Фотосинтетический пикопланктон

Фотосинтетический пикопланктон или пикофитопланктон представляет собой часть фотосинтетического фитопланктона с размерами клеток от 0,2 до 2 мкм (т.е. пикопланктон ). Это особенно важно в центральных олиготрофных районах Мирового океана, имеющих очень низкую концентрацию питательных веществ .

История

описал первый по-настоящему пикопланктонный вид, Chromulina pusilla . 1952: Бутчер ^{[ 1 ]} Этот вид был переименован в 1960 году в Micromonas pusilla. ^{[ 2 ]} и несколько исследований показали, что он широко распространен в океанических водах умеренного пояса, хотя таких количественных данных для эукариотического пикофитопланктона существует очень мало.
морского синехококка . 1979: Открытие Уотербери ^{[ 3 ]} и подтверждение с помощью электронной микроскопии Джонсона и Зибурта. ^{[ 4 ]}
1982: Те же Джонсон и Зибурт демонстрируют важность мелких эукариот с помощью электронной микроскопии. ^{[ 5 ]}
1983: WKW Li и его коллеги, включая Тревора Платта, показали, что большая часть первичной продукции морской среды приходится на организмы размером менее 2 мкм. ^{[ 6 ]}
1986: Открытие «прохлорофитов» Чисхолмом и Олсоном в Саргассовом море. ^{[ 7 ]} назван в 1992 году как Prochromococcus marinus . ^{[ 8 ]}
в лагуне Тау во Франции самого маленького из известных на сегодняшний день фотосинтезирующих эукариот, Ostreococcus tauri . 1994: Открытие Кортисом ^{[ 9 ]}
2001: Путем секвенирования гена рибосомальной РНК, извлеченного из морских образцов, несколько европейских команд обнаружили, что эукариотический пикопланктон весьма разнообразен . ^{[ 10 ]}^{[ 11 ]} Это открытие последовало за первым открытием такого эукариотического разнообразия в 1998 году Раппе и его коллегами из Университета штата Орегон, которые первыми применили секвенирование рРНК к эукариотическому планктону в открытом океане, где они обнаружили последовательности, которые казались далекими от известного фитопланктона. ^{[ 12 ]} Клетки, содержащие ДНК, соответствующую одной из этих новых последовательностей, недавно были визуализированы и дополнительно проанализированы с использованием специфических зондов и оказались широко распространенными. ^{[ 13 ]}

Методы исследования

Из-за очень маленького размера пикопланктон трудно изучать классическими методами, такими как оптическая микроскопия. Нужны более сложные методы.

Эпифлуоресцентная микроскопия позволяет исследователям обнаруживать определенные группы клеток, обладающих флуоресцентными пигментами, такими как Synechococcus , которые содержат фикоэритрин .
Проточная цитометрия измеряет размер («прямое рассеяние») и флуоресценцию 1000 на 10 000 клеток в секунду. Это позволяет очень легко определять концентрацию различных популяций пикопланктона в морских пробах. три группы клеток ( прохлорококки , синехококки Можно выделить и пикоэукариоты). Например, для Synechococcus характерна двойная флуоресценция пигментов: оранжевая для фикоэритрина и красная для хлорофилла . Проточная цитометрия также позволяет исследователям отсортировать определенные популяции (например, Synechococcus ), чтобы поместить их в культуру или провести более детальный анализ.
Анализ фотосинтетических пигментов, таких как хлорофилл или каротиноиды, с помощью высокоточной хроматографии ( ВЭЖХ ) позволяет исследователям определять различные группы водорослей, присутствующих в образце.
Методы молекулярной биологии :

Клонирование и секвенирование генов , таких как гены рибосомальной РНК , что позволяет исследователям определять общее разнообразие в образце.
DGGE (денатурирующий гель-электрофорез), который работает быстрее, чем предыдущий подход, позволяет исследователям получить представление о глобальном разнообразии в образце.
В гибридизации in situ ( FISH ) используются флуоресцентные зонды, распознающие конкретный таксон , например, вид , род или класс . ^{[ 14 ]} Сейчас считается, что это первоначальное описание вида состоит из ряда различных загадочных видов , и это открытие было подтверждено проектом секвенирования генома двух штаммов, проведенным исследователями из Научно-исследовательского института аквариумов Монтерей-Бей . ^{[ 15 ]}
Количественный ПЦР можно использовать, как и FISH, для определения численности определенных групп. Его основное преимущество заключается в возможности быстрого анализа большого количества образцов одновременно. ^{[ 16 ]} но требует более сложного контроля и калибровки.

