Деамидирование
Деамидирование — это химическая реакция, в которой или глутамина удаляется или преобразуется в амидная функциональная группа в боковой цепи аминокислот аспарагина другую функциональную группу. Обычно аспарагин превращают в аспарагиновую кислоту или изоаспарагиновую кислоту . Глутамин превращается в глутаминовую кислоту или пироглутаминовую кислоту (5-оксопролин). В белке или пептиде эти реакции важны, поскольку они могут изменить его структуру, стабильность или функцию и могут привести к деградации белка. Чистое химическое изменение представляет собой добавление группы воды и удаление группы аммиака, что соответствует увеличению массы на +1 (0,98402) Да. Хотя дезамидирование происходит с глютамином, гликозилированным аспарагином и другими амидами, оно незначительно в типичных условиях протеолиза. [1]
При дезамидировании остатка аспарагина в физиологических условиях боковая цепь подвергается атаке атома азота следующей пептидной группы (черный цвет в правом верхнем углу рисунка), образуя асимметричный промежуточный сукцинимид (красный цвет). Асимметрия промежуточного продукта приводит к образованию двух продуктов его гидролиза: аспарагиновой кислоты (черный цвет слева) или изоаспарагиновой кислоты, которая представляет собой бета-аминокислоту (зеленый цвет внизу справа). Однако существует опасение, что аспарагиновая кислота может изомеризоваться после дезамидирования. [2] с шестичленным кольцом Дезамидирование остатка глутамина может происходить по тому же механизму, но с гораздо более медленной скоростью, поскольку образование промежуточного глутаримида менее предпочтительно, чем промежуточного сукцинимида для аспарагина. В общем, дезамидирование можно устранить путем протеолиза при кислом pH или при слабоосновном pH (4,5 и 8,0 соответственно) с использованием эндопротеазы Glu-C. [2]
Скорость дезамидирования зависит от множества факторов, включая первичные последовательности и структуры белков более высокого порядка, pH, температуру и компоненты растворов. Большинство потенциальных центров дезамидирования стабилизированы структурой более высокого порядка. Asn-Gly (NG) является наиболее гибким и, поскольку он кислый, он наиболее склонен к дезамидированию с периодом полураспада около 24 часов в физиологических условиях (pH 7,4, 37 °C). [3]
В виде свободной аминокислоты или N-концевого остатка пептида или белка глютамин легко деамидируется с образованием пироглутаминовой кислоты (5-оксопролина). Реакция протекает через нуклеофильную атаку α-аминогруппы на амид боковой цепи с образованием γ-лактама с удалением аммиака из боковой цепи.
Аналитический метод
[ редактировать ]Дезаминирование белков обычно анализируют с помощью обращенно-фазовой жидкостной хроматографии (RPLC) посредством пептидного картирования. Недавно опубликованный новый метод ERLIC-MS/MS позволит улучшить разделение дезамидированных и недезамидированных пептидов с улучшенной идентификацией и количественным определением. [4]
Масс-спектрометрия обычно используется для характеристики состояний дезамидирования белков, включая терапевтические моноклональные антитела. [5] Этот метод особенно полезен для анализа дезамидирования из-за его высокой чувствительности, скорости и специфичности. Это позволяет проводить анализ дезамидирования на конкретном участке. [6]
Основной проблемой использования масс-спектрометрии является образование артефактов дезамидирования во время подготовки проб. Эти артефакты существенно искажают результаты, поскольку предполагают более высокие темпы спонтанного дезамидирования, чем наблюдаемые на самом деле. Это может оказаться проблематичным в случае терапевтических белков, которые могут быть неправильно охарактеризованы в протоколах контроля качества, если большой процент обнаруженного дезамидирования обусловлен артефактами. Недавние исследования показывают, что более низкий уровень pH может снизить частоту появления артефактов дезамидирования. [2]
Кинетика дезамидирования
[ редактировать ]Предполагается, что реакции дезамидирования являются одним из факторов, ограничивающих полезное время жизни белков. [1]
Деамидирование протекает гораздо быстрее, если за восприимчивой аминокислотой следует небольшой гибкий остаток, такой как глицин , низкие стерические препятствия которого оставляют пептидную группу открытой для атаки. Реакции дезамидирования также протекают гораздо быстрее при повышенном pH (>10) и температуре .
