Иммуномика

Иммуномика — это изучение регуляции иммунной системы и реакции на патогены с использованием полногеномных подходов. С появлением геномных и протеомных технологий учёные получили возможность визуализировать биологические сети и делать выводы о взаимосвязях между генами и/или белками; в последнее время эти технологии стали использоваться, чтобы лучше понять, как функционирует иммунная система и как она регулируется. Две трети генома активны в одном или нескольких типах иммунных клеток, и менее 1% генов уникально экспрессируются в клетках данного типа. Поэтому крайне важно, чтобы паттерны экспрессии этих типов иммунных клеток были расшифрованы в контексте сети, а не как индивидуума, чтобы их роли были правильно охарактеризованы и связаны друг с другом. Дефекты иммунной системы, такие как аутоиммунные заболевания , иммунодефицит и злокачественные новообразования, могут получить пользу от геномного понимания патологических процессов. Например, анализ систематических изменений экспрессии генов может связать эти закономерности с конкретными заболеваниями и генными сетями, важными для иммунных функций.

Традиционно ученым, изучающим иммунную систему, приходилось искать антигены на индивидуальной основе и идентифицировать белковую последовательность этих антигенов (« эпитопы »), которая стимулировала бы иммунный ответ. Эта процедура требовала, чтобы антигены были выделены из целых клеток, расщеплены на более мелкие фрагменты и протестированы на Т- и В-клетках для наблюдения Т- и В-клеточных ответов. Эти классические подходы могли лишь визуализировать эту систему как статическое состояние и требовали большого количества времени и труда.

Иммуномика облегчила этот подход благодаря своей способности рассматривать иммунную систему в целом и характеризовать ее как динамическую модель. Было обнаружено, что одними из наиболее отличительных особенностей иммунной системы являются непрерывная подвижность, обновление и пластичность составляющих ее клеток. Кроме того, современные геномные технологии, такие как микрочипы , могут фиксировать экспрессию генов иммунной системы с течением времени и отслеживать взаимодействия микроорганизмов с клетками врожденной иммунной системы . Новые протеомные подходы, включая картирование эпитопов Т-клеток и В-клеток , также могут ускорить темпы открытия учеными связей антитело-антиген.

Определение

Иммунная система хозяина реагирует на инвазию патогена набором патоген-специфичных реакций, в которых участвуют многие «игроки»; к ним относятся антитела , Т-хелперы , цитотоксические Т-клетки и многие другие. Антигенпрезентирующие клетки (АПК) способны интернализировать патогены и отображать фрагмент антигена – эпитоп – с главными комплексами гистосовместимости (МНС) на поверхности клетки. Ответ Т-клеток инициируется, когда Т-клетки распознают эти отображаемые эпитопы. Для стимуляции Т- и В-клеточных ответов необходимы только специфические пептидные последовательности некоторых патоген-специфичных антигенов; то есть вся последовательность патогенного пептида не является необходимой для инициации иммунного ответа. « Иммунитет » патогена описывается набором его эпитопов и может быть определен путем сравнения последовательностей генома и применения иммуноинформационных инструментов.

История

Эш Ализаде и др. были одними из первых, кто осознал потенциал кДНК микрочипов для определения экспрессии генов иммунных клеток. человека Их анализ исследовал экспрессию генов В- и Т- лимфоцитов во время клеточной активации и/или стимуляции цитокинами , типом сигнальной регуляторной молекулы. Известно, что многие из активированных генов в стимулированных Т-лимфоцитах участвуют в переходе клеточного цикла G0/G1 или кодируют хемокины , сигнальные молекулы, участвующие в воспалительной реакции. Эта команда также смогла визуализировать временные закономерности экспрессии генов во время митогенеза Т-клеток . В заключительных абзацах своей знаковой статьи эти ученые заявляют, что «практически каждый аспект иммунологических исследований выиграет от анализа экспрессии генов на микрочипах кДНК», и, таким образом, возвестили о росте иммуномики.

