Кофакторная инженерия
Кофакторная инженерия , подвид метаболической инженерии , определяется как манипулирование использованием кофакторов организма в метаболических путях . В кофакторной инженерии концентрации кофакторов изменяются, чтобы максимизировать или минимизировать метаболические потоки. Этот тип инженерии можно использовать для оптимизации производства метаболитного продукта или для повышения эффективности метаболической сети . Использование разработки одноклеточных организмов для создания прибыльных химических веществ из дешевого сырья растет, а разработка кофакторов может сыграть решающую роль в максимизации производства. Эта область приобрела большую популярность за последнее десятилетие и имеет несколько практических применений в химическом производстве, биоинженерии и фармацевтической промышленности. [ 1 ]
Кофакторы – это небелковые соединения , которые связываются с белками и необходимы для нормальной каталитической функциональности белков. Кофакторы можно считать «молекулами-помощниками» в биологической активности и часто влияют на функциональность ферментов. Кофакторами могут быть как органические, так и неорганические соединения. Некоторыми примерами неорганических кофакторов являются железо или магний, а некоторые примеры органических кофакторов включают АТФ или кофермент А. Органические кофакторы более конкретно известны как коферменты , и многие ферменты требуют добавления коферментов для выполнения нормальной каталитической функции в метаболической реакции. Коферменты связываются с активным центром фермента, способствуя катализу. С помощью кофакторов и коферментов можно манипулировать естественной метаболической реакцией для оптимизации результатов метаболической сети. [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ]
Фон
[ редактировать ]Кофакторы были открыты Артуром Харденом и Уильямом Янгом в 1906 году, когда они обнаружили, что скорость спиртового брожения в некипяченных дрожжевых экстрактах увеличивается при добавлении вареного дрожжевого экстракта. [ 5 ] Несколько лет спустя Ганс фон Эйлер-Хельпин определил кофактор в кипяченном экстракте как НАД. + . Другие кофакторы, такие как АТФ и коэнзим А, были открыты позже, в 1900-х годах. Механизм активности кофакторов был открыт, когда Отто Генрих Варбург в 1936 году определил, что НАД + выполнял функцию акцептора электронов . Задолго до этих первоначальных открытий ученые начали понимать, что манипулирование концентрацией кофакторов можно использовать в качестве инструмента для улучшения метаболических путей . [ 1 ]
Важной группой органических кофакторов является семейство молекул, называемых витаминами . Витамин B12 (кобаламин), например, играет решающую роль в организме человека, а коэнзим B12 , его производное, участвует в метаболизме всех типов клеток нашего организма. Его присутствие влияет на синтез и регуляцию клеточной ДНК , а также на участие в синтезе жирных кислот и производстве энергии. Кофакторы необходимы для многих важных метаболических путей , и концентрации одного типа кофактора могут влиять на потоки многих различных путей.
Минералы и ионы металлов, которые организмы поглощают с пищей, являются яркими примерами неорганических кофакторов. Например, Зн 2+ необходим для помощи ферменту карбоангидразе , преобразующему углекислый газ и воду в бикарбонат и протоны. Широко признанным минералом, действующим в качестве кофактора, является железо, которое необходимо для правильного функционирования гемоглобина , белка, переносящего кислород, содержащегося в красных кровяных тельцах . Этот пример, в частности, подчеркивает важность кофакторов в метаболизме животных .
Значение
[ редактировать ]Кофакторная инженерия играет важную роль в манипулировании метаболическими путями . Метаболический путь – это серия химических реакций, происходящих в организме. Метаболическая инженерия – это предмет изменения потоков в метаболическом пути. В метаболической инженерии метаболический путь можно напрямую изменить, изменив функциональность ферментов, участвующих в этом пути. Кофакторная инженерия предлагает особый подход и некоторые преимущества для изменения метаболического пути. Вместо изменения ферментов, используемых в пути, можно изменить кофакторы. Это может дать инженерам-метаболистам преимущество благодаря определенным свойствам кофакторов и способам их модификации.
