[ редактировать ]

Эта платформа секвенирования одноклеточной РНК позволяет анализировать транскриптомы на каждой клетке с помощью микрофлюидного разделения для захвата отдельных клеток и подготовки для секвенирования следующего поколения (NGS) библиотек кДНК . [62] Платформа на основе капель позволяет массово параллельно секвенировать мРНК в большом количестве отдельных клеток путем захвата одной клетки в капле масла. [63]

В целом, на первом этапе отдельные клетки захватываются отдельно и лизируются, затем обратная транскрипция (ОТ) мРНК выполняется кДНК и получается библиотека . Для отбора мРНК проводят RT с использованием одноцепочечной последовательности дезокситиминового (олиго дТ) праймера , который специфически связывает поли(А)-хвост молекул мРНК. Впоследствии амплифицированную библиотеку кДНК используют для секвенирования. [64]

Итак, первым шагом метода является инкапсуляция одной клетки и подготовка библиотеки. Клетки инкапсулируются в гелевые шарики в эмульсии (GEM) с помощью автомата. Для формирования этих пузырьков автомат использует микрофлюидный чип и объединяет все компоненты с маслом. Каждый функциональный GEM содержит одну ячейку, один шарик геля и реагенты RT. На гелевых шариках связываются олигнонуклеотиды, состоящие из 4 отдельных частей: праймер для ПЦР (необходим для секвенирования); 10X олигонуклеотиды со штрих-кодом; Последовательность уникального молекулярного идентификатора (UMI); Последовательность PolydT (которая позволяет захватывать полиаденилированные молекулы мРНК). [65] Внутри каждой реакционной везикулы GEM одна клетка лизируется и подвергается обратной транскрипции. кДНК из одной и той же клетки идентифицируются благодаря общему штрих-коду 10X.Кроме того, количество UMI отражает уровень экспрессии генов, и их анализ позволяет обнаружить высоковариабельные гены. Эти данные часто используются либо для классификации клеточных фенотипов, либо для идентификации новой субпопуляции. [66]

Последним шагом платформы является секвенирование. Созданные библиотеки можно напрямую использовать для секвенирования всего транскриптома отдельной клетки или рабочих процессов целевого секвенирования. Секвенирование проводят с использованием метода секвенирования красителей Illumina . Этот метод секвенирования основан на принципе секвенирования путем синтеза (SBS) и использовании обратимого красителя-терминатора, который позволяет идентифицировать каждый отдельный нуклеотид.Для считывания последовательностей транскриптов на одном конце и штрих-кода и UMI на другом конце требуются считыватели парных концов. [67]

Платформа на основе капель позволяет обнаруживать редкие типы клеток благодаря своей высокой пропускной способности. Фактически, в одном образце из одной клеточной суспензии захватывается от 500 до 10 000 клеток. Протокол выполняется легко и обеспечивает высокую скорость восстановления клеток — до 65%. Глобальный рабочий процесс капельной платформы занимает 8 часов и поэтому быстрее, чем метод на основе Microwell (BD Rhapsody), который занимает 10 часов.Однако он имеет некоторые ограничения, такие как необходимость свежих образцов и окончательное обнаружение только 10% мРНК.

Основное различие между методом, основанным на каплях, и методом, основанным на микролунках, заключается в методе разделения клеток. [64]

Ограничения

[ редактировать ]

Большинство методов секвенирования РНК зависят от захвата хвоста поли(А) для обогащения мРНК и истощения обильных и неинформативных рРНК. Таким образом, они часто ограничиваются секвенированием полиаденилированных молекул мРНК. Однако недавние исследования теперь начинают понимать важность неполи(А) РНК, таких как длинные некодирующие РНК и микроРНК, в регуляции экспрессии генов. Small-seq — это одноклеточный метод, который захватывает небольшие РНК (<300 нуклеотидов), такие как микроРНК, фрагменты тРНК и малые ядрышковые РНК в клетках млекопитающих. [68] Этот метод использует комбинацию «олигонуклеотидных масок» (которые подавляют захват очень распространенных молекул 5,8S рРНК) и выбора размера для исключения крупных видов РНК, таких как другие очень распространенные молекулы рРНК. Для нацеливания на более крупные неполи(А) РНК, такие как длинная некодирующая мРНК, гистоновая мРНК, кольцевая РНК и энхансерная РНК, выбор размера неприменим для истощения очень распространенных молекул рибосомальной РНК (18S и 28s рРНК). [69] Одноклеточный RamDA-Seq — это метод, который достигает этого путем выполнения обратной транскрипции со случайным праймированием (амплификация со случайным смещением) в присутствии «не столь случайных» (NSR) праймеров, специально разработанных для предотвращения праймирования молекулы рРНК. [70] Хотя этот метод успешно захватывает полноразмерные полные транскрипты РНК для секвенирования и обнаруживает множество неполи(А) РНК с высокой чувствительностью, он имеет некоторые ограничения. Праймеры NSR были тщательно разработаны в соответствии с последовательностями рРНК конкретного организма (мыши), и разработка новых наборов праймеров для других видов потребовала бы значительных усилий. Недавно основанный на CRISPR метод под названием scDASH (истощение одноклеточных обильных последовательностей путем гибридизации) продемонстрировал другой подход к истощению последовательностей рРНК из одноклеточных библиотек тотальных РНК-seq. [71]

Бактерии и другие прокариоты в настоящее время не поддаются секвенированию одноклеточной РНК из-за отсутствия полиаденилированной мРНК. Таким образом, разработка методов секвенирования одноклеточной РНК, которые не зависят от захвата хвоста поли(А), также будет способствовать проведению исследований микробиома с разрешением одиночных клеток. Массовые исследования бактерий обычно применяют общее истощение рРНК, чтобы преодолеть недостаток полиаденилированной мРНК у бактерий, но на уровне отдельных клеток общее количество РНК, обнаруженное в одной клетке, слишком мало. [69] Отсутствие полиаденилированной мРНК и нехватка тотальной РНК, обнаруженной в отдельных бактериальных клетках, являются двумя важными барьерами, ограничивающими внедрение scRNA-seq в бактериях.