Ограниченная на тот момент доступными микрочипами и неполным геномом человека, эта же группа исследователей была мотивирована создать специализированный микрочип, ориентированный на гены, преимущественно экспрессируемые в данном типе клеток или известные как функционально важные в данном типе клеток. биологический процесс. В результате Ализаде и его коллеги разработали микрочип кДНК «Лимфочип», который содержал 13 000 генов и был обогащен генами, важными для иммунной системы.

Статья Айера и др. 1999 года стала еще одной статьей, раскрывающей важность применения геномных технологий в иммунологических исследованиях. Хотя эти исследователи не намеревались затрагивать какие-либо аспекты иммунитета в начале своего эксперимента, они заметили, что профили экспрессии сывороткой стимулированных фибробластов были намного богаче, чем ожидалось, и предположили важную физиологическую роль фибробластов в заживлении ран. Гены, индуцированные сывороткой, связаны с процессами, связанными с заживлением ран, включая гены, непосредственно участвующие в ремоделировании сгустка и внеклеточного матрикса, а также гены, кодирующие сигнальные белки воспаления, развития новых кровеносных сосудов и возобновления роста эпителиальной ткани. Кроме того, одним из наиболее значительных результатов этого анализа экспрессии стало открытие более 200 ранее неизвестных генов, экспрессия которых временно регулировалась во время реакции фибробластов на сыворотку. Эти результаты показали важность рассмотрения иммунного ответа как совместной физиологической программы и потребовали дальнейшего изучения иммунной системы как сети, а не только как отдельных частей.

В 2006 году Мутафци и др. продемонстрировали, что инструменты картирования эпитопов могут точно идентифицировать эпитопы, ответственные за 95% ответа мышиных Т-клеток на вирус коровьей оспы . Благодаря своей работе эти ученые представили междисциплинарную сферу информатики и иммунологии, используя геномные, протеомные и иммунологические данные. Поразительный успех и простота этого метода побудили исследователей как определить иммунитет других патогенов, так и измерить широту и перекрытие иммуномов патогенов, которые приводят к возникновению иммунитета. Кроме того, были предложены другие области применения инструментов картирования эпитопов, включая аутоиммунитет, трансплантацию и иммуногенность .

Используемые технологии

Иммуномные микрочипы

Было создано несколько типов микрочипов для специфического наблюдения за реакцией и взаимодействием иммунной системы. Микрочипы антител используют антитела в качестве зондов и антигены в качестве мишеней. Их можно использовать для прямого измерения концентраций антигенов, к которым специфичны зонды антител. Пептидные микрочипы используют антигенные пептиды в качестве зондов и сывороточные антитела в качестве мишеней. Их можно использовать в функциональных иммунологических приложениях для понимания аутоиммунных заболеваний и аллергий, определения эпитопов B-клеток, исследований вакцин, анализов обнаружения и анализа специфичности антител. Микрочипы MHC являются новейшей разработкой в ​​области иммунных массивов и используют комплексы пептид-MHC и их костимулирующие молекулы в качестве зондов, а популяции Т-клеток - в качестве мишеней. Связанные Т-клетки активируются и секретируют цитокины, которые улавливаются специфическими антителами для обнаружения. Этот микрочип может картировать эпитопы Т-клеток, ограниченные MHC.

Лимфочип

Лимфочип: специализированный микрочип кДНК.

Лимфочип — это специализированный микрочип кДНК человека, обогащенный генами, связанными с иммунной функцией, созданный Эшем Ализаде из Стэнфордского университета . 17 853 клона кДНК были взяты из трех источников. Первый набор клонов отбирали, если идентифицированные метки экспрессируемых последовательностей (EST) были уникальными или специфически обогащены библиотеками лимфоидных кДНК; они составляют ~80% клонов лимфочипов. Второй набор клонов был идентифицирован в ходе микроматричного анализа иммунных ответов первого поколения. 3183 гена, которые, как известно или предположительно, играют роль в иммунной функции, онкогенезе , апоптозе , пролиферации клеток или являются открытыми рамками считывания Наконец, на лимфочипе было использовано патогенных вирусов человека. Часто добавляются новые гены.