Состав

Три основные группы организмов составляют фотосинтетический пикопланктон:

Цианобактерии, принадлежащие к роду Synechococcus размером 1 мкм (микрометр), впервые были открыты в 1979 г. Дж. Уотербери. ^{[ 3 ]} ( Океанографический институт Вудс-Хоул ). Они довольно повсеместны, но наиболее многочисленны в относительно мезотрофных водах .
цианобактерии, принадлежащие к роду Prochromococcus Особенно примечательны . При типичном размере 0,6 мкм прохлорококк был открыт только в 1988 г. ^{[ 7 ]} двумя американскими исследователями, Салли В. (Пенни) Чисхолм ( Массачусетский технологический институт ) и Р. Дж. Олсоном (Океанографический институт Вудс-Хоул). Несмотря на свои небольшие размеры, этот фотосинтезирующий организм, несомненно, является самым многочисленным на планете: действительно, его плотность может достигать 100 миллионов клеток на литр, и он встречается на глубине до 150 м во всем межтропическом поясе. ^{[ 17 ]}
Пикопланктонные эукариоты наименее известны, о чем свидетельствует недавнее открытие основных групп. Андерсен создал в 1993 году новый класс бурых водорослей — Pelagophyceae . ^{[ 18 ]} Еще более удивительным является открытие, сделанное в 1994 г. ^{[ 9 ]} эукариота очень маленького размера, Ostreococcus tauri , доминирующего в фитопланктонной биомассе французской солоноватой лагуны (étang de Thau ), показывает, что эти организмы также могут играть важную экологическую роль в прибрежной среде. В 1999 году был открыт новый класс водорослей. ^{[ 19 ]} Bolidophyceae , но , очень близкие генетически к диатомовым водорослям совершенно разные морфологически. В настоящее время известно около 50 видов, относящихся к нескольким классам.

**Классы водорослей, содержащие виды пикопланктона**
Классы	Пикопланктонные роды
хлорофицеи	Наннохлорис
Празинофицеи	Микромонас , Остреококк , Пикнококк
Примнезиофицеи	Имантония
Пелагофиевые	Пелагомонас
Болидофицеи	Болидомон
Диктиохофицеи	Флоренсиелла

Использование молекулярных подходов, реализованных с 1990-х годов для бактерий, было применено к фотосинтезирующим пикоэукариотам только 10 лет спустя, примерно в 2000 году. Они выявили очень широкое разнообразие. ^{[ 10 ]}^{[ 11 ]} и выявил важность следующих групп в пикопланктоне:

род Micromonas (Prasinophyceae). В прибрежных зонах умеренного пояса доминирует ^{[ 14 ]} Однако во многих океанических средах доминирующие виды эукариотического пикопланктона остаются неизвестными. ^{[ 20 ]}

Экология

Каждая пикопланктонная популяция занимает определенную экологическую нишу в океанической среде.

Цианобактерия Synechococcus обычно широко распространена в мезотрофных средах, например, вблизи экваториального апвеллинга или в прибрежных регионах.
Цианобактерия Prochromococcus заменяет его, когда воды обедняются питательными веществами (т. е. становятся олиготрофными ). С другой стороны, в регионах с умеренным климатом, таких как северная часть Атлантического океана, прохлорококк отсутствует, поскольку холодные воды препятствуют его развитию.
Разнообразие эукариот обусловлено их присутствием в самых разных средах. В океанических районах их часто наблюдают на глубине, у основания хорошо освещенного слоя («эуфотического» слоя). определенные виды пикоэукариот, например Micromonas В прибрежных регионах доминируют . Как и в случае с более крупным планктоном, их численность подчиняется сезонному циклу с максимумом летом.