Приложения

[ редактировать ]

scRNA-Seq широко используется в биологических дисциплинах, включая биологию развития , [72] Неврология , [73] онкология , [74] [75] [76] Иммунология , [77] [78] Сердечно-сосудистые исследования [79] [80] и Инфекционные заболевания . [81] [82]

Используя методы машинного обучения , данные массового секвенирования РНК были использованы для увеличения соотношения сигнал/шум в scRNA-Seq. В частности, ученые использовали профили экспрессии генов из наборов данных по раку , чтобы построить сети коэкспрессии , а затем применили их к профилям экспрессии генов в отдельных клетках, получив более надежный метод обнаружения наличия мутаций в отдельных клетках с использованием уровней транскриптов. [83]

Некоторые методы scRNA-seq также применялись к одноклеточным микроорганизмам. SMART-seq2 использовался для анализа одноклеточных эукариотических микробов, но, поскольку он основан на захвате хвоста поли(А), он не применялся в прокариотических клетках. [84] Микрофлюидные подходы, такие как устройства Drop-seq и Fluidigm IFC-C1, использовались для секвенирования отдельных малярийных паразитов или отдельных дрожжевых клеток. [85] [86] Исследование одноклеточных дрожжей было направлено на то, чтобы охарактеризовать гетерогенную стрессоустойчивость в изогенных дрожжевых клетках до и после того, как дрожжи подверглись солевому стрессу. Анализ отдельных клеток нескольких факторов транскрипции с помощью scRNA-seq выявил гетерогенность в популяции. Эти результаты показывают, что регулирование варьируется среди членов популяции, чтобы увеличить шансы на выживание для части населения.

Первый анализ транскриптома одиночных клеток у прокариотических видов был выполнен с использованием фермента терминаторной экзонуклеазы для избирательного расщепления рРНК и амплификации мРНК по катящемуся кругу (RCA). [87] В этом методе концы одноцепочечной ДНК лигировались вместе, образуя кольцо, а полученная петля затем использовалась в качестве матрицы для линейной амплификации РНК. Библиотеку конечных продуктов затем анализировали с помощью микрочипа с низкой погрешностью и хорошим охватом. Однако RCA не тестировался с помощью секвенирования РНК, в котором обычно используется секвенирование следующего поколения. Секвенирование одноклеточной РНК бактерий было бы очень полезно для изучения микробиомов. Это позволит решить проблемы, возникающие при использовании традиционных подходов массовой метатранскриптомики, такие как неспособность уловить виды, присутствующие в низкой численности, и неспособность устранить гетерогенность среди клеточных популяций.

scRNA-Seq предоставил значительную информацию о развитии эмбрионов и организмов, включая червя Caenorhabditis elegans , [88] и регенеративная планарий Schmidtea mediterranea. [89] [90] и аксолотль Ambystoma mexicanum . [91] [92] Первыми позвоночными животными, картографированными таким образом, были рыбки данио. [93] [94] [95] и Xenopus laevis . [96] В каждом случае изучались несколько стадий эмбриона, что позволяло картировать весь процесс развития на клеточной основе. Наука признала эти достижения « Прорывом года 2018» . [97]

Был создан атлас молекулярных клеток семенников мышей для определения токсичности яичек в препубертатном периоде, индуцированной BDE47, с использованием подхода ScRNA-seq, что дает новое понимание наших механизмов и путей, лежащих в основе BDE47-ассоциированного повреждения яичек, с разрешением отдельных клеток. [98]

Соображения

[ редактировать ]

Выделение одиночных клеток

[ редактировать ]

Существует несколько способов изолировать отдельные клетки перед амплификацией и секвенированием всего генома. Сортировка клеток, активируемая флуоресценцией (FACS), является широко используемым подходом. Отдельные клетки также можно собирать с помощью микроманипуляций, например, путем серийного разведения или с помощью патч-пипетки или нанотрубки для сбора одной клетки. [15] [99] Преимуществами микроманипуляции являются простота и низкая стоимость, но она трудоемка и подвержена ошибочной идентификации типов клеток под микроскопом. Микродиссекция с лазерным захватом (LCM) также может использоваться для сбора отдельных клеток. Хотя LCM сохраняет информацию о пространственном расположении выбранной клетки в ткани, трудно захватить целую отдельную клетку, не собрав при этом материалы из соседних клеток. [42] [100] [101] Высокопроизводительные методы выделения отдельных клеток также включают микрофлюидику . И FACS, и микрофлюидика являются точными, автоматическими и способны изолировать объективные образцы. Однако оба метода требуют сначала отделения клеток от их микроокружения, тем самым вызывая нарушения транскрипционных профилей при анализе экспрессии РНК. [102] [103]

Количество клеток, подлежащих секвенированию и анализу

[ редактировать ]

scRNA-Seq

[ редактировать ]

Протоколы одноклеточной RNA-Seq различаются по эффективности захвата РНК, что приводит к различиям в количестве транскриптов, генерируемых из каждой отдельной клетки. Библиотеки одноклеточных клеток обычно секвенируют на глубину 1 000 000 чтений, поскольку подавляющее большинство генов обнаруживается при 500 000 чтений. [104] Увеличение количества клеток и уменьшение глубины считывания увеличивает эффективность идентификации основных популяций клеток. Однако низкая глубина считывания не всегда может предоставить необходимую информацию о генах, а разница в их экспрессии между популяциями клеток зависит от стабильности и обнаружения молекул мРНК.

Ковариаты контроля качества служат стратегией анализа количества ячеек. Эти ковариаты в основном включают фильтрацию на основе глубины подсчета, количества генов и доли подсчетов митохондриальных генов, что приводит к интерпретации клеточных сигналов.

См. также

[ редактировать ]