Инструменты картирования эпитопов Т- и В-клеток

Картирование эпитопов идентифицирует участки антител , с которыми связываются их целевые антигены. В прошлом ученым приходилось изолировать антигены, расщеплять их на более мелкие фрагменты и определять, какой из этих фрагментов стимулирует Т- и В-клеточные реакции, чтобы определить эпитоп антитела. Иммуномика использует возможности биоинформатики и предлагает алгоритмы картирования, которые ускоряют обнаружение последовательностей эпитопов. Эти алгоритмы актуальны для разработки вакцин, а также для характеристики и модификации иммунных реакций в контексте аутоиммунитета , эндокринологии , аллергии , трансплантации, диагностики и разработки терапевтических белков.

Алгоритмы картирования эпитопов Т- и В-клеток могут вычислительно предсказывать эпитопы на основе геномной последовательности патогенов без предварительного знания структуры или функции белка. Для идентификации эпитопов используется ряд шагов:

1. Сравнение вирулентных и авирулентных организмов позволяет выявить гены-кандидаты, которые кодируют эпитопы, вызывающие Т-клеточный ответ, путем поиска последовательностей, уникальных для вирулентных штаммов. Кроме того, технологии дифференциальных микрочипов могут обнаружить специфичные для патогена гены, активация которых активируется во время взаимодействия с хозяином и может иметь значение для анализа, поскольку они имеют решающее значение для функции патогена.
2. Инструменты иммуноинформатики прогнозируют области этих генов-кандидатов, которые взаимодействуют с Т-клетками, путем сканирования белковых последовательностей патогена, полученных из генома.
3. Эти предсказанные пептиды синтезируются и используются в скрининге in vitro против Т-клеток. Распознавание положительного иммунного ответа позволяет предположить, что этот пептид содержит эпитоп, который стимулирует иммунный ответ в ходе естественной инфекции или заболевания.

Доступные инструменты картографирования

• ЭпиМатрикс
• ТЕПИТОП
• Мультипред
• MHC-резьба
• МХКПред
• NetMHC
• ЛпПеп
• БИМАС

Окрашивание тетрамера методом проточной цитометрии

Руководящий принцип проточной цитометрии заключается в том, что клетки или субклеточные частицы помечаются флуоресцентными зондами, проходят через лазерный луч и сортируются по силе флуоресценции, излучаемой клетками, содержащимися в каплях. MHC [[окрашивание тетрамера]] с помощью проточной цитометрии идентифицирует и изолирует специфические Т-клетки на основе специфичности связывания их рецепторов клеточной поверхности с флуоресцентно-меченными комплексами MHC-пептид.

ЭЛИСПОТ

ELISPOT представляет собой модифицированную версию иммуноанализа ELISA и является распространенным методом мониторинга иммунных реакций.

Вклад в понимание иммунной системы

Иммуномика оказала значительное влияние на понимание иммунной системы, обнаружив различия в профилях экспрессии генов разных типов клеток, охарактеризовав иммунный ответ, прояснив линии и взаимоотношения иммунных клеток, а также установив сети регуляции генов. Хотя следующий список работ не является полным, он призван продемонстрировать широкое применение иммунологических исследований и их влияние на иммунологию.

