✖


Jump to content

Полимеразная цепная реакция в реальном времени

(Перенаправлено из RT-QPCR )
Для обратной транскрипционной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) см. Реакцию обратной транскрипции полимеразной цепной реакции .
Диаграмма флуоресценции Sybr Green, произведенная в ПЦР в реальном времени
Кривая плавления, произведенная в конце ПЦР в реальном времени

Полимеразная цепная реакция в реальном времени ( ПЦР в реальном времени или КПЦР , когда используется количественно), представляет собой лабораторную метод молекулярной биологии , основанную на полимеразной цепной реакции (ПЦР). Он контролирует амплификацию целевой молекулы ДНК во время ПЦР (т.е. в режиме реального времени), а не на его конце, как в обычной ПЦР. ПЦР в режиме реального времени может использоваться количественно и полуковоронополично (то есть выше/ниже определенного количества молекул ДНК).

Два общих метода обнаружения продуктов ПЦР в ПЦР в реальном времени-это (1) неспецифические флуоресцентные красители , которые интеркалируют с любой двухцепочечной ДНК и (2) специфичными для последовательности ДНК-зонды, состоящие из олигонуклеотидов , которые мечены флуоресцентным репортером , который позволяет обнаружить только после гибридизации зонда с его дополнительной последовательности.

Минимальная информация для публикации количественных руководств по ПЦР-экспериментам в реальном времени ( MIQE ) предполагает, что аббревиатура КПЦР была использована для количественной ПЦР в реальном времени и чтобы RT-QPCR была использована для обратной транскрипции-QPCR. [ 1 ] Аббревиатура «RT-PCR» обычно обозначает обратную транскрипционную полимеразную цепную реакцию , а не ПЦР в реальном времени, но не все авторы придерживаются этого соглашения. [ 2 ]

Фон

[ редактировать ]
ПЦР в реальном времени использует флуорофоры для обнаружения уровней экспрессии генов .

Клетки во всех организмах регулируют экспрессию генов путем оборота транскриптов генов (одноцепочечная РНК ): количество экспрессированного гена в клетке может быть измерено по количеству копий транскрипта РНК этого гена, присутствующего в образце. Чтобы надежно обнаружить и количественно оценить экспрессию генов из небольших количеств РНК, необходима амплификация транскрипта гена. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является распространенным методом для амплификации ДНК; Для ПЦР на основе РНК образец РНК сначала транскрибируется обратно до комплементарной ДНК (кДНК) с обратной транскриптазой .

Для усиления небольших количеств ДНК используется та же методология, что и в обычной ПЦР с использованием матрицы ДНК, по крайней мере, одной пары специфических праймеров , дезоксирибонуклеотид- трифосфатов, подходящего буферного раствора и термостабильной ДНК-полимеразы . вещество, отмеченное флуорофором В эту смесь добавляется в термоциклере , который содержит датчики для измерения флуоресценции флуорофора после того, как оно было возбуждено на требуемой длине волны , что позволяет измерить скорость генерации для одного или нескольких специфических продуктов. Это позволяет измерять скорость генерации амплифицированного продукта в каждом цикле ПЦР. Сгенерированные таким образом данные могут быть проанализированы с помощью компьютерного программного обеспечения для вычисления относительной экспрессии генов (или количества копии мРНК ) в нескольких образцах. Количественная ПЦР также может быть применена для обнаружения и количественной оценки ДНК в образцах, чтобы определить присутствие и изобилие конкретной последовательности ДНК в этих образцах. [ 3 ] Это измерение проводится после каждого цикла амплификации, и это причина, по которой этот метод называется ПЦР в реальном времени (то есть немедленной или одновременной ПЦР).

Количественная ПЦР и ДНК -микрочипа являются современными методологиями для изучения экспрессии генов . Старые методы были использованы для измерения численности мРНК: дифференциальный дисплей , анализ защиты РНКазы и северный блот . Северный блоттинг часто используется для оценки уровня экспрессии гена путем визуализации численности транскрипта мРНК в образце. В этом методе очищенная РНК отделяется электрофорезом агарозного геля , переносится в твердую матрицу (например, нейлоновую мембрану), и зондирует специфическим ДНК или РНК -зондом , который дополняется для интересующего гена. Хотя этот метод все еще используется для оценки экспрессии генов, он требует относительно больших количеств РНК и предоставляет только качественную или полу -количественную информацию уровней мРНК. [ 4 ] Ошибки оценки, возникающие в результате изменений в методе количественной оценки, могут быть результатом целостности ДНК, эффективности ферментов и многих других факторов. ряд систем стандартизации (часто называемые методами нормализации По этой причине был разработан ). Некоторые были разработаны для количественной оценки общей экспрессии генов, но наиболее распространенные направлены на количественную оценку специфического гена, изучаемого по отношению к другому геном, называемому нормализующим геном, который выбирается для его почти постоянного уровня экспрессии. Эти гены часто выбираются из генов домашнего хозяйства, поскольку их функции, связанные с основным выживаемостью клеток, обычно подразумевают конститутивную экспрессию генов . [ 5 ] [ 6 ] Это позволяет исследователям сообщать о соотношении для экспрессии интересующих генов, разделенных на экспрессию выбранного нормализатора, что позволяет сравнить первое, не зная его абсолютного уровня выражения.