Эндопротеаза Glu-C проявляла специфичность только к глутаминовой кислоте в определенных условиях pH (4,5 и 8,0) и расщепляла С-концевую сторону в растворе с трис-HCl, бикарбонатом или ацетатом.
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б Кларк, С. (2003). «Старение как война между химическими и биохимическими процессами: метилирование белков и распознавание поврежденных возрастом белков для восстановления». Старение Res Rev. 2 (3): 263–285. дои : 10.1016/S1568-1637(03)00011-4 . ПМИД 12726775 . S2CID 18135051 .
- ^ Jump up to: а б с Лю, Шаньшань; Моултон, Кевин Райан; Оклер, Джаред Роберт; Чжоу, Чжаохуэй Санни (01 апреля 2016 г.). «Слегка кислые условия устраняют артефакт дезамидирования во время протеолиза: расщепление эндопротеазой Glu-C при pH 4,5» . Аминокислоты . 48 (4): 1059–1067. дои : 10.1007/s00726-015-2166-z . ISSN 1438-2199 . ПМЦ 4795971 . ПМИД 26748652 .
- ^ Тайлер-Кросс Р., Ширч В. (1991) Эффекты аминокислотной последовательности,буферов и ионной силы на скорость и механизм дезамидирования остатков аспарагина в малых пептидах. Джей Биол Хим266: 22549–22556
- ^ Чжэнь, Цзин (2018). «Характеристика антител с использованием нового пептидного картирования на основе ERLIC-MS/MS» . МАБ . 10 (7): 1–9. дои : 10.1080/19420862.2018.1505179 . ПМК 6204790 . ПМИД 30130443 .
- ^ Ван, Вэйцзе; Милер, Андреа Р.; Бергеруд, Люк Т.; Хессельберг, Марк; Бирн, Майкл; Ву, Чжучунь (2012). «Количественная оценка и характеристика дезамидирования антител путем пептидного картирования с помощью масс-спектрометрии». Международный журнал масс-спектрометрии . 312 : 107–113. Бибкод : 2012IJMSp.312..107W . дои : 10.1016/j.ijms.2011.06.006 .
- ^ Хао, Пилианг; Адав, Сунил С.; Галларт-Палау, Ксавье; Сзе, Сиу Кван (ноябрь 2017 г.). «Последние достижения в масс-спектрометрическом анализе дезамидирования белков». Обзоры масс-спектрометрии . 36 (6): 677–692. Бибкод : 2017MSRv...36..677H . дои : 10.1002/mas.21491 . ISSN 1098-2787 . ПМИД 26763661 .
- Кларк, С. (1987). «Склонность к спонтанному образованию сукцинимида из остатков аспартила и аспарагина в клеточных белках». Международный журнал исследований пептидов и белков . 30 (6): 808–821. дои : 10.1111/j.1399-3011.1987.tb03390.x . ПМИД 3440704 .
- Стивенсон, Р.К.; Кларк, С. (1989). «Образование сукцинимида из аспартиловых и аспарагиниловых пептидов как модель спонтанной деградации белков» . Журнал биологической химии . 264 (11): 6164–6170. дои : 10.1016/S0021-9258(18)83327-0 . ПМИД 2703484 .
- Робинсон Н.Е., Робинсон А.Б. (2004)Молекулярные часы: дезамидирование аспарагинильных и глутаминильных остатков в пептидах и белках. Althouse Press: Cave Junction, Ore. ОСЛК 56978028