Активация и дифференцировка иммунных клеток

Анергия В-лимфоцитов

Микрочипы обнаружили закономерности экспрессии генов, которые коррелируют с антиген-индуцированной активацией или анергией в В-лимфоцитах. Пути анергии лимфоцитов включают индукцию некоторых, но не всех сигнальных путей, используемых во время активации лимфоцитов. Например, киназные пути NFAT и MAPK/ERK экспрессируются в анергических (или «толерантных) клеточных линиях, тогда как пути NF-kB и N-концевых киназ c-Jun — нет. Из 300 генов, экспрессия которых была изменена после стимулирования антигеном наивных В-клеток, только 8 из этих генов регулировались в толерантных В-клетках. Понимание этих путей «толерантности» имеет важные последствия для разработки иммунодепрессантов. Эти признаки экспрессии генов толерантных В-клеток можно использовать во время скрининга лекарств для поиска соединений, имитирующих функциональные эффекты естественной толерантности.

Дифференциация лимфоцитов

человека Профили экспрессии генов во время дифференцировки лимфоцитов наблюдают за зрелыми, наивными В-клетками от их состояния покоя через реакции зародышевого центра до терминальной дифференцировки. Эти исследования показали, что В-клетки зародышевого центра представляют собой отдельную стадию дифференцировки, поскольку профиль экспрессии генов отличается от активированных периферических В-клеток. Хотя ни одна система культивирования in vitro не смогла побудить покоящиеся периферические В-клетки принять полный фенотип зародышевого центра, эти профили экспрессии генов можно использовать для измерения успеха культур in vitro в имитации состояния зародышевого центра по мере их развития.

Лимфоидные злокачественные новообразования

Около 9 из каждых 10 случаев лимфоидного рака человека происходят из В-клеток. Различные паттерны экспрессии по всему иммуному при большом количестве диффузных крупноклеточных лимфом (DLCL) – наиболее распространенной формы неходжкинской лимфомы – выявили по крайней мере два разных подтипа того, что ранее считалось одним заболеванием. Одна подгруппа этих DLCL демонстрирует образец экспрессии генов, аналогичный таковому в нормальных B-клетках зародышевого центра, и подразумевает, что опухолевая клетка произошла из B-клетки зародышевого центра. Другие исследования В-клеточных злокачественных новообразований показывают, что фолликулярные лимфомы имеют общие черты экспрессии с В-клетками зародышевого центра, тогда как клетки хронического лимфоцитарного лейкоза напоминают покоящиеся лимфоциты периферической крови. Более того, гетерогенность каждой из этих клеточных линий также позволяет предположить, что внутри каждого типа лимфомы существуют разные подтипы, как это было показано в DLCL. Такие знания можно использовать для направления пациентов к наиболее подходящей терапии.

Иммунный ответ

Реакция макрофагов на бактерии

Микрочипы проанализировали глобальные реакции макрофагов на различные микроорганизмы и подтвердили, что эти реакции поддерживают и контролируют воспалительные процессы, а также убивают микроорганизмы. Эти независимые исследования смогли лучше описать, как макрофаги атакуют различные микроорганизмы. Было обнаружено, что «основной транскрипционный ответ» индуцирует 132 гена и репрессирует 59 генов. Индуцируемые гены включают провоспалительные хемокины и цитокины, а также соответствующие им рецепторы. Также наблюдался «патоген-специфический ответ».

Дендритный ответ на патоген

Дендритные клетки (ДК) помогают макрофагам поддерживать воспалительные процессы и участвовать в реакции врожденной иммунной системы , но также могут запускать адаптивный иммунитет . Анализ экспрессии генов показал, что DC могут «выполнять несколько задач одновременно», временно разделяя свои различные функции. Вскоре после распознавания инфекционного агента незрелые ДК переходят в состояние ранней активации посредством основного ответа, характеризующегося быстрым подавлением генов, участвующих в распознавании патогена и фагоцитозе , активацией генов цитокинов и хемокинов для привлечения других иммунных клеток на сторону воспаления; и экспрессия генов, контролирующих миграционную способность. Ранне активированные ДК могут мигрировать из нелимфоидных тканей в лимфатические узлы, где они могут запускать Т-клеточный ответ. Эти ранние ответы ДК связаны с врожденным иммунитетом и представляют собой «основной транскрипционный ответ» ДК. Патоген-специфические реакции оказывают более сильное влияние на способность ДК регулировать адаптивный иммунитет.