Наиболее часто используемыми нормализующими генами являются те, которые кодируют для следующих молекул: тубулин , глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа , альбумин , циклофилин и рибосомные РНК . [ 4 ]

Основные принципы

[ редактировать ]
Основная статья: полимеразная цепная реакция

ПЦР в реальном времени выполняется в термоциклере с способностью освещать каждый образец с помощью луча света, по крайней мере, одной указанной длины волны, и обнаруживает флуоресценцию, излучаемую возбужденным флуорофором . Термальный циклер также способен быстро нагревать и охлаждения, тем самым используя преимущества физико -химических свойств нуклеиновых кислот и ДНК -полимеразы .

Процесс ПЦР обычно состоит из ряда изменений температуры, которые повторяются в 25–50 раз. Эти циклы обычно состоят из трех стадий: первый, около 95 ° C, позволяет разделить двойную цепь нуклеиновой кислоты; Второй, при температуре около 50–60 ° C, позволяет связывать праймеры с матрицей ДНК; [ 7 ] Третий, на уровне 68 до 72 ° C, облегчает полимеризацию , выполняемую ДНК -полимеразой. Из -за небольшого размера фрагментов последний шаг обычно пропускается в этом типе ПЦР, поскольку фермент способен воспроизвести ампликон ДНК во время изменения между стадией выравнивания и стадией денатурирования. Кроме того, в четырехступенчатой ​​ПЦР измеряется флуоресценция во время коротких температурных фаз, которые длится всего несколько секунд в каждом цикле, с температурой, например, 80 ° C, чтобы уменьшить сигнал, вызванный присутствием димеров праймера Когда используется неспецифический краситель. [ 8 ] Температура и время, используемые для каждого цикла, зависят от широкого спектра параметров, таких как: фермент, используемый для синтеза ДНК, концентрацию двухвалентных ионов и дезоксирибонуклеотидные трифосфаты (DNTP) в реакции и температуре связывания праймеров. [ 9 ]

Химическая классификация

[ редактировать ]

Техника ПЦР в реальном времени может быть классифицирована по химии, используемой для обнаружения продукта ПЦР, специфических или неспецифических флуорохромов.

Неспецифическое обнаружение: ПЦР в реальном времени с двухцепочечными ДНК-связывающими красителями в качестве репортеров

[ редактировать ]

ДНК-связывающий краситель связывается со всей двухцепочечной (DS) ДНК в ПЦР, увеличивая флуоресцентный квантовый выход красителя. Следовательно, увеличение продукта ДНК во время ПЦР приводит к увеличению интенсивности флуоресценции, измеренной в каждом цикле. Тем не менее, красители дцДНК, такие как Sybr Green, будут связываться со всеми продуктами ПЦР DSDNA, включая неспецифические продукты ПЦР (такие как димер праймера ). Это потенциально может мешать или предотвратить точный мониторинг предполагаемой целевой последовательности.

В ПЦР в реальном времени с красителями дцДНК реакция готовится как обычно, с добавлением флуоресцентного красителя дцДНК. Затем реакция запускается в приборе ПЦР в реальном времени , и после каждого цикла интенсивность флуоресценции измеряется с помощью детектора; краситель флуоресцирует только при связанном с дцДНК (т.е. продукт ПЦР). Этот метод имеет преимущество в том, что вам нужно только пару праймеров для выполнения усиления, что снижает затраты; Множественные целевые последовательности можно контролировать в трубе с помощью различных типов красителей.

Конкретное обнаружение: метод флуоресцентного репортерного зонда

[ редактировать ]
(1) В неповрежденных зондах репортерная флуоресценция гасит. (2) Зонды и комплементарная ДНК -цепь гибридизированы, а репортерная флуоресценция все еще гасит. (3) Во время ПЦР зонд деградируется полимеразой Taq и выпущенным флуоресцентным репортером.

Флуоресцентные репортерные зонды обнаруживают только ДНК, содержащую последовательность, дополненную зонду; Следовательно, использование репортерного зонда значительно увеличивает специфичность и позволяет выполнять технику даже в присутствии других дцДНК. Используя этикетки различного цвета, флуоресцентные зонды могут использоваться в мультиплексных анализах для мониторинга нескольких целевых последовательностей в одной и той же трубе. Специфичность флуоресцентных репортерных зондов также предотвращает интерференцию измерений, вызванных димерами праймеров , которые являются нежелательными побочными продуктами в ПЦР. Тем не менее, флуоресцентные репортерные зонды не предотвращают ингибирующий эффект димеров праймера, что может уменьшить накопление желаемых продуктов в реакции.

