Криогенная электронная томография

Криогенная электронная томография ( Cryoet )-это метод визуализации, используемый для реконструкции трехмерных объемов образцов с высоким разрешением (~ 1–4 нм), часто (но не ограничивается) биологическими макромолекулами и клетками . ^{[ 1 ]}^{[ 2 ]} CRYOET - это специализированное применение криоомрикроскопии электронного электрона (криотем), в которой образцы изображаются по мере их наклонения, что приводит к серии двухмерных изображений, которые можно объединить для получения 3D -реконструкции, аналогично компьютерной сканированию человеческого тела. В отличие от других методов электронной томографии , образцы визуализируются в криогенных условиях (<-150 ° C). Для клеточного материала структура иммобилизуется в некристаллическом, стекловидном льду , что позволяет им изображать без дегидратации или химической фиксации , что в противном случае нарушило бы или искажает биологические структуры. ^{[ 3 ]}^{[ 4 ]}

Описание техники

В электронной микроскопии (EM) образцы изображаются в высоком вакууме . Такой вакуум несовместим с биологическими образцами, такими как клетки; Вода закипит, и разница в давлении взорвется ячейкой. В технике EM-температуры в комнатной температуре образцы готовятся путем фиксации и обезвоживания. Однако еще один подход к стабилизации биологических образцов заключается в их замораживании ( криоэлектронная микроскопия или криоем). Как и в других методах криомикроскопии электронов, образцы для криота (обычно мелкие клетки, такие как бактерии , археи или вирусы ), готовятся в стандартной водной среде и применяются к сетке EM. Затем сетка погружается в криоген (обычно жидкий этан ) так эффективно так, чтобы воды молекулы не имели времени на перестройку в кристаллическую решетку. ^{[ 3 ]} Полученное состояние воды называется «ледяным льдом» и сохраняет нативные клеточные структуры, такие как липидные мембраны , которые обычно разрушаются замораживанием. Впоследствии образцы замороженных погружений сохраняются при температурах жидкости-азота посредством хранения и визуализации, так что вода никогда не нагревается достаточно для кристаллизации.

Образцы визуализируются в просвечивающем электронном микроскопе (ПЭМ). Как и в других методах электронной томографии , образец наклоняется к разным углам по сравнению с электронным пучком (обычно каждые 1 или 2 градуса от примерно -60 ° до +60 °), а изображение получается под каждым углом. ^{[ 5 ]} Этот наклонный сериал изображений может быть затем вычислительно реконструирован в трехмерный вид интересующего объекта. ^{[ 6 ]} Это называется томограммой или томографической реконструкцией .

с высоким разрешением in situ Потенциал для визуализации

Одним из наиболее часто цитируемых преимуществ Cryoet является способность реконструировать трехмерные объемы отдельных объектов (белки, клетки и т. Д. ), А не для необходимости нескольких копий образца в кристаллографических методах или в других методах криоэма, таких как анализ отдельных частиц . ^{[ 7 ]} Cryoet считается методом in situ , когда используется в невозмутимой ячейке или другой системе, поскольку замораживание погружения фиксирует образец на месте достаточно быстро, чтобы вызвать минимальные изменения в атомном позиционировании. ^{[ 8 ]}

Соображения

Толщина образца

В микроскопии электронной электронной микроскопии (TEM), поскольку электроны сильно взаимодействуют с веществом , образцы должны быть очень тонкими, чтобы не вызывать темнеть образцы из -за множественных событий упругого рассеяния . Следовательно, в Cryoet образцы, как правило, меньше ~ 500 нм толщиной. По этой причине большинство исследований Cryoet были сосредоточены на очищенных макромолекулярных комплексах , вирусах или мелких клетках, таких как виды многих видов бактерий и археи. ^{[ 1 ]} Например, Cryoet использовался для понимания инкапсуляции наночастиц белковой клетки размером 12 нм внутри 60 нм, подобных наночастицам, подобным вирусам. ^{[ 9 ]}