Тридцать лет назад была выдвинута гипотеза, что скорость деления микроорганизмов в экосистемах центрального океана очень медленная, порядка одной недели или одного месяца на поколение. Эта гипотеза подтверждалась тем фактом, что биомасса (оцененная, например, по содержанию хлорофилла ) была очень стабильной во времени. Однако с открытием пикопланктона было обнаружено, что система гораздо более динамична, чем считалось ранее. В частности, было обнаружено повсеместное распространение мелких хищников размером в несколько микрометров, которые поедают пикопланктонные водоросли сразу же после их появления. Эта чрезвычайно сложная система хищник-жертва почти всегда находится в равновесии и приводит к квазипостоянной биомассе пикопланктона. Эта тесная эквивалентность между производством и потреблением чрезвычайно затрудняет точное измерение скорости, с которой происходит переворот системы.

В 1988 году два американских исследователя, Карпентер и Чанг, предложили оценивать скорость деления клеток фитопланктона, прослеживая ход репликации ДНК с помощью микроскопии. Заменив микроскоп проточным цитометром , можно следить за содержанием ДНК в клетках пикопланктона с течением времени. Это позволило исследователям установить, что клетки пикопланктона очень синхронны: они реплицируют свою ДНК, а затем делятся одновременно в конце дня. Эта синхронизация могла быть обусловлена наличием внутренних биологических часов .

Геномика

В 2000-е годы геномика позволила перейти на дополнительный этап. Геномика заключается в определении полной последовательности генома организма и составлении списка каждого присутствующего гена . Тогда можно получить представление о метаболических способностях целевых организмов и понять, как они адаптируются к окружающей среде. На сегодняшний день геномы нескольких видов прохлорококка ^{[ 21 ]}^{[ 22 ]} и синехококк , ^{[ 23 ]} и штамма остреококка ^{[ 24 ]} были определены. Полные геномы двух разных штаммов Micromonas показали, что они совершенно разные (разные виды) и имеют сходство с наземными растениями. ^{[ 15 ]} Несколько других цианобактерий и мелких эукариот ( Bathycoccus , Pelagomonas ) находятся в стадии секвенирования. Параллельно анализы генома начинают проводиться непосредственно из образцов океана (экогеномика или метагеномика), ^{[ 25 ]} позволяя нам получить доступ к большим наборам генов некультивируемых организмов.

Геномы фотосинтезирующих штаммов пикопланктона
которые были секвенированы на сегодняшний день
Род	Напряжение	Центр секвенирования	Примечание
Прохлорококк	МЕД4	JGI
	СС120	Геноскоп
	МИТ9312	JGI
	МИТ9313	JGI
	НАТЛ2А	JGI
	СС9605	JGI
	СС9901	JGI
Синехококк	WH8102	JGI
	WH7803	Геноскоп
	РСС307	Геноскоп
	СС9311	TIGR	^{[ 26 ]}
Остреококк	ОТТХ95	Геноскоп
Микромонас	RCC299 и CCMP1545	JGI	^{[ 15 ]}

