Криогенная электронная томография
Криогенная электронная томография ( криоЭТ ) — это метод визуализации, используемый для реконструкции трехмерных объемов образцов с высоким разрешением (~ 1–4 нм), часто (но не ограничиваясь ими) биологических макромолекул и клеток . [1] [2] CryoET — это специализированное применение трансмиссионной электронной криомикроскопии (CryoTEM), при котором образцы визуализируются под наклоном, в результате чего получается серия 2D-изображений, которые можно объединить для создания 3D-реконструкции, аналогичной компьютерной томографии человеческого тела. В отличие от других методов электронной томографии , изображения образцов получаются в криогенных условиях (< –150 °C). Структура клеточного материала иммобилизуется в некристаллическом стекловидном льду , что позволяет визуализировать его без обезвоживания или химической фиксации , которые в противном случае могли бы разрушить или исказить биологические структуры. [3] [4]
Описание техники
[ редактировать ]
В электронной микроскопии (ЭМ) образцы получают в высоком вакууме . Такой вакуум несовместим с биологическими образцами, такими как клетки; вода выкипит, и разница в давлении взорвет ячейку. Поэтому при использовании методов ЭМ при комнатной температуре образцы готовят путем фиксации и обезвоживания. Однако другим подходом к стабилизации биологических образцов является их замораживание ( криоэлектронная микроскопия или криоЭМ). Как и в других методах электронной криомикроскопии, образцы для криоЭТ (обычно небольшие клетки, такие как бактерии , археи или вирусы ) готовятся в стандартной водной среде и наносятся на ЭМ-сетку. Затем сетку погружают в криоген (обычно жидкий этан ) настолько эффективно, что воды молекулы не успевают перестроиться в кристаллическую решетку. [3] Получающееся в результате состояние воды называется «стекловидным льдом» и сохраняет нативные клеточные структуры, такие как липидные мембраны , которые обычно разрушаются при замерзании. Замороженные образцы впоследствии хранятся при температуре жидкого азота при хранении и визуализации, так что вода никогда не нагревается настолько, чтобы кристаллизоваться.
Образцы визуализируются в просвечивающем электронном микроскопе (ПЭМ). Как и в других методах электронной томографии , образец наклоняется под разными углами относительно электронного луча (обычно каждые 1 или 2 градуса, примерно от -60 ° до +60 °), и изображение получается под каждым углом. [5] Эту серию изображений с наклоном затем можно компьютерно реконструировать в трехмерное изображение интересующего объекта. [6] Это называется томограммой или томографической реконструкцией .
Потенциал для in situ с высоким разрешением. получения изображений
[ редактировать ]Одним из наиболее часто упоминаемых преимуществ криоЭТ является способность реконструировать трехмерные объемы отдельных объектов (белков, клеток и т. д. ) вместо необходимости создания нескольких копий образца в кристаллографических методах или в других методах криоЭМ визуализации, таких как анализ одиночных частиц . [7] CryoET считается методом in situ при использовании в невозмущенной клетке или другой системе, поскольку замораживание с погружением фиксирует образец на месте достаточно быстро, чтобы вызвать минимальные изменения в положении атомов. [8]
Соображения
[ редактировать ]Толщина образца
[ редактировать ]В просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), поскольку электроны сильно взаимодействуют с веществом , образцы должны быть очень тонкими, чтобы не вызывать потемнения образцов из-за многократного упругого рассеяния . Поэтому при криоЭТ толщина образцов обычно составляет менее ~500 нм. По этой причине большинство исследований криоЭТ сосредоточено на очищенных макромолекулярных комплексах , вирусах или небольших клетках, таких как клетки многих видов бактерий и архей. [1] Например, криоЭТ использовался для понимания инкапсуляции наночастиц белковой клетки размером 12 нм внутри вирусоподобных наночастиц размером 60 нм. [9]
Более крупные клетки и даже ткани можно подготовить для криоЭТ путем истончения, либо путем криосрезов, либо путем сфокусированным ионным лучом измельчения (FIB). При криодеструкции замороженные блоки клеток или ткани разрезаются на тонкие образцы с помощью криомикротома . [11] При измельчении FIB замороженные образцы подвергаются воздействию сфокусированного луча ионов, обычно галлия , которые точно срезают материал сверху и снизу образца, оставляя тонкую пластинку, подходящую для криоЭТ-визуализации. [12]
Отношение сигнал/шум
[ редактировать ]Для структур, которые присутствуют в нескольких копиях на одной или нескольких томограммах, более высокое разрешение (даже ≤1 нм) можно получить путем усреднения субтомограмм . [13] [14] Подобно анализу одиночных частиц, усреднение субтомограмм вычислительно объединяет изображения идентичных объектов для увеличения отношения сигнал/шум .