Большие клетки и даже ткани могут быть подготовлены к криоте с помощью прореживания, либо крио-сечением, либо с фокусированным ионным пучком (FIB). В крио-сечении замороженные блоки клеток или ткани разделяются на тонкие образцы с помощью криоцикротома . ^{[ 11 ]} При промывании FIB образцы замороженных погружений подвергаются воздействию сфокусированного луча ионов, обычно галлий , который точно отстраняется от материала сверху и дна образца, оставляя тонкую ламеллу, подходящую для визуализации Cryoet. ^{[ 12 ]}

Отношение сигнал / шум

Для структур, которые присутствуют в нескольких копиях в одной или нескольких томограммах, более высокое разрешение (даже ≤1 нм) может быть получено с помощью усреднения субтомограммы . ^{[ 13 ]}^{[ 14 ]} Подобно анализу отдельных частиц, в среднем субтомограмм вычислительно объединяется изображения идентичных объектов для увеличения отношения сигнал / шум .

Ограничения

Радиационное повреждение

Известно, что электронная микроскопия быстро распадает биологические образцы по сравнению с образцами в области материаловедения и физики из -за повреждения радиации . ^{[ 15 ]} В большинстве других методов биологических образцов на основе визуализации биологических образцов, основанных на визуализации, объединение сигнала из многих различных копий образца было общим способом превзойти эту проблему ( например, кристаллография, анализ отдельных частиц). В Cryoet, вместо того, чтобы делать много изображений различных образцов копий, много изображений снимаются из одной области. Следовательно, флюенс (количество электронов, придаваемых на единицу площади) на образце, примерно в 2-5 раз больше, чем при анализе отдельных частиц. ^{[ 16 ]} Томография на материалах, гораздо более устойчивом, позволяет резко более высокое разрешение, чем типичная биологическая визуализация, что позволяет предположить, что повреждение радиации является наибольшим ограничением для криота биологических образцов. ^{[ 7 ]}^{[ 17 ]}

Разрешение глубины

Сильное взаимодействие электронов с веществом также приводит к эффекту анизотропного разрешения. Когда образец наклоняется во время визуализации, электронный луч взаимодействует с более толстым кажущимся образцом вдоль оптической оси микроскопа при более высоких углах наклона. На практике углы наклона больше, чем приблизительно 60–70 °, не дают много информации и поэтому не используются. Это приводит к «отсутствующему клинку» информации в конечной томограмме, которая уменьшает разрешение, параллельное электронному лучу. ^{[ 6 ]}

Термин «отсутствующий клин» исходит от обзора преобразования Фурье томограммы, где пустой клин очевиден из -за не наклонения образца до 90 °. Отсутствующий клин приводит к отсутствию разрешения по глубине выборки, поскольку недостающая информация в основном вдоль оси Z. Отсутствующий клин также является проблемой в трехмерной электронной кристаллографии , где он обычно решается путем объединения нескольких наборов данных, которые перекрывают друг друга или посредством расширения симметрии , где это возможно. ^{[ 15 ]} Оба эти решения связаны с природой кристаллографии, и поэтому ни одно из них не может быть применено к томографии.

Сегментация

Основным препятствием в Cryoet является выявление интересующих структур в сложных клеточных средах. Такие решения, как коррелированная криофлуоресцентная световая микроскопия , ^{[ 19 ]} и легкая микроскопия супер-разрешения (например, крио-палм ^{[ 20 ]}) может быть интегрирован с Cryoet. В этих методах образец, содержащий флуоресцентно меченного белка, представляющего интерес, представляет собой замороженное и первое изображение в световом микроскопе, оснащенном специальной стадией, позволяющей сохранять образцы при температурах субкрасталлизации (<-150 ° C). Расположение флуоресцентного сигнала идентифицируется, и образец переносится в криотем, где то же местоположение затем отображается при высоком разрешении Cryoet.