Метаболические пути могут использоваться инженерами-метаболистами для создания желаемого продукта. Изменяя типы используемых кофакторов и время их использования, можно изменить результат метаболической сети. Чтобы увеличить производство продукта, метаболические инженеры имеют возможность снабдить сеть любым кофактором, который лучше всего подходит для этого конкретного процесса. Это приводит к оптимизации сетей для увеличения производства желаемой продукции. Кроме того, изменение кофакторов, используемых в сети, может оказаться оригинальным решением сложной проблемы. Сеть, которая присутствует в ячейке, но часто не используется, может иметь желаемый продукт. Вместо разработки совершенно нового набора способов производства продукта можно применить кофакторную инженерию. Заменяя ферменты на использование кофакторов, легко доступных в клетке, обычно неиспользуемая сеть больше не ограничена кофакторами, и производство может быть увеличено.
Помимо изменения выхода метаболических сетей, изменение кофакторов, используемых в сети, может снизить эксплуатационные затраты при попытке сформировать желаемый продукт. НАДН и НАДФН — два чрезвычайно распространенных клеточных кофактора, различающиеся только наличием фосфатной группы. Однако эта фосфатная группа делает НАДФН гораздо менее стабильным, чем НАДН, и, следовательно, его синтез обходится дороже. Таким образом, выгодно попробовать использовать НАДН в некоторых сотовых сетях, поскольку он часто дешевле, более доступен и выполняет ту же задачу, что и НАДФН.
Инструменты и процессы
[ редактировать ]Кофакторная инженерия чаще всего связана с манипулированием микроорганизмами, такими как Saccharomyces cerevisiae и Escherichia coli , и поэтому требует использования методов рекомбинантной ДНК . В этих методах используются небольшие кольцевые сегменты ДНК , называемые плазмидами , которые могут быть введены и внедрены микроорганизмами, такими как Escherichia coli . Эти плазмиды специально разработаны в лабораториях, чтобы их можно было легко вводить и влиять на экспрессию различных белков , метаболитов и ферментов . последовательности фермента Например, определенная плазмида может вызывать изменение аминокислотной , что может повысить его сродство к определенному субстрату .
Микроорганизмам для роста необходима среда, и для культур Escherichia coli обычно используется бульон Лурии-Бертани (LB). Эта среда часто дополняется глюкозой и часто содержит дополнительные молекулы , предназначенные для обеспечения оптимального роста культуры. Затем прекультуры можно выращивать во встряхиваемых колбах. Это просто закупоренные колбы Эрленмейера , которые оставляют на орбитальном шейкере, вращающемся на очень высоких оборотах . Этот процесс аэрирует культуру, что необходимо для оптимального роста. Когда прекультуры готовы, в каждую культуру отдельно добавляют плазмиды, необходимые для конкретных экспериментов, а затем каждую культуру переносят в биореактор. Биореакторы — это системы, которые позволяют культурам расти в контролируемой среде. Это оставляет введенные плазмиды единственной независимой переменной. Требуемая температура, pH , концентрации метаболитов и различные другие факторы окружающей среды могут поддерживаться биореактором, обеспечивая идентичные условия роста для каждой культуры.
После того, как образцы будут расти в реакторе в течение определенного периода, их можно будет извлечь и изучить, чтобы определить, очевидны ли предполагаемые изменения в организме. Поскольку кофакторная инженерия чаще всего связана с метаболическими путями , эти организмы часто изучаются, но при этом вводятся специфически меченные флуоресцентные метаболиты и документируется их продвижение по различным путям. В других случаях результаты более очевидны и легко наблюдаемы, например, при снижении этанола выработки дрожжами , о котором говорится ниже. [ 3 ] [ 4 ]
Приложения
[ редактировать ]Изменение кофактора фермента с НАДФН на НАДН