Ссылки

[ редактировать ]
  1. ^ Jump up to: а б с Эбервин Дж., Сул Дж.Й., Бартфай Т., Ким Дж. (январь 2014 г.). «Обещание секвенирования отдельных клеток». Природные методы . 11 (1): 25–27. дои : 10.1038/nmeth.2769 . ПМИД   24524134 . S2CID   11575439 .
  2. ^ Пенниси Э (апрель 2018 г.). «Хроника эмбрионов, клетка за клеткой, ген за геном». Наука . 360 (6387): 367. Бибкод : 2018Sci...360..367P . дои : 10.1126/science.360.6387.367 . ПМИД   29700246 .
  3. ^ Салиба А.Е., Вестерманн А.Дж., Горски С.А., Фогель Дж. (август 2014 г.). «Секвенирование одноклеточной РНК: достижения и будущие проблемы» . Исследования нуклеиновых кислот . 42 (14): 8845–8860. дои : 10.1093/nar/gku555 . ПМК   4132710 . ПМИД   25053837 .
  4. ^ Синтаку Х., Нишики Х., Маршалл Л.А., Котера Х., Сантьяго Дж.Г. (февраль 2014 г.). «На чипе разделение и анализ РНК и ДНК из отдельных клеток». Аналитическая химия . 86 (4): 1953–1957. дои : 10.1021/ac4040218 . ПМИД   24499009 .
  5. ^ Нави Т (январь 2014 г.). «Одноклеточное секвенирование» . Природные методы . 11 (1): 18. doi : 10.1038/nmeth.2771 . ПМИД   24524131 . S2CID   5252333 .
  6. ^ «Метод года 2013» . Природные методы . 11 (1): 1 января 2014 г. doi : 10.1038/nmeth.2801 . ПМИД   24524124 .
  7. ^ Jump up to: а б с Гавад С., Ко В., Quake SR (март 2016 г.). «Секвенирование одноклеточного генома: современное состояние науки». Обзоры природы. Генетика . 17 (3): 175–188. дои : 10.1038/nrg.2015.16 . ПМИД   26806412 . S2CID   4800650 .
  8. ^ Альнеберг Дж., Карлссон С.М., Дивне А.М., Бергин С., Хома Ф., Линд М.В. и др. (сентябрь 2018 г.). «Геномы некультивируемых прокариот: сравнение геномов, собранных метагеномом, и геномов, однократно амплифицированных» . Микробиом . 6 (1): 173. дои : 10.1186/s40168-018-0550-0 . ПМК   6162917 . ПМИД   30266101 .
  9. ^ Когава М., Хосокава М., Нисикава Ю., Мори К., Такеяма Х. (февраль 2018 г.). «Получение высококачественных черновых геномов из некультивируемых микробов путем очистки и совместной сборки одноклеточных амплифицированных геномов» . Научные отчеты . 8 (1): 2059. Бибкод : 2018НатСР...8.2059К . дои : 10.1038/s41598-018-20384-3 . ПМК   5794965 . ПМИД   29391438 .
  10. ^ Jump up to: а б с " Ласкен Р.С. (октябрь 2007 г.). «Одноклеточное геномное секвенирование с использованием множественной амплификации смещения». Современное мнение в микробиологии . 10 (5): 510–516. дои : 10.1016/j.mib.2007.08.005 . ПМИД   17923430 . "
  11. ^ Тагави З., Мовахеди Н.С., Драгичи С., Чицаз Х. (октябрь 2013 г.). «Дистиллированное секвенирование одноклеточного генома и сборка de novo для редких микробных сообществ» . Биоинформатика . 29 (19): 2395–2401. arXiv : 1305.0062 . Бибкод : 2013arXiv1305.0062T . doi : 10.1093/биоинформатика/btt420 . ПМЦ   3777112 . ПМИД   23918251 .
  12. ^ "Single-Cell-Omics.v2.3.13 @albertvilella" . Гугл Документы . Проверено 01 января 2020 г.
  13. ^ Jump up to: а б Степанаускас Р., Фергюссон Э.А., Браун Дж., Поултон Н.Дж., Таппер Б., Лабонте Дж.М. и др. (июль 2017 г.). «Улучшенное восстановление генома и комплексный анализ размеров отдельных некультивируемых микробных клеток и вирусных частиц» . Природные коммуникации . 8 (1): 84. Бибкод : 2017NatCo...8...84S . дои : 10.1038/s41467-017-00128-z . ПМК   5519541 . ПМИД   28729688 .
  14. ^ Хосокава М., Нисикава Ю., Когава М., Такэяма Х. (июль 2017 г.). «Массовая параллельная амплификация всего генома для секвенирования отдельных клеток с использованием капельной микрофлюидики» . Научные отчеты . 7 (1): 5199. Бибкод : 2017NatSR...7.5199H . дои : 10.1038/s41598-017-05436-4 . ПМЦ   5507899 . ПМИД   28701744 .
  15. ^ Jump up to: а б Цзун С., Лу С., Чепмен А.Р., Се XS (декабрь 2012 г.). «Полногеномное обнаружение вариаций одиночных нуклеотидов и числа копий одной клетки человека» . Наука . 338 (6114): 1622–1626. Бибкод : 2012Sci...338.1622Z . дои : 10.1126/science.1229164 . ПМК   3600412 . ПМИД   23258894 .
  16. ^ Ю З, Лу С, Хуан Ю (октябрь 2014 г.). «Микрофлюидное устройство для амплификации всего генома для секвенирования отдельных клеток». Аналитическая химия . 86 (19): 9386–9390. дои : 10.1021/ac5032176 . ПМИД   25233049 .
  17. ^ Фальконер Э., Хиллс М., Науманн У., Пун С.С., Чавес Э.А., Сандерс А.Д. и др. (ноябрь 2012 г.). «Секвенирование цепей ДНК по матрице одиночных клеток отображает геномные перестройки с высоким разрешением» . Природные методы . 9 (11): 1107–1112. дои : 10.1038/nmeth.2206 . ПМК   3580294 . ПМИД   23042453 .
  18. ^ Jump up to: а б с д " Сандерс А.Д., Мейерс С., Гарегани М., Порубски Д., Джонг Х., ван Влит М.А. и др. (март 2020 г.). «Одноклеточный анализ структурных изменений и сложных перестроек с трехканальной обработкой» . Природная биотехнология . 38 (3): 343–354. дои : 10.1038/s41587-019-0366-x . ПМЦ   7612647 . ПМИД   31873213 . S2CID   209464011 . "
  19. ^ " Нин Л, Лю Г, Ли Г, Хоу Ю, Тонг Ю, Хэ Дж (2014). «Актуальные проблемы биоинформатики геномики одиночных клеток» . Границы онкологии . 4 (7): 7. doi : 10.3389/fonc.2014.00007 . ПМК   3902584 . ПМИД   24478987 . "
  20. ^ Blainey PC, Quake SR (январь 2014 г.). «Расчленение геномного разнообразия, по одной клетке за раз» . Природные методы . 11 (1): 19–21. дои : 10.1038/nmeth.2783 . hdl : 1721.1/106574 . ПМЦ   3947563 . ПМИД   24524132 .