Ограничения
[ редактировать ]Радиационное повреждение
[ редактировать ]Известно, что электронная микроскопия приводит к более быстрому разложению биологических образцов по сравнению с образцами в материаловедении и физике из-за радиационного повреждения . [15] В большинстве других методов визуализации биологических образцов, основанных на электронной микроскопии, объединение сигналов от множества различных копий образцов было общим способом решения этой проблемы ( например, кристаллография, анализ одиночных частиц). В криоЭТ вместо множества изображений разных копий образцов делается множество изображений одной области. Следовательно, флюенс (количество электронов, переданных на единицу площади) на образец примерно в 2–5 раз больше, чем при анализе одной частицы. [16] Томография на гораздо более устойчивых материалах обеспечивает значительно более высокое разрешение, чем типичная биологическая визуализация, что позволяет предположить, что радиационное повреждение является самым большим ограничением для криоЭТ биологических образцов. [7] [17]
Разрешение по глубине
[ редактировать ]Сильное взаимодействие электронов с веществом также приводит к эффекту анизотропного разрешения. Поскольку образец наклоняется во время визуализации, электронный луч взаимодействует с более толстым видимым образцом вдоль оптической оси микроскопа под более высокими углами наклона. На практике углы наклона, превышающие примерно 60–70°, не дают много информации и поэтому не используются. Это приводит к «недостающему клину» информации в окончательной томограмме, что снижает разрешение параллельно электронному лучу. [6]
Термин «отсутствующий клин» возник из-за преобразования Фурье томограммы, когда пустой клин очевиден из-за того, что образец не наклонен на 90 °. Отсутствие клина приводит к недостаточному разрешению глубины выборки, поскольку недостающая информация в основном располагается вдоль оси z. Недостающий клин также является проблемой в трехмерной электронной кристаллографии , где ее обычно решают путем слияния нескольких наборов данных, которые перекрывают друг друга, или путем расширения симметрии , где это возможно. [15] Оба этих решения обусловлены природой кристаллографии, поэтому ни одно из них не может быть применено к томографии.
Сегментация
[ редактировать ]Основным препятствием в области криоЭТ является выявление представляющих интерес структур в сложной клеточной среде. Такие решения, как коррелированная криофлуоресцентная световая микроскопия , [19] и световая микроскопия сверхвысокого разрешения (например, крио-PALM [20] ) может быть интегрирован с CryoET. В этих методах образец, содержащий интересующий белок с флуоресцентной меткой, подвергается глубокой заморозке и сначала визуализируется в световом микроскопе, оснащенном специальным столиком, позволяющим хранить образец при температуре субкристаллизации (< -150 ° C). Определяется местоположение флуоресцентного сигнала, и образец переносится в CryoTEM, где то же место затем визуализируется с высоким разрешением с помощью криоЭТ.
См. также
[ редактировать ]- Электронная микроскопия
- Электронная томография
- Просвечивающая электронная криомикроскопия
- Просвечивающая электронная микроскопия
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Перейти обратно: а б Ган, Лу; Дженсен, Грант Дж. (01 февраля 2012 г.). «Электронная томография клеток» (PDF) . Ежеквартальные обзоры биофизики . 45 (1): 27–56. дои : 10.1017/S0033583511000102 . ISSN 1469-8994 . ПМИД 22082691 . S2CID 11458204 .