[ редактировать ]Биокатализаторы необходимы для производства хиральных строительных блоков, необходимых в фармацевтических препаратах и других химических веществах, используемых обществом. Многие такие биокатализаторы требуют НАДФН в качестве кофактора . НАДФН, кофактор, очень похожий на НАДН, более дорогой и менее стабильный, чем его аналог НАДН . По этим причинам производители предпочли бы, чтобы биокатализаторы, которые они используют на своих производственных линиях, принимали НАДН, а не НАДФН. Кофакторная инженерия недавно добилась успеха в изменении ферментов, отдав предпочтение НАДН в качестве кофактора вместо НАДФН. В 2010 году группа ученых выполнила кофакторную инженерию фермента Gre2p , НАДФН-предпочитающей дегидрогеназы , обнаруженной в Saccharomyces cerevisiae . Gre2p восстанавливает составной дикетон 2,5-гександион до хиральных строительных блоков (5S)-гидрокси-2-гексанон и (2S,5S)-гександиол. Ученые определили, что Asn9 ( аспарагин , позиция 9) является важной аминокислотой активного центра Gre2p. В частности, Asn9 связывается с 3'-гидроксильной группой и 2'-атомом кислорода аденилрибозы. часть . Путем прямого мутагенеза ученые заменили Asn9 на Asp ( аспарагиновую кислоту ) и Glu ( глутаминовую кислоту ). Это изменение привело к уменьшению зависимости Gre2p от НАДФН и увеличению сродства к НАДН. Это привело к увеличению активности Gre2p при использовании НАДН. Было замечено, что замена Asn9 на Glu дает больший эффект, чем замена Asn9 на Asp. Asn содержит полярную незаряженную боковую цепь, тогда как Asp и Glu содержат полярно заряженную боковую цепь. Повышенный эффект Glu вызван дополнительным углеродом в его боковой цепи, который приближает его к аденилрибозному фрагменту. Это обеспечивает более прочную водородную связь между 2'- и 3'- гидроксильными группой боковой цепи группами рибозы и карбоксильной . Максимальная скорость реакции увеличивалась вдвое при использовании НАДН при замене Asn9 на Glu. Благодаря этим результатам ученые успешно разработали Gre2p, чтобы он предпочитал НАДН НАДФН, и увеличили скорость восстановления 2,5-гександиона. Это позволит химическим компаниям снизить свои производственные затраты за счет использования НАДН вместо НАДФН, по крайней мере, для этого конкретного снижения. [ 6 ]
Изменение предпочтений кофактора сети
[ редактировать ]Альтернативным примером изменения предпочтения фермента кофакторов является изменение НАДН-зависимой реакции на НАДФН-зависимую реакцию. В этом примере сами ферменты не изменяются, а вместо этого выбираются разные ферменты, которые выполняют ту же реакцию с использованием другого кофактора. Был создан инженерный путь получения 1-бутанола из ацетил-КоА путем изменения ферментов метаболического пути S. elongatus . elongatus . Известно, что род Clostridium продуцирует 1-бутанол, обеспечивая путь, который можно внедрить в S. Этот путь синтезирует 1-бутанол, используя путь обратного β-окисления. Ферменты, участвующие в этом недавно сконструированном пути, были НАДН-специфичными, что было проблематично для репликации этого пути у S. elongatus, поскольку цианобактерии производят гораздо больше НАДФН, чем НАДН.
Затем исследовательская группа путем биопоиска определила ферменты, которые используют НАДФН или НАДФН и НАДН одновременно . Было обнаружено, что ацетоацетил-КоА-редуктаза (PhaB) является подходящей заменой гидроксимасляной дегидрогеназы (Hbd). Чтобы заменить AdhE2, исследователи обнаружили, что НАДФ-зависимая алкогольдегидрогеназа (YqhD) из E. coli эффективна для этого пути. Кроме того, исследователям нужна была дегидрогеназа, чтобы заменить альдегиддегидрогеназную способность AdhE2. Было обнаружено, что КоА-ацилирующая бутиральдегиддегидрогеназа (Bldh) из C. saccharoperbutylacetonicum хорошо подходит. Вместе PhaB, Bldh, YqhD могут заменить Hbd и AdhE2 соответственно, чтобы изменить предпочтение кофактора восстановления 3-кетобутирил-КоА с использования НАДН на использование НАДФН. Затем авторы сконструировали различные комбинации различных ферментов (из тех, что обнаружены в пути обратного окисления, и из ферментов, использующих НАДФН) путем сверхэкспрессии различных генов в культурах S. elongatus PCC 7942. Для этого они сконструировали плазмиды, содержащие гены, соответствующие ферментам, и объединили их в геном S. elongates. После ферментативного анализа штамм цианобактерий, экспрессирующий НАДФН с использованием ферментов, продуцировал наибольшее количество 1-бутанола (29,9 мг/л), в четыре раза превышая таковое у штаммов, не состоящих из НАДФН с использованием ферментов. В целом, 1-бутанол вырабатывался у S. elongatus по пути другого организма. Этот путь был модифицирован, чтобы соответствовать предпочтительному восстанавливающему кофактору для цианобактерий. [ 7 ]