См. также

Примечания и ссылки

^ Мясник, Р. (1952). Вклад в наши знания о мелких морских водорослях. Журнал Морской биологической ассоциации Великобритании 31 : 175-91.
^ Мэнтон, И. и Парк, М. (1960). Дальнейшие наблюдения за маленькими зелеными жгутиконосцами с особым упором на возможных родственников Chromulina pusilla Butcher. Журнал Морской биологической ассоциации Великобритании 39 : 275-98.
^ Jump up to: ^а ^б Уотербери, Дж. Б. и др. (1979). Широкое распространение одноклеточной морской планктонной цианобактерии. Природа 277 : 293-4.
^ Джонсон, П.В. и Зибурт, Дж.М. (1979). Хроококкоидные цианобактерии в море: повсеместная и разнообразная фототрофная биомасса. Лимнология и океанография 24 : 928-35.
^ Джонсон, П.В. и Зибурт, Дж.М. (1982). In-situ морфология и встречаемость эукариотических фототрофов бактериального размера в пикопланктоне эстуарных и океанических вод. Журнал Phycology 18 : 318-27.
^ Ли, WKW и др. (1983). Автотрофный пикопланктон тропического океана. Наука 219 : 292-5.
^ Jump up to: ^а ^б Чисхолм, SW и др. (1988). Новый свободноживущий прохлорофит встречается при высоких концентрациях клеток в эвфотической зоне океана. Природа 334 : 340-3.
^ Чисхолм, SW и др. (1992). Прохлорококк Маринус ноябрь. ген. ноябрь sp.: оксифототрофный морской прокариот, содержащий дивинилхлорофилл a и b . Архив микробиологии 157 : 297-300.
^ Jump up to: ^а ^б Куртис, К. и др. (1994). Самый маленький эукариотический организм. Природа 370 : 255.
^ Jump up to: ^а ^б Лопес-Гарсия, П. и др. (2001). Неожиданное разнообразие мелких эукариот в глубоководном антарктическом планктоне. Природа 409 : 603-7.
^ Jump up to: ^а ^б Мун-ван дер Стаай, С.Ю. и др. (2001). Последовательности океанической 18S рДНК пикопланктона обнаруживают неожиданное эукариотическое разнообразие. Природа 409 : 607-10.
^ Раппе, М. и др. (1998). Филогенетическое разнообразие генов рРНК малых субъединиц пластид ультрапланктона, обнаруженных в образцах нуклеиновых кислот окружающей среды с тихоокеанского и атлантического побережий США. Прикладная и экологическая микробиология 64 294-303.
^ Ким, Э., Харрисон, Дж., Судек, С. и др. (2011). Недавно выявленная и разнообразная ветвь, несущая пластиды, на эукариотическом древе жизни. Труды Национальной академии наук США. Том. 108: 1496-1500.
^ Jump up to: ^а ^б Нет, Ф. и др. (2004). Единственный вид Micromonas pusilla (Prasinophyceae) доминирует в эукариотическом пикопланктоне западной части Ла-Манша. Прикладная и экологическая микробиология 70 : 4064-72.
^ Jump up to: ^а ^б ^с Уорден, АЗ и др. (2009). Зеленая эволюция и динамические адаптации, выявленные по геномам морских пикоэукариот Micromonas . Наука 324 : 268–272.
^ Джонсон, З.И. и др. (2006). Распределение ниш между экотипами Prochromococcus по градиентам окружающей среды в масштабе океана. Наука 311 : 1737–40.
^ Партенский, Ф. и др. (1999). Прохлорококк — морской фотосинтезирующий прокариот мирового значения. Обзоры микробиологии и молекулярной биологии 63 : 106-27.
^ Андерсен, Р.А. и др. (1993). Ультраструктура и последовательность гена 18S рРНК Pelagomonas Calceolata gen. и сп. ноябрь и описание нового класса водорослей Pelagophyceae classis nov. Журнал Phycology 29 : 701–15.
^ Гийу, Л. и др. (1999). Bolidomonas : новый род с двумя видами, принадлежащими к новому классу водорослей Bolidophyceae (Heterokonta). Журнал Phycology 35 : 368-81.
^ Уорден, АЗ и Нот, Ф. (2008) Экология и разнообразие пикоукариот. Глава книги: Микробная экология океана, 2-е издание. Эд. Д. Кирхман. Уайли.
^ Рокап, Г. и др. (2003). Дивергенция генома двух экотипов Prochromococcus отражает дифференциацию океанических ниш. Природа 424 : 1042-7.
^ Дюфрен, А. и др. (2003). Последовательность генома цианобактерии Prochromococcus marinus SS120, почти минимального оксифототрофного генома. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки 100 : 10020-5.
^ Паленик, Б. и др. (2003). Геном подвижного морского синехококка . Природа 424 : 1037-42.
^ Дерелл, Э. и др. (2006). Анализ генома самого маленького свободноживущего эукариота Ostreococcus tauri выявил множество уникальных особенностей. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки 103 : 11647-52.
^ Вентер, JC и др. (2004). Секвенирование экологического генома Саргассова моря. Наука 304 : 66–74.
^ Паленик, Б. и др. (2006). Последовательность генома Synechococcus CC9311: понимание адаптации к прибрежной среде. ПНАС 103 : 13555-9.

Библиография

Цианобактерии

Зер, Дж.П., Уотербери, Дж.Б., Тернер, П.Дж., Монтойя, Дж.П., Омореги, Э., Стюард, Г.Ф., Хансен, А. и Карл, Д.М. 2001. Одноклеточные цианобактерии фиксируют N2 в субтропической северной части Тихого океана. Природа 412:635-8