  21. ^ Чжан К., Мартини А.С., Реппас Н.Б., Барри К.В., Малек Дж., Чисхолм С.В., генеральный директор Черча (июнь 2006 г.). «Секвенирование геномов отдельных клеток путем клонирования полимеразы». Природная биотехнология . 24 (6): 680–686. дои : 10.1038/nbt1214 . ПМИД   16732271 . S2CID   2994579 .
  22. ^ Юн Х.С., Прайс Д.С., Степанаускас Р., Раджа В.Д., Серацкий М.Е., Уилсон В.Х. и др. (май 2011 г.). «Одноклеточная геномика выявляет организменные взаимодействия у некультивируемых морских простейших». Наука . 332 (6030): 714–717. Бибкод : 2011Sci...332..714Y . дои : 10.1126/science.1203163 . ПМИД   21551060 . S2CID   34343205 .
  23. ^ Свон Б.К., Мартинес-Гарсия М., Престон С.М., Ширба А., Войк Т., Лами Д. и др. (сентябрь 2011 г.). «Возможность хемолитоавтотрофии среди вездесущих линий бактерий в темном океане». Наука . 333 (6047): 1296–1300. Бибкод : 2011Sci...333.1296S . дои : 10.1126/science.1203690 . ПМИД   21885783 . S2CID   206533092 .
  24. ^ Войк Т., Се Г., Коупленд А., Гонсалес Х.М., Хан С., Кисс Х. и др. (23 апреля 2009 г.). «Сборка морского метагенома, по одной клетке за раз» . ПЛОС ОДИН . 4 (4): е5299. Бибкод : 2009PLoSO...4.5299W . дои : 10.1371/journal.pone.0005299 . ПМЦ   2668756 . ПМИД   19390573 .
  25. ^ Свон Б.К., Таппер Б., Скирба А., Лауро Ф.М., Мартинес-Гарсия М., Гонсалес Х.М. и др. (июль 2013 г.). «Распространенная упорядоченность генома и широтная дивергенция планктонных бактерий на поверхности океана» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 110 (28): 11463–11468. Бибкод : 2013PNAS..11011463S . дои : 10.1073/pnas.1304246110 . ПМК   3710821 . ПМИД   23801761 .
  26. ^ Ринке С., Швинтек П., Щирба А., Иванова Н.Н., Андерсон И.Дж., Ченг Дж.Ф. и др. (июль 2013 г.). «Понимание филогении и кодирующего потенциала микробной темной материи» . Природа . 499 (7459): 431–437. Бибкод : 2013Natur.499..431R . дои : 10.1038/nature12352 . hdl : 10453/27467 . ПМИД   23851394 . S2CID   4394530 .
  27. ^ Каштан Н., Роггенсак С.Е., Родриг С., Томпсон Дж.В., Биллер С.Дж., Коу А. и др. (апрель 2014 г.). «Одноклеточная геномика выявляет сотни сосуществующих субпопуляций дикого прохлорококка». Наука . 344 (6182): 416–420. Бибкод : 2014Sci...344..416K . дои : 10.1126/science.1248575 . hdl : 1721.1/92763 . ПМИД   24763590 . S2CID   13659345 .
  28. ^ Пачиадаки М.Г., Синтес Э., Бергауэр К., Браун Дж.М., Рекорд Н.Р., Свон Б.К. и др. (ноябрь 2017 г.). «Основная роль нитритокисляющих бактерий в фиксации углерода темного океана» . Наука . 358 (6366): 1046–1051. Бибкод : 2017Sci...358.1046P . дои : 10.1126/science.aan8260 . ПМИД   29170234 .
  29. ^ Фрэнсис Дж.М., Чжан К.З., Мэр К.Л., Юнг Дж., Манзо В.Е., Адальстейнссон В.А. и др. (август 2014 г.). «Гетерогенность вариантов EGFR при глиобластоме, разрешенная посредством секвенирования одного ядра» . Открытие рака . 4 (8): 956–971. дои : 10.1158/2159-8290.CD-13-0879 . ПМЦ   4125473 . ПМИД   24893890 .
  30. ^ Фарлик М., Шеффилд Северная Каролина, Нуццо А., Датлингер П., Шёнеггер А., Клагхаммер Дж., Бок С. (март 2015 г.). «Секвенирование метилома одноклеточной ДНК и биоинформатический вывод о динамике эпигеномного состояния клеток» . Отчеты по ячейкам . 10 (8): 1386–1397. дои : 10.1016/j.celrep.2015.02.001 . ПМЦ   4542311 . ПМИД   25732828 .
  31. ^ Земах А., МакДэниел И.Е., Сильва П., Зильберман Д. (май 2010 г.). «Полногеномный эволюционный анализ метилирования ДНК эукариот» . Наука . 328 (5980): 916–919. Бибкод : 2010Sci...328..916Z . дои : 10.1126/science.1186366 . ПМИД   20395474 . S2CID   206525166 .
  32. ^ Крэри-Дули Ф.К., Тэм М.Е., Данауэй К.В., Герц-Пиччиотто I, Шмидт Р.Дж., ЛаСалль Дж.М. (март 2017 г.). «Сравнение существующих глобальных анализов метилирования ДНК с полногеномным бисульфитным секвенированием с низким охватом для эпидемиологических исследований» . Эпигенетика . 12 (3): 206–214. дои : 10.1080/15592294.2016.1276680 . ПМК   5406214 . ПМИД   28055307 .
  33. ^ Смоллвуд С.А., Ли Х.Дж., Ангермюллер С., Крюгер Ф., Сааде Х., Пит Дж. и др. (август 2014 г.). «Одноклеточное полногеномное бисульфитное секвенирование для оценки эпигенетической гетерогенности» . Природные методы . 11 (8): 817–820. дои : 10.1038/nmeth.3035 . ПМК   4117646 . ПМИД   25042786 .
  34. ^ Миура Ф, Эномото Ю, Дайрики Р, Ито Т (сентябрь 2012 г.). «Полногеномное бисульфитное секвенирование без амплификации путем мечения постбисульфитного адаптера» . Исследования нуклеиновых кислот . 40 (17): е136. дои : 10.1093/nar/gks454 . ПМЦ   3458524 . ПМИД   22649061 .
  35. ^ Jump up to: а б Го Х, Чжу П, Ву X, Ли X, Вэнь Л, Тан Ф (декабрь 2013 г.). «Одноклеточные метиломные ландшафты эмбриональных стволовых клеток мыши и ранних эмбрионов проанализированы с использованием бисульфитного секвенирования с уменьшенным представлением» . Геномные исследования . 23 (12): 2126–2135. дои : 10.1101/гр.161679.113 . ПМЦ   3847781 . ПМИД   24179143 .
  36. ^ Гу Х., Смит З.Д., Бок С., Бойл П., Гнирке А., Мейснер А. (апрель 2011 г.). «Подготовка библиотек бисульфитного секвенирования с уменьшенным представлением для профилирования метилирования ДНК в масштабе генома». Протоколы природы . 6 (4): 468–481. дои : 10.1038/nprot.2010.190 . ПМИД   21412275 . S2CID   24912438 .