Различение типов иммунных клеток

Сравнение различий между общей программой транскрипции иммунных клеток может создать графики, которые позиционируют каждый тип клеток так, чтобы лучше всего отражать его профиль экспрессии относительно всех других клеток, и могут выявить интересные взаимосвязи между типами клеток. Например, профили транскрипции иммунных клеток медуллярного эпителия тимуса картированы ближе к лимфоцитам, чем к другим эпителиям. Это может свидетельствовать о том, что между этими двумя типами клеток существует функциональное взаимодействие, требующее совместного использования определенных транскриптов и белков. При сравнении профилей экспрессии генов в клетках системы крови подмножества Т- и В-клеток тесно группируются с соответствующими типами клеток.

Изучая транскрипционный профиль различных Т-клеток, ученые показали, что естественные Т-клетки-киллеры являются близким вариантом обычных CD4+ Т-клеток , а не промежуточным типом клеток между Т-клетками и естественными клетками-киллерами . Кроме того, ДК, естественные клетки-киллеры и В-клетки тесно сгруппированы на основе их глобальных профилей экспрессии. Можно было ожидать, что В-лимфоциты и Т-лимфоциты будут группироваться отдельно друг от друга или что естественные клетки-киллеры будут более тесно связаны с Т-клетками, поскольку они имеют общие предшественники, цитолитическую активность и сходные маркеры активации. Таким образом, иммуномика установила взаимоотношения между клеточными линиями, которые отклоняются от классических представлений. Кроме того, это может лучше объяснить наблюдаемую пластичность дифференцировки лимфоидных и миелоидных клеток из-за значительного перекрытия между глобальными профилями экспрессии этих разных линий.

Регуляторные сети иммунных клеток

Сети представляют собой самый широкий уровень генетических взаимодействий и стремятся связать все гены и транскрипты в иммунологическом геноме. Клеточные фенотипы и состояния дифференцировки в конечном итоге устанавливаются активностью этих сетей совместно регулируемых генов. Одна из наиболее полных сетей в иммунологии расшифровала регуляторные связи между нормальными и трансформированными В-клетками человека. Этот анализ предполагает наличие иерархической сети, в которой небольшое количество сильно связанных генов (называемых «концентраторами») регулирует большинство взаимодействий. Протоонкоген MYC . стал основным центром и очень влиятельным регулятором В-клеток Примечательно, что MYC напрямую контролирует BYSL , высококонсервативный, но плохо охарактеризованный ген, который является крупнейшим центром во всей сети В-клеток. Это говорит о том, что BYSL кодирует важную клеточную молекулу и критически важный эффектор функции MYC, и мотивирует дополнительные исследования для выяснения его функции. Таким образом, использование данных об экспрессии генов для создания сетей может выявить гены, оказывающие большое влияние на дифференцировку иммунных клеток, которые еще не были идентифицированы догеномными технологиями.

Практическое применение

Разработка вакцины

Как цитируют Стефанию Бамбини и Рино Раппуоли: «Новые мощные геномные технологии увеличили количество болезней, которые можно лечить с помощью вакцинации, и сократили время на исследования и разработку вакцин ». Доступность полных последовательностей генома патогенов в сочетании с высокопроизводительными геномными технологиями помогла ускорить разработку вакцин. Обратная вакцинология использует геномные последовательности вирусных, бактериальных или паразитарных патогенов для идентификации генов, потенциально кодирующих гены, способствующие патогенезу . Первое применение обратной вакцинологии выявило кандидатов на вакцину против Neisseria meningitidis серогруппы B. Вычислительные инструменты идентифицировали 600 предполагаемых поверхностно-экспонированных или секретируемых белков из полной последовательности генома патогенного штамма MenB на основе особенностей последовательности. Эти предполагаемые белки были экспрессированы в E. coli, очищены и использованы для иммунизации мышей. Тесты с использованием иммунных сывороток мышей позволили оценить способность антител защищать от этих белков. Белки, способные вызывать сильный иммунный ответ, были проверены на консервативность последовательности в группе штаммов менингита и позволили провести дальнейший отбор антигена, способного вызвать иммунный ответ против большинства штаммов в панели. На основе этих последовательностей антигенов ученым удалось разработать универсальную «коктейльную» вакцину против Neisseria meninitidis , которая использует пять антигенов для укрепления иммунитета. Подобные подходы использовались для множества других патогенов человека, таких как Streptococcus pneumoniae , Chlamydia pneumoniae , Bacillus anthracis , Porphyromonas gingivalis , Mycobacterium Tuberculosis , Helicobacter pylori и других. Кроме того, начались исследования по разработке вакцин против вирусов.