Смотрите также

Ссылки

^ Jump up to: ^а ^{беременный} Ган, Лу; Дженсен, Грант Дж. (2012-02-01). «Электронная томография клеток» (PDF) . Ежеквартальные обзоры биофизики . 45 (1): 27–56. doi : 10.1017/s0033583511000102 . ISSN 1469-8994 . PMID 22082691 . S2CID 11458204 .
^ Додонова, Светлана О; Aderhold, Patrick; Копп, Юрген; Ганева, Ива; Röhling, Simone; Хаген, Wim JH; Грешник, irmgard; Виланд, Феликс; Бриггс, Джон А.Г. (2017-06-16). «Структура 9 вка Copi Poem показывает, что GTPase ARF1 занимает две контрастные молекулярные среды» . элиф . 6 doi : 10.7554/elife.26691 . ISSN 2050-084X . PMC 5482573 . PMID 28621666 .
^ Jump up to: ^а ^{беременный} Dubochet, J.; Адриан, М.; Чанг, JJ; Homo, JC; Lepault, J.; McDowall, AW; Schultz, P. (1988-05-01). «Криоэлектронная микроскопия ослабленных образцов» (PDF) . Ежеквартальные обзоры биофизики . 21 (2): 129–228. doi : 10.1017/s0033583500004297 . ISSN 0033-5835 . PMID 3043536 . S2CID 2741633 .
^ Oikonomou, CM; Дженсен, GJ; Чанг, YW (апрель 2016 г.). «Новый взгляд на прокариотическую клеточную биологию из электронной криотомографии» . Природные обзоры. Микробиология . 14 (4): 205–20. doi : 10.1038/nrmicro.2016.7 . PMC 5551487 . PMID 26923112 .
^ Р. Ховден; Да Мюллер (2020). «Электронная томография для функциональных наноматериалов». Миссис Бюллетена . 45 (4): 298–304. Arxiv : 2006.01652 . Bibcode : 2020mrsbu..45..298h . doi : 10.1557/mrs.2020.87 . S2CID 216522865 .
^ Jump up to: ^а ^{беременный} Лучич, Владан; Фригорт, Александр; Baumeister, Wolfgang (2013-08-05). «Криоэлектронная томография: задача проведения структурной биологии на месте» . Журнал клеточной биологии . 202 (3): 407–419. doi : 10.1083/jcb.201304193 . ISSN 1540-8140 . PMC 3734081 . PMID 23918936 .
^ Jump up to: ^а ^{беременный} Bäuerlein, Felix JB; Baumeister, Wolfgang (2021-10-01). «На пути к визуальной протеомике при высоком разрешении» . Журнал молекулярной биологии . От белковой последовательности до структуры при скорости деформации: как альфафолд влияет на биологию. 433 (20): 167187. DOI : 10.1016/j.jmb.2021.167187 . ISSN 0022-2836 .
^ Адриан, Марк; Дюбошет, Жак; Лепо, Джин; McDowall, Alasdair W. (март 1984 г.). «Криоэлектронная микроскопия вирусов» . Природа . 308 (5954): 32–36. doi : 10.1038/308032A0 . ISSN 1476-4687 .
^ Waghwani HK, Uchida M, Douglas, T (апрель 2020 г.). «Вирус-подобные частицы (VLP) в качестве платформы для иерархической комбинации» . Биомакромолекулы . 21 (6): 2060–2072. doi : 10.1021/acs.biomac.0c00030 . PMID 32319761 .
^ Вершина, Дэвид; Ван, Зитксин; Вагнер, Торстен; Таке, Себастьян; Стабрин, Маркус; Грандж, Майкл; Хо, Ай Лин; Рис, Мартин; Беннетт, Полин; Гаутел, Матиас; Раунсер, Стивен (2023-12-23), «Структура местного мифина мифина в расслабленном сердечном саркомере. , Nature , doi : 10.1038/s41586-023-06690-5 , pmc 10665186