Изменение потока метаболитов с помощью кофакторного равновесия
[ редактировать ]При кофакторной инженерии метаболический путь изменяется путем изменения концентраций конкретных кофакторов, которые производятся либо в этом конкретном пути, либо в отдельном пути. Например, гипотетический организм может иметь два произвольных пути, называемых A и B, где некоторые ферменты как в A, так и в B используют одни и те же кофакторы. Если ученые хотят уменьшить выходную мощность пути А, они могут сначала рассмотреть возможность непосредственной инженерии ферментов, участвующих в пути А, возможно, чтобы уменьшить определенного активного центра сродство к его субстрату . Однако в некоторых случаях ферменты A может быть сложно сконструировать по разным причинам, или их может быть невозможно сконструировать без опасного воздействия на какой-то третий метаболический путь C, в котором используются те же ферменты. В качестве отдельного варианта ученые могли бы увеличить поток B, что, возможно, будет проще спроектировать. Это, в свою очередь, может «связать» кофакторы, необходимые для А, что замедлит ферментативную активность , снижая выработку А. Это один гипотетический пример того, как можно использовать кофакторную инженерию, но есть много других уникальных случаев, когда ученые используют кофакторы в качестве способ изменения метаболических путей. Основным преимуществом кофакторной инженерии является то, что ученые могут использовать ее для успешного изменения метаболических путей, которые трудно спроектировать с помощью обычной метаболической инженерии. Это достигается за счет воздействия на более легко сконструированные ферменты в отдельных путях, в которых используются одни и те же кофакторы. Поскольку многие кофакторы используются различными ферментами по нескольким путям, кофакторная инженерия может быть эффективной и экономически выгодной альтернативой современным методам метаболической инженерии. [ 8 ]
Дрожжи обычно используются в пивоваренной и винодельческой промышленности, поскольку они способны эффективно производить этанол посредством метаболического пути ферментации в отсутствие кислорода. Для ферментации необходим фермент глицерин-3-фосфатдегидрогеназа (GPDH), который зависит от кофактора НАДН . Этот путь включает превращение глюкозы в этанол и глицерин , оба из которых используют НАДН в качестве кофактора . Ученые разработали Saccharomyces cerevisiae клеток для перепроизводства GPDH, что сместило метаболический поток от этанола к глицерину, ограничивая доступность NADH на участке пути производства этанола. Противоположный эффект был достигнут за счет воздействия на отдельный путь в клетке — глутамата путь синтеза . Инактивация экспрессии фермента глутаматдегидрогеназы , которая зависит от НАДФН , и чрезмерная экспрессия ферментов глутаминсинтетаз и глутаматсинтетазы , которые полагаются на НАДН в качестве кофактора, сместили баланс кофакторов в пути синтеза глутамата. Этот путь теперь зависит от НАДН, а не от НАДФН, что снижает доступность НАДН в пути ферментации. Это, в свою очередь, приводит к увеличению производства этанола и снижению производство глицерина . Этот метод управления метаболическими потоками можно представить себе так же, как глобальные рынки топлива, где увеличение производства этанола для использования в автомобильной промышленности приведет к снижению его доступности в пищевой промышленности. По сути, производство большего количества двигателей, работающих на этаноле, может привести к снижению потребления обработанных сладостей, содержащих кукурузный сироп с высоким содержанием фруктозы . Эта разработка кофакторов применима в пивоваренной и винодельческой промышленности, поскольку позволяет регулировать уровень этанола в алкогольных напитках. Достижения в винодельческой промышленности привели к постоянному увеличению содержания этанола, поэтому виноделы, в частности, были бы заинтересованы в возможности снижения уровня этанола в некоторых из своих вин. [ 3 ]
Цикл лимонной кислоты