Диагностика заболеваний

Инвентаризация рецепторов и путей передачи сигналов, которые иммунные клетки используют для мониторинга и защиты организма, приводит к появлению характерных закономерностей измененной экспрессии генов в клетках периферической крови, которые отражают характер инфекции или повреждения. Таким образом, распознавание характерных профилей экспрессии клеток периферической крови может стать мощным диагностическим инструментом, привлекая эти клетки в качестве «шпионов» для обнаружения скрытых заболеваний или агентов, которые невозможно легко культивировать из организма-хозяина.

Например, цитомегаловирусная (CMV) инфекция фибробластов и HTLV-I инфекция Т-лимфоцитов выявили различные профили экспрессии генов. Инфекция ЦМВ провоцировала уникальный ответ интерферона, тогда как инфекция HTLV-1 индуцировала гены-мишени NF-kB. Тип лейкоцитов также был снова протестирован. Бактериальное воздействие и экспрессия иммунома варьировались в зависимости от типа используемого бактериального штамма.

Мониторинг изменения экспрессии генов в периферической крови также может помочь определить течение инфекции и помочь пациентам подобрать терапию, адаптированную к стадии их заболевания. Этот подход уже использовался против сепсиса – заболевания, которое прогрессирует по предсказуемому сценарию.Изменения в экспрессии генов могут предшествовать клиническому обострению симптомов, как при рассеянном склерозе , и позволяют врачам пресечь эти «обострения» в зародыше.

Иммунологический геномный проект

Основная статья: Проект иммунологического генома

Иммунная система представляет собой сеть генетических и сигнальных путей, соединенных сетью взаимодействующих клеток. Проект «Иммунологический геном» направлен на создание полного сборника экспрессии генов, кодирующих белки, для всех популяций клеток иммунной системы мышей. Он анализирует как устойчивые состояния внутри различных клеточных популяций, так и реакции на генетические и/или экологические возмущения, вызванные естественным генетическим полиморфизмом, нокаутом генов, нокдауном генов с помощью РНКи или медикаментозным лечением. Эти профили экспрессии используются в вычислительных инструментах для обратного проектирования или прогнозирования регуляторных сетей иммунных клеток.

К 2008 году в проекте ImmGen участвовали семь лабораторий иммунологии и три лаборатории вычислительной биологии по всей территории Соединенных Штатов, и было идентифицировано и описано более 200 популяций клеток, участвующих в иммунной системе. Этот консорциум создал браузер данных для изучения моделей экспрессии конкретных генов, сетей совместно регулируемых генов и генов, которые могут надежно различать типы клеток. Необработанные данные также доступны из Омнибуса экспрессии генов NCBI.

Базы данных

• Иммунный ответ in silico (IRIS)
• Справочная база данных иммунных клеток
• Проект иммунологического генома
• База данных и ресурс анализа иммунных эпитопов (IEDB)
• ИМГТ
• КОМПАНИЯ
• космический корабль
• МХКБН
• ИПД
• Воплощение
• Аллергом

См. также

• Иммунопротеомика

Ссылки

←