  37. ^ Фу Ю, Луо ГЗ, Чен К., Дэн Х, Ю М, Хан Д. и др. (май 2015 г.). «N6-метилдезоксиаденозин отмечает активные места начала транскрипции у хламидомонады» . Клетка . 161 (4): 879–892. дои : 10.1016/j.cell.2015.04.010 . ПМЦ   4427561 . ПМИД   25936837 .
  38. ^ Больёрье Дж., Шадт Э.Э., Фанг Дж. (март 2019 г.). «Расшифровка бактериальных эпигеномов с помощью современных технологий секвенирования» . Обзоры природы. Генетика . 20 (3): 157–172. дои : 10.1038/s41576-018-0081-3 . ПМК   6555402 . ПМИД   30546107 .
  39. ^ Го Х, Чжу П, Ян Л, Ли Р, Ху Б, Лиан Ю и др. (июль 2014 г.). «Пейзаж метилирования ДНК ранних эмбрионов человека». Природа . 511 (7511): 606–610. Бибкод : 2014Natur.511..606G . дои : 10.1038/nature13544 . ПМИД   25079557 . S2CID   4450377 .
  40. ^ Гкунтела С., Кастро-Гинер Ф., Щерба Б.М., Веттер М., Ландин Дж., Шеррер Р. и др. (январь 2019 г.). «Кластеризация циркулирующих опухолевых клеток формирует метилирование ДНК, обеспечивая возможность посева метастазов» . Клетка . 176 (1–2): 98–112.e14. дои : 10.1016/j.cell.2018.11.046 . ПМК   6363966 . ПМИД   30633912 .
  41. ^ Штейн Р.А. (1 июля 2019 г.). «Секвенирование одной клетки через несколько омиков» . Проверено 1 августа 2019 г.
  42. ^ Jump up to: а б с " Шапиро Э., Бизунер Т., Линнарссон С. (сентябрь 2013 г.). «Технологии, основанные на секвенировании отдельных клеток, произведут революцию в науке о целом организме». Обзоры природы. Генетика . 14 (9): 618–630. дои : 10.1038/nrg3542 . ПМИД   23897237 . S2CID   500845 . "
  43. ^ Колодзейчик А.А., Ким Дж.К., Свенссон В., Мариони Дж.К., Тейхманн С.А. (май 2015 г.). «Технология и биология секвенирования одноклеточных РНК» . Молекулярная клетка . 58 (4): 610–620. doi : 10.1016/j.molcel.2015.04.005 . ПМИД   26000846 .
  44. ^ Таммела Т., Сейдж Дж. (март 2020 г.). «Исследование гетерогенности опухоли на мышиных моделях» . Ежегодный обзор биологии рака . 4 (1): 99–119. doi : 10.1146/annurev-cancerbio-030419-033413 . ПМЦ   8218894 . ПМИД   34164589 .
  45. ^ Харрис С. (2020). Анализ транскриптома отдельных клеток при раке предстательной железы (MSc). Университет Отаго. hdl : 10523/10111 .
  46. ^ Килдисюте Г., Холосий В.М., Янг М.Д., Робертс К., Элментайте Р., ван Хоофф С.Р. и др. (февраль 2021 г.). «Сравнение мРНК опухоли и нормальной одноклеточной клетки выявляет раковую клетку паннейробластомы» . Достижения науки . 7 (6): eabd3311. Бибкод : 2021SciA....7.3311K . дои : 10.1126/sciadv.abd3311 . ПМЦ   7864567 . ПМИД   33547074 .
  47. ^ Кляйн А.М., Мазутис Л., Акартуна И., Таллапрагада Н., Верес А., Ли В. и др. (май 2015 г.). «Капельное штрих-кодирование для транскриптомики отдельных клеток применительно к эмбриональным стволовым клеткам» . Клетка . 161 (5): 1187–1201. дои : 10.1016/j.cell.2015.04.044 . ПМЦ   4441768 . ПМИД   26000487 .
  48. ^ Макоско Э.З., Басу А., Сатия Р., Немеш Дж., Шекхар К., Голдман М. и др. (май 2015 г.). «Высокопараллельное полногеномное профилирование экспрессии отдельных клеток с использованием нанолитровых капель» . Клетка . 161 (5): 1202–1214. дои : 10.1016/j.cell.2015.05.002 . ПМЦ   4481139 . ПМИД   26000488 .
  49. ^ " Хебенстрейт Д. (ноябрь 2012 г.). «Методы, проблемы и возможности секвенирования одноклеточной РНК» . Биология . 1 (3): 658–667. дои : 10.3390/biology1030658 . ПМК   4009822 . ПМИД   24832513 . "
  50. ^ Тан Ф., Барбачору С., Ван Ю., Нордман Э., Ли С., Сюй Н. и др. (май 2009 г.). «Анализ всего транскриптома мРНК-Seq одной клетки». Природные методы . 6 (5): 377–382. дои : 10.1038/NMETH.1315 . ПМИД   19349980 . S2CID   16570747 .
  51. ^ Ислам С., Кьеллквист У., Молинер А., Заяк П., Фан Дж.Б., Лённерберг П., Линнарссон С. (июль 2011 г.). «Характеристика одноклеточного транскрипционного ландшафта с помощью высокомультиплексного секвенирования РНК» . Геномные исследования . 21 (7): 1160–1167. дои : 10.1101/гр.110882.110 . ПМЦ   3129258 . ПМИД   21543516 .
  52. ^ Рамшельд Д., Луо С., Ван Ю.К., Ли Р., Дэн К., Фаридани О.Р. и др. (август 2012 г.). «Полноразмерная мРНК-Seq из одноклеточных уровней РНК и отдельных циркулирующих опухолевых клеток» . Природная биотехнология . 30 (8): 777–782. дои : 10.1038/nbt.2282 . ПМЦ   3467340 . ПМИД   22820318 .
  53. ^ Мураро М.Дж., Дхармадхикари Г., Грюн Д., Гроен Н., Дилен Т., Янсен Э. и др. (октябрь 2016 г.). «Атлас одноклеточных транскриптомов поджелудочной железы человека» . Клеточные системы . 3 (4): 385–394.е3. дои : 10.1016/j.cels.2016.09.002 . ПМК   5092539 . ПМИД   27693023 .
  54. ^ Хашимшони Т., Вагнер Ф., Шер Н., Янаи И. (сентябрь 2012 г.). «CEL-Seq: Seq одноклеточной РНК путем мультиплексной линейной амплификации» . Отчеты по ячейкам . 2 (3): 666–673. дои : 10.1016/j.celrep.2012.08.003 . ПМИД   22939981 .
  55. ^ Сингх М., Аль-Эриани Г., Карсвелл С., Фергюсон Дж. М., Блэкберн Дж., Бартон К. и др. (июль 2019 г.). «Высокопроизводительное целевое секвенирование отдельных клеток с длинным считыванием раскрывает клональный и транскрипционный ландшафт лимфоцитов» . Природные коммуникации . 10 (1): 3120. Бибкод : 2019NatCo..10.3120S . дои : 10.1038/s41467-019-11049-4 . ПМЦ   6635368 . ПМИД   31311926 .
  56. ^ Сасагава Ю., Никайдо И., Хаяси Т., Данно Х., Уно К.Д., Имаи Т., Уэда Х.Р. (апрель 2013 г.). «Quartz-Seq: высоковоспроизводимый и чувствительный метод секвенирования одноклеточной РНК, выявляющий негенетическую гетерогенность экспрессии генов» . Геномная биология . 14 (4): С31. дои : 10.1186/gb-2013-14-4-r31 . ПМК   4054835 . ПМИД   23594475 .