[ редактировать ]Коэнзим А (КоА) и ацетил-КоА — два промежуточных метаболита , наиболее часто встречающиеся в цикле лимонной кислоты , которые участвуют в более чем 100 различных реакциях метаболизма микроорганизмов . Недавние эксперименты показали, что чрезмерная экспрессия фермента пантотенаткиназы и добавление пантотеновой кислоты в путь биосинтеза КоА позволили регулировать потоки как КоА, так и ацетил-КоА. Эта повышенная концентрация кофакторов привела к увеличению потока углерода в пути синтеза изоамилацетата , что повысило эффективность производства изоамилацетата. Изоамилацетат используется в промышленности для создания искусственных ароматизаторов и для проверки эффективности респираторов . Помимо производства изоамилацетата, манипуляции с биосинтезом КоА во время пируватгидрогеназной , реакции также вызывают увеличение выработки как сукцината так и ликопина , каждый из которых оказывает благотворное воздействие на организм человека. Увеличение концентрации сукцината, который используется в качестве катализатор , может привести к увеличению скорости цикла лимонной кислоты и, следовательно, метаболизма человека . Было показано, что увеличение концентрации ликопина снижает риск рака простаты . Потенциальные выгоды от повторения такого подвига кофакторной разработки и успешного внедрения его в отраслевую практику неисчислимы. [ 4 ] [ 9 ] [ 10 ]
Производство бумаги
[ редактировать ]Многие важные промышленные ферменты используют кофакторы для катализа реакций. Используя кофакторы для управления метаболическими путями , можно снизить материальные затраты, исключить этапы производства, сократить время производства, уменьшить загрязнение и повысить общую эффективность производства. Одним из случаев, демонстрирующих некоторые из этих производственных преимуществ, является генная инженерия осин . В процессе производства бумаги предприятия-производители должны расщеплять лигнин , биохимическое соединение, придающее стволу дерева жесткость, чтобы сформировать целлюлозу, используемую на протяжении всей остальной части производства. Процесс химической варки целлюлозы требует от производственного предприятия использования значительного количества энергии, а также многих дорогих и токсичных химикатов. Группа генных инженеров с помощью кофакторной инженерии создала генетически превосходящую осину , которая производила меньше лигнина. Эти генетически модифицированные деревья позволили бумажным фабрикам сократить затраты, загрязнение окружающей среды и время производства. [ 1 ] [ 11 ]
Другие примеры
[ редактировать ]| Организм | Что изменилось | Что это значит |
|---|---|---|
| Микобактерия смегматис | Коэнзим F420 | Может отключить кофактор , который приводит к лекарственно-устойчивому туберкулезу [ 12 ] |
| Цианобактерии | Железомолибденовый кофактор | Производство водорода для энергетики [ 13 ] |
| Королевство Архея | молибденнитрогеназы Кофактор | Повышение эффективности фиксации азота [ 14 ] |
| Термоанаэробактерии матрании | глицериндегидрогеназа | Заставьте термофильные бактерии производить этанол более эффективно [ 15 ] |
Краткое описание других важных примеров использования кофакторной инженерии.
Примечания
[ редактировать ]- ^ Перейти обратно: а б с Рааб, Майкл; Кейт Тайро; Грегори Стефанопулос (2005). «Метаболическая инженерия». Достижения в области биохимической инженерии/биотехнологии . 100 (763): 1–17. дои : 10.1007/b136411 . ПМИД 16270654 . S2CID 21169566 .
- ^ Поллак, Н; С Долле; М. Зиглер (2006). «Сила восстановления: пиридиновые нуклеотиды — небольшие молекулы с множеством функций» . Биохимический журнал . 402 (2): 205–218. дои : 10.1042/BJ20061638 . ПМК 1798440 . ПМИД 17295611 .
- ^ Перейти обратно: а б с Heux, Стефани; Реми Кашон; Сильви Декен (2006). «Кофакторная инженерия в Saccharomyces cerevisiae: экспрессия H2O-образующей НАДН-оксидазы и влияние на окислительно-восстановительный метаболизм». Метаболическая инженерия . 8 (4): 303–314. дои : 10.1016/j.ymben.2005.12.003 . ПМИД 16473032 .
- ^ Перейти обратно: а б с Вадали, Равишанкар; Джордж Беннетт (апрель 2004 г.). «Кофакторная инженерия внутриклеточного КоА/ацетил-КоА и ее влияние на перераспределение метаболического потока в Escherichia coli». Метаболическая инженерия . 6 (2): 133–139. дои : 10.1016/j.ymben.2004.02.001 . ПМИД 15113566 .
- ^ Артур Харден и Уильям Джон Янг. «Алкогольная закваска дрожжевого сока». Труды Лондонского королевского общества. Серия Б, содержащая статьи биологического характера, Том. 77, № 519 (12 апреля 1906 г.), стр. 405–420 JSTOR.