^ Аль-Муди, Ашраф; Чанг, Джин-дю; Лебестер, Амели; McDowall, Alasdair; Саламин, Лоуэ Мишель; Норлен, Ларс По; Рихтер, Карстен; Блан, Натали Сартори; Студент, Даниэль (2004-09-15). «Криоэлектронная микроскопия стекловидных срезов » Embo Journal 23 (18): 3583–3 Doi : 10.1038/ sj.emboj.7600366 ISSN 0261-4 517607PMC 15318169PMID
^ Вилла, Элизабет ; Шаффер, Мирослава; Plitzko, Jürgen M.; Baumeister, Wolfgang (2013-10-01). «Открытие окон в ячейку: сфокусированное ионное фрезерование для криоэлектронной томографии». Современное мнение в структурной биологии . 23 (5): 771–777. doi : 10.1016/j.sbi.2013.08.006 . ISSN 1879-033X . PMID 24090931 .
^ Бриггс, Джон А.Г. (2013-04-01). «Структурная биология in situ - потенциал усреднения в субтомограмме». Современное мнение в структурной биологии . 23 (2): 261–267. doi : 10.1016/j.sbi.2013.02.003 . ISSN 1879-033X . PMID 23466038 .
^ Шур, Флориан К.М.; Дик, Роберт А.; Хаген, Wim JH; Vogt, Volker M.; Бриггс, Джон А.Г. (2015-10-15). «Структура незрелых вирусных частиц Rous Sarcoma Parsma Gag выявляет структурную роль домена P10 в сборке» . Журнал вирусологии . 89 (20): 10294–10302. doi : 10.1128/jvi.01502-15 . ISSN 1098-5514 . PMC 4580193 . PMID 26223638 .
^ Jump up to: ^а ^{беременный} Саха, Амбарнейл; Ниа, Шервин С.; Родригес, Хосе А. (2022-09-14). «Электронная дифракция трехмерных молекулярных кристаллов» . Химические обзоры . 122 (17): 13883–13914. doi : 10.1021/acs.chemrev.1c00879 . ISSN 0009-2665 . PMC 9479085 . PMID 35970513 .
^ Шмид, Майкл Ф. (2011-01-01), Лудтке, Стивен Дж.; Венкатарам Прасад, BV (Eds.), «Глава 2 - Криотомография с одночастичной электронной (Cryoet)» , достижения в химии белков и структурной биологии , последние достижения в области криомикроскопии электронов, часть B, Vol. 82, Academic Press, стр. 37–65, doi : 10.1016/b978-0-12-386507-6.0000002-6 , получен 2024-01-07
^ Скотт, MC; Чен, Чиен-Чун; Мекленбург, Мэтью; Чжу, Чун; Сюй, Руи; Эрсиус, Петр; Дамэнь, Ульрих; Риган, Британская Колумбия; Мяо, Цзяньвей (март 2012 г.). «Электронная томография при разрешении 2,4-онгстрёма» . Природа . 483 (7390): 444–447. Doi : 10.1038/nature10934 . ISSN 1476-4687 .
^ Хаген, Wim JH; Ван, Уильям; Бриггс, Джон А.Г. (2017-02-01). «Реализация криоэлектронной томографии наклона наклона, оптимизированная для усреднений в подборе высокого разрешения» . Журнал структурной биологии . Электронная томография. 197 (2): 191–198. doi : 10.1016/j.jsb.2016.06.007 . ISSN 1047-8477 . PMC 5287356 . PMID 27313000 .
^ Чжан, Пейджун (2013-10-01). «Корреляционная криоэлектронная томография и оптическая микроскопия клеток» . Современное мнение в структурной биологии . 23 (5): 763–770. doi : 10.1016/j.sbi.2013.07.017 . ISSN 1879-033X . PMC 3812453 . PMID 23962486 .
^ Чанг, И-Вай; Чен, Сонье; Tocheva, Elitza I.; Trauner-Lange, Anke; Лобах, Стефани; Søgaard-Andersen, Lotte; Дженсен, Грант Дж. (2014-07-01). «Коррелированная криогенная фотоактивированная микроскопия локализации и крио-электронная томография» . Природные методы . 11 (7): 737–739. doi : 10.1038/nmeth.2961 . ISSN 1548-7105 . PMC 4081473 . PMID 24813625 .