  57. ^ Коуно Т., Муди Дж., Квон А.Т., Сибаяма Ю., Като С., Хуан Ю. и др. (январь 2019 г.). «C1 CAGE обнаруживает сайты начала транскрипции и активность энхансера с разрешением одной клетки» . Природные коммуникации . 10 (1): 360. Бибкод : 2019NatCo..10..360K . дои : 10.1038/s41467-018-08126-5 . ПМК   6341120 . ПМИД   30664627 .
  58. ^ Дал Молин А, Ди Камилло Б (июль 2019 г.). «Как разработать эксперимент по секвенированию одноклеточной РНК: подводные камни, проблемы и перспективы». Брифинги по биоинформатике . 20 (4): 1384–1394. дои : 10.1093/нагрудник/bby007 . ПМИД   29394315 .
  59. ^ Петерсон В.М., Чжан К.Х., Кумар Н., Вонг Дж., Ли Л., Уилсон Д.С. и др. (октябрь 2017 г.). «Мультиплексная количественная оценка белков и транскриптов в отдельных клетках». Природная биотехнология . 35 (10): 936–939. дои : 10.1038/nbt.3973 . ПМИД   28854175 . S2CID   205285357 .
  60. ^ Стоккиус М., Хафемейстер С., Стивенсон В., Хоук-Лумис Б., Чаттопадхьяй П.К., Свердлов Х. и др. (сентябрь 2017 г.). «Одновременное измерение эпитопа и транскриптома в отдельных клетках» . Природные методы . 14 (9): 865–868. дои : 10.1038/nmeth.4380 . ПМК   5669064 . ПМИД   28759029 .
  61. ^ Трипати С.Дж., Токер Л., Бомкамп С., Манкарчи Б.О., Бельмадани М., Павлидис П. (08.10.2018). «Оценка качества транскриптома в наборах данных Patch-Seq» . Границы молекулярной нейронауки . 11 : 363. doi : 10.3389/fnmol.2018.00363 . ПМК   6187980 . ПМИД   30349457 .
  62. ^ Кларк, Шейла. «Секвенирование одноклеточной РНК: вводный обзор и инструменты для начала работы» . 10xgenomics.com .
  63. ^ Гудапати, Х; Дей, М; Озболат, И (сентябрь 2016 г.). «Всесторонний обзор капельной биопечати: прошлое, настоящее и будущее» . Биоматериалы . 102 : 20–42. doi : 10.1016/j.bimaterials.2016.06.012 . ПМИД   27318933 .
  64. ^ Jump up to: а б Гао, К; Чжан, М; Чен, Л. (декабрь 2020 г.). «Сравнение двух платформ секвенирования одиночных клеток: BD Rhapsody и 10x Genomics Chromium» . Современная геномика . 21 (8): 602–609. дои : 10.2174/1389202921999200625220812 . ПМЦ   7770630 . ПМИД   33414681 .
  65. ^ «Решение для экспрессии генов в отдельных клетках хрома с технологией штрих-кодирования» (PDF) . 10xgenomics.com .
  66. ^ Ван, X; Привет; Чжан, Вопрос; Рен, Х; Чжан, Z (апрель 2021 г.). «Прямой сравнительный анализ 10X Genomics Chromium и Smart-seq2» . Геномика, протеомика и биоинформатика . 19 (2): 253–266. дои : 10.1016/j.gpb.2020.02.005 . ПМЦ   8602399 . ПМИД   33662621 .
  67. ^ КВОК, Хин; ЛУИ, Шван. «Одноклеточная (10-кратная геномика)» . CPOS ХКУМед .
  68. ^ Хагеманн-Йенсен М., Абдуллаев И., Сандберг Р., Фаридани О.Р. (октябрь 2018 г.). «Small-seq для секвенирования малой РНК одной клетки». Протоколы природы . 13 (10): 2407–2424. дои : 10.1038/s41596-018-0049-y . ПМИД   30250291 . S2CID   52813142 .
  69. ^ Jump up to: а б Хаяси Т., Одзаки Х., Сасагава Ю., Умеда М., Данно Х., Никайдо I (февраль 2018 г.). «Одноклеточное полноразмерное секвенирование тотальной РНК раскрывает динамику рекурсивного сплайсинга и энхансерных РНК» . Природные коммуникации . 9 (1): 619. Бибкод : 2018NatCo...9..619H . дои : 10.1038/s41467-018-02866-0 . ПМК   5809388 . ПМИД   29434199 .
  70. ^ Armor CD, Castle JC, Chen R, Babak T, Loerch P, Jackson S и др. (сентябрь 2009 г.). «Профилирование цифрового транскриптома с использованием селективного прайминга гексамера для синтеза кДНК». Природные методы . 6 (9): 647–649. дои : 10.1038/nmeth.1360 . ПМИД   19668204 . S2CID   12164981 .
  71. ^ Лой Д.С., Ю Л, Ву А.Р. (15 января 2021 г.). «Эффективное истощение рибосомальной РНК для секвенирования общей РНК одной клетки с помощью scDASH» . ПерДж . 9 : е10717. дои : 10.7717/peerj.10717 . ПМЦ   7812930 . ПМИД   33520469 .
  72. ^ Гриффитс Дж.А., Скиалдоне А., Мариони Дж.К. (апрель 2018 г.). «Использование геномики отдельных клеток для понимания процессов развития и принятия решений о судьбе клеток» . Молекулярная системная биология . 14 (4): e8046. дои : 10.15252/msb.20178046 . ПМК   5900446 . ПМИД   29661792 .
  73. ^ Радж Б., Вагнер Д.Э., Маккенна А., Панди С., Кляйн А.М., Шендюр Дж. и др. (июнь 2018 г.). «Одновременное одноклеточное профилирование линий и типов клеток в мозге позвоночных» . Природная биотехнология . 36 (5): 442–450. дои : 10.1038/nbt.4103 . ПМЦ   5938111 . ПМИД   29608178 .
  74. ^ Олмос Д., Аркенау Х.Т., Анг Дж.Е., Ледаки И., Аттард Г., Карден К.П. и др. (январь 2009 г.). «Циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК) считаются промежуточными конечными точками при кастрационно-резистентном раке простаты (КРРПЖ): опыт одного центра» . Анналы онкологии . 20 (1): 27–33. дои : 10.1093/annonc/mdn544 . ПМИД   18695026 .
  75. ^ Левитин Х.М., Юань Дж., Симс П.А. (апрель 2018 г.). «Одноклеточный транскриптомный анализ гетерогенности опухоли» . Тенденции рака . 4 (4): 264–268. дои : 10.1016/j.trecan.2018.02.003 . ПМЦ   5993208 . ПМИД   29606308 .
  76. ^ Джерби-Арнон Л., Шах П., Куоко М.С., Родман С., Су М.Дж., Мелмс Дж.К. и др. (ноябрь 2018 г.). «Программа по борьбе с раковыми клетками способствует исключению Т-клеток и устойчивости к блокаде контрольных точек» . Клетка . 175 (4): 984–997.e24. дои : 10.1016/j.cell.2018.09.006 . ПМК   6410377 . ПМИД   30388455 .