- ^ Додонова Светлана О; Адерхольд, Патрик; Копп, Юрген; Ганева, Ива; Релинг, Симона; Хаген, Вим Дж. Х.; Грешит, Ирмгард; Виланд, Феликс; Бриггс, Джон А.Г. (16 июня 2017 г.). «Структура 9Å оболочки COPI показывает, что ГТФаза Arf1 занимает два контрастирующих молекулярных окружения» . электронная жизнь . 6 . дои : 10.7554/eLife.26691 . ISSN 2050-084X . ПМЦ 5482573 . ПМИД 28621666 .
- ^ Перейти обратно: а б Дубоше, Дж.; Адриан, М.; Чанг, Джей-Джей; Гомо, Джей Си; Лепо, Ж.; Макдауэлл, AW; Шульц, П. (1 мая 1988 г.). «Криоэлектронная микроскопия остеклованных образцов» (PDF) . Ежеквартальные обзоры биофизики . 21 (2): 129–228. дои : 10.1017/s0033583500004297 . ISSN 0033-5835 . ПМИД 3043536 . S2CID 2741633 .
- ^ Ойконому, CM; Дженсен, Дж.Дж.; Чанг, YW (апрель 2016 г.). «Новый взгляд на биологию прокариотических клеток с помощью электронной криотомографии» . Обзоры природы. Микробиология . 14 (4): 205–20. дои : 10.1038/nrmicro.2016.7 . ПМЦ 5551487 . ПМИД 26923112 .
- ^ Р. Ховден; Д.А. Мюллер (2020). «Электронная томография функциональных наноматериалов». Вестник МРС . 45 (4): 298–304. arXiv : 2006.01652 . Бибкод : 2020MRSBu..45..298H . дои : 10.1557/mrs.2020.87 . S2CID 216522865 .
- ^ Перейти обратно: а б Лучич, Владан; Ригорт, Александр; Баумайстер, Вольфганг (5 августа 2013 г.). «Криоэлектронная томография: задача структурной биологии in situ» . Журнал клеточной биологии . 202 (3): 407–419. дои : 10.1083/jcb.201304193 . ISSN 1540-8140 . ПМЦ 3734081 . ПМИД 23918936 .
- ^ Перейти обратно: а б Бауэрляйн, Феликс Дж.Б.; Баумайстер, Вольфганг (01 октября 2021 г.). «На пути к визуальной протеомике в высоком разрешении» . Журнал молекулярной биологии . От последовательности белка к структуре на сверхскорости: как альфафолд влияет на биологию. 433 (20): 167187. doi : 10.1016/j.jmb.2021.167187 . ISSN 0022-2836 .
- ^ Адриан, Марк; Дюбоше, Жак; Лепо, Жан; Макдауэлл, Аласдер В. (март 1984 г.). «Криоэлектронная микроскопия вирусов» . Природа . 308 (5954): 32–36. дои : 10.1038/308032a0 . ISSN 1476-4687 .
- ^ Вагвани Х.К., Учида М., Дуглас Т. (апрель 2020 г.). «Вирусоподобные частицы (ВЛП) как платформа для иерархической компартментализации» . Биомакромолекулы . 21 (6): 2060–2072. doi : 10.1021/acs.biomac.0c00030 . ПМИД 32319761 .
- ^ Тамборрини, Давиде; Ван, Чжексинь; Вагнер, Торстен; Таке, Себастьян; Стабрин, Маркус; Грейндж, Майкл; Хо, Ай Лин; Рис, Мартин; Беннетт, Полина; Готель, Матиас; Раунсер, Стефан (23 декабря 2023 г.), «Структура нативной миозиновой нити в расслабленном сердечном саркомере». , Природа , doi : 10.1038/s41586-023-06690-5 , PMC 10665186
- ^ Аль-Амуди, Ашраф; Чанг, Джин-Джу; Лефорестье, Амели; Макдауэлл, Аласдер; Саламин, Лорел Мишель; Норлен, Ларс П.О.; Рихтер, Карстен; Уайт, Натали Сартори; Студер, Дэниел (15 сентября 2004 г.). «Криоэлектронная микроскопия срезов стекловидного тела» . Журнал ЭМБО . 23 (18): 3583–3588. дои : 10.1038/sj.emboj.7600366 . ISSN 0261-4189 . ПМК 517607 . ПМИД 15318169 .