Эукариоты

Батчер, Р. 1952. Вклад в наши знания о мелких морских водорослях. Ж. Мар. Биол. доц. Великобритания. 31:175-91.
Мэнтон И. и Парк М. 1960. Дальнейшие наблюдения за маленькими зелеными жгутиконосцами с особым упором на возможных родственников Chromulina pusilla Butcher. Ж. Мар. Биол. доц. Великобритания. 39:275-98.
Эйкрем В., Трондсен Дж. 1990. Ультраструктура Bathycoccus gen. ноябрь и B. prasinos sp. nov., неподвижная пикопланктонная водоросль (Chlorophyta, Prasinophyceae) из Средиземноморья и Атлантики. Психология 29:344-350
Кретьенно-Дине, М.Дж., Куртис, К., Вакер, А., Неве, Ж., Клаустр, Х. и др. 1995. Новый морской пикоукариот: Ostreococcus tauri gen et sp nov (Chlorophyta, Prasinophyceae). Психология 34:285-292.
Зибурт, Дж. М., М. Д. Келлер, П. В. Джонсон и С. М. Миклестад. 1999. Широкое распространение океанического ультрапланктера Prasinococcus capsulatus (Prasinophyceae), диагностического «комплекса Гольджи-декапор» и недавно описанного полисахарида «капсулан». Дж. Фикол. 35: 1032-1043.
Нот, Ф., Валентин, К., Ромари, К., Лавджой, К., Массана, Р., Тёбе, К., Воло, Д. и Медлин, Л.К. 2007. Пикобилифиты, новая морская группа пикопланктонных водорослей с неизвестными родство с другими эукариотами. Наука 315:252-4.
Ваулот Д., Эйкрем В., Випрей М. и Моро Х. 2008. Разнообразие мелкого эукариотического фитопланктона (≤3 мкм) в морских экосистемах. ФЭМС Микробиол. Откровение 32:795-820.

Экология

Платт Т., Субба-Рао Д.В. и Ирвин Б. 1983. Фотосинтез пикопланктона в олиготрофном океане. Природа 300:701-4.
Стомп М, Хейсман Дж, де Йонг Ф, Вераарт А.Дж., Герла Д., Райкебур М., Ибелингс Б.В., Волленцин МАУ, Сталь Л.Дж. 2004. Адаптивная дивергенция пигментного состава способствует биоразнообразию фитопланктона. Природа 432: 104-107.
Л., Нолла Х.А. и Воло Д. 1994 Кэмпбелл . Лимнол. Океаногр. 39:954-61.

Молекулярная биология и геномы

Раппе, М.С., П.Ф. Кемп и С.Дж. Джованнони. 1995. Гены 16S рибосомальной РНК хромофитных пластид, обнаруженные в библиотеке клонов из морской воды Атлантического океана. Дж. Фикол. 31: 979-988.

[Butcher-1] Мясник, Р. (1952). Вклад в наши знания о мелких морских водорослях. Журнал Морской биологической ассоциации Великобритании 31 : 175-91.

[Manton-2] Мэнтон, И. и Парк, М. (1960). Дальнейшие наблюдения за маленькими зелеными жгутиконосцами с особым упором на возможных родственников Chromulina pusilla Butcher. Журнал Морской биологической ассоциации Великобритании 39 : 275-98.

[Waterbury_79-3] Jump up to: ^а ^б Уотербери, Дж. Б. и др. (1979). Широкое распространение одноклеточной морской планктонной цианобактерии. Природа 277 : 293-4.

[Johnson_79-4] Джонсон, П.В. и Зибурт, Дж.М. (1979). Хроококкоидные цианобактерии в море: повсеместная и разнообразная фототрофная биомасса. Лимнология и океанография 24 : 928-35.

[Johnson_82-5] Джонсон, П.В. и Зибурт, Дж.М. (1982). In-situ морфология и встречаемость эукариотических фототрофов бактериального размера в пикопланктоне эстуарных и океанических вод. Журнал Phycology 18 : 318-27.

[Li_83-6] Ли, WKW и др. (1983). Автотрофный пикопланктон тропического океана. Наука 219 : 292-5.

[Chisholm_88-7] Jump up to: ^а ^б Чисхолм, SW и др. (1988). Новый свободноживущий прохлорофит встречается при высоких концентрациях клеток в эвфотической зоне океана. Природа 334 : 340-3.

[Chisholm_92-8] Чисхолм, SW и др. (1992). Прохлорококк Маринус ноябрь. ген. ноябрь sp.: оксифототрофный морской прокариот, содержащий дивинилхлорофилл a и b . Архив микробиологии 157 : 297-300.