Внешние ссылки

Начало работы на курсе Cryo-EM (Caltech)

[:0-1] Jump up to: ^а ^{беременный} Ган, Лу; Дженсен, Грант Дж. (2012-02-01). «Электронная томография клеток» (PDF) . Ежеквартальные обзоры биофизики . 45 (1): 27–56. doi : 10.1017/s0033583511000102 . ISSN 1469-8994 . PMID 22082691 . S2CID 11458204 .

[2] Додонова, Светлана О; Aderhold, Patrick; Копп, Юрген; Ганева, Ива; Röhling, Simone; Хаген, Wim JH; Грешник, irmgard; Виланд, Феликс; Бриггс, Джон А.Г. (2017-06-16). «Структура 9 вка Copi Poem показывает, что GTPase ARF1 занимает две контрастные молекулярные среды» . элиф . 6 doi : 10.7554/elife.26691 . ISSN 2050-084X . PMC 5482573 . PMID 28621666 .

[:1-3] Jump up to: ^а ^{беременный} Dubochet, J.; Адриан, М.; Чанг, JJ; Homo, JC; Lepault, J.; McDowall, AW; Schultz, P. (1988-05-01). «Криоэлектронная микроскопия ослабленных образцов» (PDF) . Ежеквартальные обзоры биофизики . 21 (2): 129–228. doi : 10.1017/s0033583500004297 . ISSN 0033-5835 . PMID 3043536 . S2CID 2741633 .

[Oikonomou-4] Oikonomou, CM; Дженсен, GJ; Чанг, YW (апрель 2016 г.). «Новый взгляд на прокариотическую клеточную биологию из электронной криотомографии» . Природные обзоры. Микробиология . 14 (4): 205–20. doi : 10.1038/nrmicro.2016.7 . PMC 5551487 . PMID 26923112 .

[Muller-5] Р. Ховден; Да Мюллер (2020). «Электронная томография для функциональных наноматериалов». Миссис Бюллетена . 45 (4): 298–304. Arxiv : 2006.01652 . Bibcode : 2020mrsbu..45..298h . doi : 10.1557/mrs.2020.87 . S2CID 216522865 .

[:2-6] Jump up to: ^а ^{беременный} Лучич, Владан; Фригорт, Александр; Baumeister, Wolfgang (2013-08-05). «Криоэлектронная томография: задача проведения структурной биологии на месте» . Журнал клеточной биологии . 202 (3): 407–419. doi : 10.1083/jcb.201304193 . ISSN 1540-8140 . PMC 3734081 . PMID 23918936 .

[:4-7] Jump up to: ^а ^{беременный} Bäuerlein, Felix JB; Baumeister, Wolfgang (2021-10-01). «На пути к визуальной протеомике при высоком разрешении» . Журнал молекулярной биологии . От белковой последовательности до структуры при скорости деформации: как альфафолд влияет на биологию. 433 (20): 167187. DOI : 10.1016/j.jmb.2021.167187 . ISSN 0022-2836 .

[8] Адриан, Марк; Дюбошет, Жак; Лепо, Джин; McDowall, Alasdair W. (март 1984 г.). «Криоэлектронная микроскопия вирусов» . Природа . 308 (5954): 32–36. doi : 10.1038/308032A0 . ISSN 1476-4687 .

[9] Waghwani HK, Uchida M, Douglas, T (апрель 2020 г.). «Вирус-подобные частицы (VLP) в качестве платформы для иерархической комбинации» . Биомакромолекулы . 21 (6): 2060–2072. doi : 10.1021/acs.biomac.0c00030 . PMID 32319761 .

[10] Вершина, Дэвид; Ван, Зитксин; Вагнер, Торстен; Таке, Себастьян; Стабрин, Маркус; Грандж, Майкл; Хо, Ай Лин; Рис, Мартин; Беннетт, Полин; Гаутел, Матиас; Раунсер, Стивен (2023-12-23), «Структура местного мифина мифина в расслабленном сердечном саркомере. , Nature , doi : 10.1038/s41586-023-06690-5 , pmc 10665186

[11] Аль-Муди, Ашраф; Чанг, Джин-дю; Лебестер, Амели; McDowall, Alasdair; Саламин, Лоуэ Мишель; Норлен, Ларс По; Рихтер, Карстен; Блан, Натали Сартори; Студент, Даниэль (2004-09-15). «Криоэлектронная микроскопия стекловидных срезов » Embo Journal 23 (18): 3583–3 Doi : 10.1038/ sj.emboj.7600366 ISSN 0261-4 517607PMC 15318169PMID

[12] Вилла, Элизабет ; Шаффер, Мирослава; Plitzko, Jürgen M.; Baumeister, Wolfgang (2013-10-01). «Открытие окон в ячейку: сфокусированное ионное фрезерование для криоэлектронной томографии». Современное мнение в структурной биологии . 23 (5): 771–777. doi : 10.1016/j.sbi.2013.08.006 . ISSN 1879-033X . PMID 24090931 .