  77. ^ Ной К.Э., Тан К., Уилсон ПК, Хан А.А. (февраль 2017 г.). «Одноклеточная геномика: подходы и полезность в иммунологии» . Тенденции в иммунологии . 38 (2): 140–149. дои : 10.1016/j.it.2016.12.001 . ПМЦ   5479322 . ПМИД   28094102 .
  78. ^ Стивенсон В., Донлин Л.Т., Батлер А., Розо С., Бракен Б., Рашидфаррохи А. и др. (февраль 2018 г.). «Секвенирование одноклеточной РНК синовиальной ткани ревматоидного артрита с использованием недорогих микрофлюидных инструментов» . Природные коммуникации . 9 (1): 791. Бибкод : 2018NatCo...9..791S . дои : 10.1038/s41467-017-02659-x . ПМЦ   5824814 . ПМИД   29476078 .
  79. ^ Куппе С., Ибрагим М.М., Кранц Дж., Чжан Х., Зиглер С., Пералес-Патон Дж. и др. (январь 2021 г.). «Расшифровка происхождения миофибробластов при фиброзе почек человека» . Природа . 589 (7841): 281–286. Бибкод : 2021Natur.589..281K . дои : 10.1038/s41586-020-2941-1 . hdl : 20.500.11820/a0a63f61-934c-4036-80d7-79c2e3095885 . ПМЦ   7611626 . ПМИД   33176333 . S2CID   226309826 .
  80. ^ Куппе С., Флорес Р.О., Ли З., Ханнани М., Таневски Дж., Хальдер М. и др. (10 августа 2022 г.). «Пространственная мультиомная карта инфаркта миокарда человека» . Природа . 608 (7924): 766–777. Бибкод : 2022Natur.608..766K . дои : 10.1038/s41586-022-05060-x . ISSN   1476-4687 . ПМЦ   9364862 . ПМИД   35948637 .
  81. ^ Авраам Р., Хасли Н., Браун Д., Пенаранда С., Джиджон Х.Б., Тромбетта Дж.Дж. и др. (сентябрь 2015 г.). «Межклеточная изменчивость патогена приводит к гетерогенности иммунных реакций хозяина» . Клетка . 162 (6): 1309–1321. дои : 10.1016/j.cell.2015.08.027 . ПМЦ   4578813 . ПМИД   26343579 .
  82. ^ Боссель Бен-Моше Н., Хен-Авиви С., Левитин Н., Йехезкель Д., Остинг М., Йостен Л.А. и др. (июль 2019 г.). «Прогнозирование исходов бактериальной инфекции с использованием анализа секвенирования одноклеточной РНК иммунных клеток человека» . Природные коммуникации . 10 (1): 3266. Бибкод : 2019NatCo..10.3266B . дои : 10.1038/s41467-019-11257-y . ПМК   6646406 . ПМИД   31332193 .
  83. ^ Меркателли Д., Рэй Ф., Георгий Ф.М. (2019). «Панарковое и одноклеточное моделирование геномных изменений посредством экспрессии генов» . Границы генетики . 10 : 671. дои : 10.3389/fgene.2019.00671 . ПМК   6657420 . ПМИД   31379928 .
  84. ^ Рид А.Дж., Талман А.М., Беннетт Х.М., Гомес А.Р., Сандерс М.Дж., Иллингворт С.Дж. и др. (март 2018 г.). «Секвенирование одноклеточной РНК выявляет скрытые изменения транскрипции у малярийных паразитов» . электронная жизнь . 7 : е33105. дои : 10.7554/eLife.33105 . ПМЦ   5871331 . ПМИД   29580379 .
  85. ^ Поран А., Нётцель С., Али О., Менсия-Триншант Н., Харрис К.Т., Гусман М.Л. и др. (ноябрь 2017 г.). «Секвенирование одноклеточной РНК выявляет признаки сексуальной активности малярийных паразитов» . Природа . 551 (7678): 95–99. Бибкод : 2017Natur.551...95P . дои : 10.1038/nature24280 . ПМК   6055935 . ПМИД   29094698 .
  86. ^ Гаш А.П., Ю Ф.Б., Хоуз Дж., Эскаланте Л.Е., Плейс М., Бахер Р. и др. (декабрь 2017 г.). Балабан Н. (ред.). «Секвенирование одноклеточной РНК выявляет внутреннюю и внешнюю регуляторную гетерогенность дрожжей, реагирующих на стресс» . ПЛОС Биология . 15 (12): e2004050. doi : 10.1371/journal.pbio.2004050 . ПМЦ   5746276 . ПМИД   29240790 .
  87. ^ Кан Ю, Норрис М.Х., Зажицки-Сик Дж., Нирман В.К., Доначи С.П., Хоанг Т.Т. (июнь 2011 г.). «Амплификация транскрипта одной бактерии для анализа транскриптома» . Геномные исследования . 21 (6): 925–935. дои : 10.1101/гр.116103.110 . ПМК   3106325 . ПМИД   21536723 .
  88. ^ Цао Дж., Пакер Дж.С., Рамани В., Кусанович Д.А., Хуинь С., Даза Р. и др. (август 2017 г.). «Комплексное одноклеточное транскрипционное профилирование многоклеточного организма» . Наука . 357 (6352): 661–667. Бибкод : 2017Sci...357..661C . дои : 10.1126/science.aam8940 . ПМЦ   5894354 . ПМИД   28818938 .
  89. ^ Пласс М., Солана Дж., Вольф Ф.А., Аюб С., Мисиос А., Глазар П. и др. (май 2018 г.). «Атлас типов клеток и древо происхождения целого сложного животного по данным одноклеточной транскриптомики» . Наука . 360 (6391): eaaq1723. дои : 10.1126/science.aaq1723 . ПМИД   29674432 .
  90. ^ Финчер К.Т., Вурцель О., де Хоог Т., Краварик К.М., Реддиен П.В. (май 2018 г.). «Атлас транскриптома клеточных типов планарии Schmidtea mediterranea » . Наука . 360 (6391): eaaq1736. дои : 10.1126/science.aaq1736 . ПМК   6563842 . ПМИД   29674431 .
  91. ^ Гербер Т., Муравала П., Кнапп Д., Масселинк В., Шуец М., Герман С. и др. (октябрь 2018 г.). «Анализ отдельных клеток обнаруживает конвергенцию идентичности клеток во время регенерации конечностей аксолотля» . Наука . 362 (6413): eaaq0681. Бибкод : 2018Sci...362..681G . дои : 10.1126/science.aaq0681 . ПМК   6669047 . ПМИД   30262634 .
  92. ^ Ли Н.Д., Данлэп Г.С., Джонсон К., Мариано Р., Оширо Р., Вонг А.Ю. и др. (декабрь 2018 г.). «Транскриптомный ландшафт ниши бластемы при регенерации конечностей взрослого аксолотля при одноклеточном разрешении» . Природные коммуникации . 9 (1): 5153. Бибкод : 2018NatCo...9.5153L . дои : 10.1038/s41467-018-07604-0 . ПМК   6279788 . ПМИД   30514844 .