[Courties_95-9] Jump up to: ^а ^б Куртис, К. и др. (1994). Самый маленький эукариотический организм. Природа 370 : 255.

[Lopez_01-10] Jump up to: ^а ^б Лопес-Гарсия, П. и др. (2001). Неожиданное разнообразие мелких эукариот в глубоководном антарктическом планктоне. Природа 409 : 603-7.

[Moon_01-11] Jump up to: ^а ^б Мун-ван дер Стаай, С.Ю. и др. (2001). Последовательности океанической 18S рДНК пикопланктона обнаруживают неожиданное эукариотическое разнообразие. Природа 409 : 607-10.

[Rappe_98-12] Раппе, М. и др. (1998). Филогенетическое разнообразие генов рРНК малых субъединиц пластид ультрапланктона, обнаруженных в образцах нуклеиновых кислот окружающей среды с тихоокеанского и атлантического побережий США. Прикладная и экологическая микробиология 64 294-303.

[Kim_2011-13] Ким, Э., Харрисон, Дж., Судек, С. и др. (2011). Недавно выявленная и разнообразная ветвь, несущая пластиды, на эукариотическом древе жизни. Труды Национальной академии наук США. Том. 108: 1496-1500.

[Not_04-14] Jump up to: ^а ^б Нет, Ф. и др. (2004). Единственный вид Micromonas pusilla (Prasinophyceae) доминирует в эукариотическом пикопланктоне западной части Ла-Манша. Прикладная и экологическая микробиология 70 : 4064-72.

[Worden_2009-15] Jump up to: ^а ^б ^с Уорден, АЗ и др. (2009). Зеленая эволюция и динамические адаптации, выявленные по геномам морских пикоэукариот Micromonas . Наука 324 : 268–272.

[Johnson_06-16] Джонсон, З.И. и др. (2006). Распределение ниш между экотипами Prochromococcus по градиентам окружающей среды в масштабе океана. Наука 311 : 1737–40.

[Partensky_99-17] Партенский, Ф. и др. (1999). Прохлорококк — морской фотосинтезирующий прокариот мирового значения. Обзоры микробиологии и молекулярной биологии 63 : 106-27.

[Andersen_93-18] Андерсен, Р.А. и др. (1993). Ультраструктура и последовательность гена 18S рРНК Pelagomonas Calceolata gen. и сп. ноябрь и описание нового класса водорослей Pelagophyceae classis nov. Журнал Phycology 29 : 701–15.

[Guillou_99a-19] Гийу, Л. и др. (1999). Bolidomonas : новый род с двумя видами, принадлежащими к новому классу водорослей Bolidophyceae (Heterokonta). Журнал Phycology 35 : 368-81.

[Worden_2008-20] Уорден, АЗ и Нот, Ф. (2008) Экология и разнообразие пикоукариот. Глава книги: Микробная экология океана, 2-е издание. Эд. Д. Кирхман. Уайли.

[Rocap_03-21] Рокап, Г. и др. (2003). Дивергенция генома двух экотипов Prochromococcus отражает дифференциацию океанических ниш. Природа 424 : 1042-7.

[Dufresne_03-22] Дюфрен, А. и др. (2003). Последовательность генома цианобактерии Prochromococcus marinus SS120, почти минимального оксифототрофного генома. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки 100 : 10020-5.

[Palenik_03-23] Паленик, Б. и др. (2003). Геном подвижного морского синехококка . Природа 424 : 1037-42.

[Derelle_06-24] Дерелл, Э. и др. (2006). Анализ генома самого маленького свободноживущего эукариота Ostreococcus tauri выявил множество уникальных особенностей. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки 103 : 11647-52.

[Venter_04-25] Вентер, JC и др. (2004). Секвенирование экологического генома Саргассова моря. Наука 304 : 66–74.

[26] Паленик, Б. и др. (2006). Последовательность генома Synechococcus CC9311: понимание адаптации к прибрежной среде. ПНАС 103 : 13555-9.

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]

[ 11 ]

[ 12 ]

[ 13 ]

[ 14 ]

[ 15 ]

[ 16 ]

[ 17 ]

[ 18 ]

[ 19 ]

[ 20 ]

[ 21 ]

[ 22 ]

[ 23 ]

[ 24 ]

[ 25 ]

[ 26 ]