[13] Бриггс, Джон А.Г. (2013-04-01). «Структурная биология in situ - потенциал усреднения в субтомограмме». Современное мнение в структурной биологии . 23 (2): 261–267. doi : 10.1016/j.sbi.2013.02.003 . ISSN 1879-033X . PMID 23466038 .

[14] Шур, Флориан К.М.; Дик, Роберт А.; Хаген, Wim JH; Vogt, Volker M.; Бриггс, Джон А.Г. (2015-10-15). «Структура незрелых вирусных частиц Rous Sarcoma Parsma Gag выявляет структурную роль домена P10 в сборке» . Журнал вирусологии . 89 (20): 10294–10302. doi : 10.1128/jvi.01502-15 . ISSN 1098-5514 . PMC 4580193 . PMID 26223638 .

[:3-15] Jump up to: ^а ^{беременный} Саха, Амбарнейл; Ниа, Шервин С.; Родригес, Хосе А. (2022-09-14). «Электронная дифракция трехмерных молекулярных кристаллов» . Химические обзоры . 122 (17): 13883–13914. doi : 10.1021/acs.chemrev.1c00879 . ISSN 0009-2665 . PMC 9479085 . PMID 35970513 .

[16] Шмид, Майкл Ф. (2011-01-01), Лудтке, Стивен Дж.; Венкатарам Прасад, BV (Eds.), «Глава 2 - Криотомография с одночастичной электронной (Cryoet)» , достижения в химии белков и структурной биологии , последние достижения в области криомикроскопии электронов, часть B, Vol. 82, Academic Press, стр. 37–65, doi : 10.1016/b978-0-12-386507-6.0000002-6 , получен 2024-01-07

[17] Скотт, MC; Чен, Чиен-Чун; Мекленбург, Мэтью; Чжу, Чун; Сюй, Руи; Эрсиус, Петр; Дамэнь, Ульрих; Риган, Британская Колумбия; Мяо, Цзяньвей (март 2012 г.). «Электронная томография при разрешении 2,4-онгстрёма» . Природа . 483 (7390): 444–447. Doi : 10.1038/nature10934 . ISSN 1476-4687 .

[18] Хаген, Wim JH; Ван, Уильям; Бриггс, Джон А.Г. (2017-02-01). «Реализация криоэлектронной томографии наклона наклона, оптимизированная для усреднений в подборе высокого разрешения» . Журнал структурной биологии . Электронная томография. 197 (2): 191–198. doi : 10.1016/j.jsb.2016.06.007 . ISSN 1047-8477 . PMC 5287356 . PMID 27313000 .

[19] Чжан, Пейджун (2013-10-01). «Корреляционная криоэлектронная томография и оптическая микроскопия клеток» . Современное мнение в структурной биологии . 23 (5): 763–770. doi : 10.1016/j.sbi.2013.07.017 . ISSN 1879-033X . PMC 3812453 . PMID 23962486 .

[20] Чанг, И-Вай; Чен, Сонье; Tocheva, Elitza I.; Trauner-Lange, Anke; Лобах, Стефани; Søgaard-Andersen, Lotte; Дженсен, Грант Дж. (2014-07-01). «Коррелированная криогенная фотоактивированная микроскопия локализации и крио-электронная томография» . Природные методы . 11 (7): 737–739. doi : 10.1038/nmeth.2961 . ISSN 1548-7105 . PMC 4081473 . PMID 24813625 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]

[ 11 ]

[ 12 ]

[ 13 ]

[ 14 ]

[ 15 ]

[ 16 ]

[ 17 ]

[ 18 ]

[ 19 ]

[ 20 ]