- ^ Кацберг, Майкл; Надя Скорупа-Парачин; Мари-Франсуаза Горва-Грауслунд; Мартин Бертау (2010). «Инженерное предпочтение кофакторов кетонвосстанавливающих биокатализаторов: исследование мутагенеза γ-дикетонредуктазы из дрожжей Saccharomyces cerevisiae» . Международный журнал молекулярных наук . 11 (4): 1735–1758. дои : 10.3390/ijms11041735 . ПМЦ 2871135 . ПМИД 20480039 .
- ^ Итан Лан; Джеймс Ляо (17 апреля 2012 г.). «АТФ стимулирует прямое фотосинтетическое производство 1-бутанола в цианобактериях» . Труды Национальной академии наук . 109 (16): 6018–6023. Бибкод : 2012PNAS..109.6018L . дои : 10.1073/pnas.1200074109 . ПМК 3341080 . ПМИД 22474341 .
- ^ Сан, Ка-Ю; Джордж Н. Беннетт; Сусана Х. Берриос-Ривера; Рави В. Вадали; Да-Тынг Ян; Эмили Хортон; Фред Б. Рудольф; Берна Сарияр; Кимати Блэквуд (апрель 2002 г.). «Метаболическая инженерия посредством манипулирования кофакторами и ее влияние на перераспределение метаболических потоков в Escherichia Coli». Метаболическая инженерия . 4 (2): 182–193. дои : 10.1006/mben.2001.0220 . ПМИД 12009797 . [ мертвая ссылка ]
- ^ Джовануччи, Эдвард; Альберто Ашерио; Эрик Римм; Меир Штампфер; Грэм Колдиц; Уолтер Уиллетт (май 1995 г.). «Потребление каротиноидов и ретино в связи с риском рака простаты». Журнал Национального института рака . 87 (23): 1767–1776. дои : 10.1093/jnci/87.23.1767 . ПМИД 7473833 .
- ^ Потера, Кэрол (декабрь 2005 г.). «Делаем сукцинат более успешным» . Перспективы гигиены окружающей среды . 113 (12): А832–А835. дои : 10.1289/ehp.113-a832 . ПМЦ 1314946 . ПМИД 16330341 .
- ^ Хорват, Ласло; Илона Песлен; Перри Перальта; Богумил Касал; Лайгэн Ли (2010). «Механические свойства генно-инженерной молодой осины с модифицированным содержанием и/или структурой лигнина». Наука о дереве и волокнах . 42 .
- ^ Башири, Г; Рехан, AM; Гринвуд, ДР; Диксон, Дж. М.; Бейкер, EN (2010). «Метаболическая инженерия производства кофактора F420 в Mycobacterium smegmatis» . ПЛОС ОДИН . 5 (12): e15803. Бибкод : 2010PLoSO...515803B . дои : 10.1371/journal.pone.0015803 . ПМК 3012119 . ПМИД 21209917 .
- ^ Масукава, Х; Иноуэ, К; Сакурай, Х; Волк, КП; Хаузингер, Р.П. (2010). «Сайт-направленный мутагенез активного центра нитрогеназы штамма Anabaena sp. PCC 7120 для увеличения фотобиологического производства водорода» . Прикладная и экологическая микробиология . 76 (20): 6741–50. Бибкод : 2010ApEnM..76.6741M . дои : 10.1128/aem.01056-10 . ПМЦ 2953041 . ПМИД 20709836 .
- ^ Эрнандес, Дж.А.; Куратти, Л; Азнар, КП; Перова З; Бритт, доктор медицинских наук; Рубио, LM. (2008). «Торговля металлами для фиксации азота: NifQ передает молибден NifEN/NifH для биосинтеза нитротазного кофактора FeMo» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 105 (33): 11679–8. дои : 10.1073/pnas.0803576105 . ПМЦ 2575292 . ПМИД 18697927 .
- ^ Яо, С; Миккельсен, МЮ. (2010). «Метаболическая инженерия для улучшения производства этанола у Thermoanaerobacter mathranii». Прикладная микробиология и биотехнология . 88 (1): 199–208. дои : 10.1007/s00253-010-2703-3 . ПМИД 20552355 . S2CID 25646005 .