  93. ^ Вагнер Д.Э., Вайнреб С., Коллинз З.М., Бриггс Дж.А., Мегасон С.Г., Кляйн А.М. (июнь 2018 г.). «Одноклеточное картирование ландшафтов экспрессии генов и их происхождения у эмбрионов рыбок данио» . Наука . 360 (6392): 981–987. Бибкод : 2018Sci...360..981W . дои : 10.1126/science.aar4362 . ПМК   6083445 . ПМИД   29700229 .
  94. ^ Фаррелл Дж.А., Ван Й., Ризенфельд С.Дж., Шекхар К., Регев А., Шир А.Ф. (июнь 2018 г.). «Одноклеточная реконструкция траекторий развития во время эмбриогенеза рыбок данио» . Наука . 360 (6392): eaar3131. дои : 10.1126/science.aar3131 . ПМК   6247916 . ПМИД   29700225 .
  95. ^ Зафар Х., Лин С., Бар-Джозеф З. (июнь 2020 г.). «Отслеживание одноклеточных линий путем интеграции мутаций CRISPR-Cas9 с транскриптомными данными» . Природные коммуникации . 11 (1): 3055. Бибкод : 2020NatCo..11.3055Z . дои : 10.1038/s41467-020-16821-5 . ПМК   7298005 . ПМИД   32546686 .
  96. ^ Бриггс Дж.А., Вайнреб С., Вагнер Д.Е., Мегасон С., Пешкин Л., Киршнер М.В., Кляйн А.М. (июнь 2018 г.). «Динамика экспрессии генов в эмбриогенезе позвоночных при разрешении отдельных клеток» . Наука . 360 (6392): eaar5780. дои : 10.1126/science.aar5780 . ПМК   6038144 . ПМИД   29700227 .
  97. ^ Ю Дж. «Научный прорыв 2018 года: отслеживание развития клетка за клеткой» . Научный журнал . Американская ассоциация содействия развитию науки.
  98. ^ Чжан В., Ся С., Чжун Икс, Гао Г., Ян Дж., Ван С. и др. (сентябрь 2022 г.). «Характеристика тестикулярной токсичности, вызванной 2,2',4,4'-тетрабромдифениловым эфиром (BDE47), посредством секвенирования одноклеточной РНК» . Прецизионная клиническая медицина . 5 (3): pbac016. дои : 10.1093/pcmedi/pbac016 . ПМК   9306015 . ПМИД   35875604 .
  99. ^ Куримото К., Ябута Ю., Охината Ю., Сайто М. (2007). «Глобальная амплификация кДНК одной клетки для создания матрицы для репрезентативного анализа микрочипов олигонуклеотидов высокой плотности». Протоколы природы . 2 (3): 739–752. дои : 10.1038/nprot.2007.79 . ПМИД   17406636 . S2CID   7404545 .
  100. ^ Ячида С., Джонс С., Божич И., Антал Т., Лири Р., Фу Б. и др. (октябрь 2010 г.). «Отдаленные метастазы возникают на поздних стадиях генетической эволюции рака поджелудочной железы» . Природа . 467 (7319): 1114–1117. Бибкод : 2010Natur.467.1114Y . дои : 10.1038/nature09515 . ПМК   3148940 . ПМИД   20981102 .
  101. ^ Фрумкин Д., Вассерстром А., Ицковиц С., Хармелин А., Рехави Г., Шапиро Э. (февраль 2008 г.). «Амплификация множественных геномных локусов из одиночных клеток, выделенных с помощью лазерной микродиссекции тканей» . БМК Биотехнология . 8 (17): 17. дои : 10.1186/1472-6750-8-17 . ПМК   2266725 . ПМИД   18284708 .
  102. ^ Далерба П., Калиски Т., Саху Д., Раджендран П.С., Ротенберг М.Е., Лейрат А.А. и др. (ноябрь 2011 г.). «Одноклеточное рассечение транскрипционной гетерогенности в опухолях толстой кишки человека» . Природная биотехнология . 29 (12): 1120–1127. дои : 10.1038/nbt.2038 . ПМЦ   3237928 . ПМИД   22081019 .
  103. ^ Уайт А.К., ВанИнсберг М., Петрив О.И., Хамиди М., Сикорски Д., Марра М.А. и др. (август 2011 г.). «Высокопроизводительная микрофлюидная одноклеточная RT-qPCR» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 108 (34): 13999–14004. Бибкод : 2011PNAS..10813999W . дои : 10.1073/pnas.1019446108 . ПМК   3161570 . ПМИД   21808033 .
  104. ^ Цигенхайн, Кристоф; Вьет, Беате; Парех, Свати; Рейниус, Бьёрн; Гийоме-Адкинс, Эми; Сметс, Марта; Леонхардт, Генрих; Хейн, Хольгер; Хеллманн, Инес; Энард, Вольфганг (февраль 2017 г.). «Сравнительный анализ методов секвенирования одноклеточной РНК». Молекулярная клетка . 65 (4): 631–643.e4. doi : 10.1016/j.molcel.2017.01.023 . hdl : 10230/34928 . ПМИД   28212749 .
[ редактировать ]
Retrieved from "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Single-cell_sequencing&oldid=1223853153"
Arc.Ask3.Ru: конец переведенного документа.
Arc.Ask3.Ru
Номер скриншота №: 05cd2dfdb952b222fe61aa2a2b35bf63__1715704320
URL1:https://arc.ask3.ru/arc/aa/05/63/05cd2dfdb952b222fe61aa2a2b35bf63.html
Заголовок, (Title) документа по адресу, URL1:
Single-cell sequencing - Wikipedia
Данный printscreen веб страницы (снимок веб страницы, скриншот веб страницы), визуально-программная копия документа расположенного по адресу URL1 и сохраненная в файл, имеет: квалифицированную, усовершенствованную (подтверждены: метки времени, валидность сертификата), открепленную ЭЦП (приложена к данному файлу), что может быть использовано для подтверждения содержания и факта существования документа в этот момент времени. Права на данный скриншот принадлежат администрации Ask3.ru, использование в качестве доказательства только с письменного разрешения правообладателя скриншота. Администрация Ask3.ru не несет ответственности за информацию размещенную на данном скриншоте. Права на прочие зарегистрированные элементы любого права, изображенные на снимках принадлежат их владельцам. Качество перевода предоставляется как есть. Любые претензии, иски не могут быть предъявлены. Если вы не согласны с любым пунктом перечисленным выше, вы не можете использовать данный сайт и информация размещенную на нем (сайте/странице), немедленно покиньте данный сайт. В случае нарушения любого пункта перечисленного выше, штраф 55! (Пятьдесят пять факториал, Денежную единицу (имеющую самостоятельную стоимость) можете выбрать самостоятельно, выплаичвается товарами в течение 7 дней с момента нарушения.)