- ^ Вилла, Элизабет ; Шаффер, Мирослава; Плицко, Юрген М.; Баумайстер, Вольфганг (01 октября 2013 г.). «Открытие окон в ячейку: фрезерование сфокусированным ионным лучом для криоэлектронной томографии». Современное мнение в области структурной биологии . 23 (5): 771–777. дои : 10.1016/j.sbi.2013.08.006 . ISSN 1879-033X . ПМИД 24090931 .
- ^ Бриггс, Джон А.Г. (1 апреля 2013 г.). «Структурная биология in situ - возможности усреднения субтомограмм». Современное мнение в области структурной биологии . 23 (2): 261–267. дои : 10.1016/j.sbi.2013.02.003 . ISSN 1879-033X . ПМИД 23466038 .
- ^ Шур, Флориан К.М.; Дик, Роберт А.; Хаген, Вим Дж. Х.; Фогт, Волкер М.; Бриггс, Джон А.Г. (15 октября 2015 г.). «Структура незрелых вирусоподобных кляп-частиц вируса саркомы Рауса раскрывает структурную роль домена p10 в сборке» . Журнал вирусологии . 89 (20): 10294–10302. дои : 10.1128/JVI.01502-15 . ISSN 1098-5514 . ПМК 4580193 . ПМИД 26223638 .
- ^ Перейти обратно: а б Саха, Амбарнейл; Ниа, Шервин С.; Родригес, Хосе А. (14 сентября 2022 г.). «Электронная дифракция 3D-молекулярных кристаллов» . Химические обзоры . 122 (17): 13883–13914. doi : 10.1021/acs.chemrev.1c00879 . ISSN 0009-2665 . ПМК 9479085 . ПМИД 35970513 .
- ^ Шмид, Майкл Ф. (01 января 2011 г.), Лудтке, Стивен Дж.; Венкатарам Прасад, Б.В. (ред.), «Глава 2 - Одночастичная электронная криотомография (криоЭТ)» , «Достижения в области химии белков и структурной биологии », «Последние достижения в электронной криомикроскопии», часть B, том. 82, Academic Press, стр. 37–65, номер документа : 10.1016/b978-0-12-386507-6.00002-6 , получено 7 января 2024 г.
- ^ Скотт, MC; Чен, Цзянь Чун; Мекленбург, Мэтью; Чжу, Чунь; Сюй, Руй; Эрциус, Питер; Дамен, Ульрих; Риган, Британская Колумбия; Мяо, Цзяньвэй (март 2012 г.). «Электронная томография с разрешением 2,4 ангстрема» . Природа . 483 (7390): 444-447. дои : 10.1038/nature10934 . ISSN 1476-4687 .
- ^ Хаген, Вим Дж. Х.; Ван, Уильям; Бриггс, Джон А.Г. (01 февраля 2017 г.). «Реализация наклон-схемы криоэлектронной томографии, оптимизированной для усреднения субтомограмм высокого разрешения» . Журнал структурной биологии . Электронная томография. 197 (2): 191–198. дои : 10.1016/j.jsb.2016.06.007 . ISSN 1047-8477 . ПМК 5287356 . ПМИД 27313000 .
- ^ Чжан, Пейджун (01 октября 2013 г.). «Корреляционная криоэлектронная томография и оптическая микроскопия клеток» . Современное мнение в области структурной биологии . 23 (5): 763–770. дои : 10.1016/j.sbi.2013.07.017 . ISSN 1879-033X . ПМЦ 3812453 . ПМИД 23962486 .
- ^ Чанг, И-Вэй; Чен, Сонге; Точева, Элица И.; Тройнер-Ланге, Анке; Лёбах, Стефани; Сёгаард-Андерсен, Лотте; Дженсен, Грант Дж. (01 июля 2014 г.). «Коррелированная криогенная фотоактивированная локализационная микроскопия и криоэлектронная томография» . Природные методы . 11 (7): 737–739. дои : 10.1038/nmeth.2961 . ISSN 1548-7105 . ПМК 4081473 . ПМИД 24813625 .
Внешние ссылки
[ редактировать ]| Основы | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Электронное взаимодействие с материей | |||||||
| Инструментарий | |||||||
| Микроскопы |
| ||||||
| Техники |
| ||||||
| Другие |
| ||||||