Метод опирается на зонд на основе ДНК с флуоресцентным репортером на одном конце и гаситель флуоресценции на противоположном конце зонда. Непосредственная близость репортера к гасителю предотвращает обнаружение его флуоресценции; Разрыв зонда с помощью экзонуклеазной активности от 5 до 3 'экзонуклеазы так-полимеразы нарушает близость репортерного китчика и, таким образом, допускает неконтролируемую излучение флуоресценции, которая может быть обнаружена после возбуждения лазером. Увеличение продукта, нацеленного на репортерный зонд в каждом цикле ПЦР, поэтому вызывает пропорциональное увеличение флуоресценции из -за разрушения зонда и высвобождения репортера.

  1. ПЦР готовится как обычно (см. ПЦР ), и добавляется репортерный зонд.
  2. Когда начинается реакция, на стадии отжига ПЦР как зонда, так и праймеры отжигают ДНК -мишень.
  3. Полимеризация новой цепи ДНК инициируется из праймеров, и как только полимераза достигает зонда, его 5'-3'-экзонуклеаза ухудшает зонд, физически отделяя флуоресцентного репортера от гасителя, что приводит к увеличению флуоресценции.
  4. Флуоресценция обнаруживается и измеряется в машине ПЦР в реальном времени, а ее геометрическое увеличение, соответствующее экспоненциальному увеличению продукта, используется для определения цикла количественного определения (C Q ) в каждой реакции.

Анализ температуры слияния

[ редактировать ]
Отдельные кривые слияния для ряда продуктов ПЦР (показывают различные цвета). Реакции усиления можно увидеть для конкретного продукта (розовый, синий) и других с отрицательным результатом (зеленый, оранжевый). Пик слияния, указанный со стрелкой, показывает пик, вызванный димерами праймеров, который отличается от ожидаемого продукта амплификации. [ 10 ]

ПЦР в реальном времени позволяет идентифицировать специфические, амплифицированные фрагменты ДНК, используя анализ их температуры плавления (также называемого значением T M , от MELTING T Emperature ). Используемый метод обычно представляет собой ПЦР с двухцепочечными ДНК-связывающими красителями в качестве репортеров, а используемый краситель обычно является зеленым. Температура плавления ДНК специфична для амплифицированного фрагмента. Результаты этого метода получаются путем сравнения кривых диссоциации анализируемых образцов ДНК. [ 11 ]

В отличие от обычной ПЦР, этот метод избегает предыдущего использования методов электрофореза , чтобы продемонстрировать результаты всех образцов. Это связано с тем, что, несмотря на кинетическую технику, количественная ПЦР обычно оценивается в отдельной конечной точке. Таким образом, метод обычно дает более быстрые результаты и/или использует меньше реагентов, чем электрофорез. Если требуется последующий электрофорез, необходимо протестировать только те образцы, которые, как показали ПЦР в реальном времени сомнительной, и/или ратифицировать результаты для образцов, которые положительно протестировали на конкретный детерминант.

Моделирование

[ редактировать ]

В отличие от ПЦР конечной точки (обычная ПЦР), ПЦР в реальном времени позволяет контролировать желаемый продукт в любой точке процесса усиления путем измерения флуоресценции (в рамке в реальном времени измерение сделано из его уровня по данному порогу). Обычно используемый метод количественной оценки ДНК с помощью ПЦР в реальном времени зависит от построения флуоресценции в отношении количества циклов в логарифмической шкале . Порог для обнаружения флуоресценции на основе ДНК устанавливается в 3–5 раз от стандартного отклонения сигнального шума выше фона. Количество циклов, при которых флуоресценция превышает порог, называется пороговым циклом (C T ) или, в соответствии с руководящими принципами MIQE, циклом количественного определения (C Q ) . [ 1 ]

Во время фазы экспоненциальной амплификации количество шаблона ДНК -мишени (AMPLICON) удваивает каждый цикл. Например, образец ДНК, чей C Q предшествовал образу другого образца на 3 цикла содержал 2 3 = 8 раз больше шаблона. Однако эффективность усиления часто является переменной среди праймеров и шаблонов. Следовательно, эффективность комбинации праймеров-таблица оценивается в эксперименте титрования с последовательными разведениями матрицы ДНК для создания стандартной кривой изменения в (C Q ) с каждым разведением. Наклон затем используется для определения эффективности амплификации, которая составляет 100% , линейной регрессии если разбавление 1: 2 приводит к (C Q ) разнице в 1. Пороговый метод цикла дает несколько допущений механизма реакции и имеет Опора на данные из областей с низким уровнем сигнала / шум профиля амплификации, которые могут ввести существенную дисперсию во время анализа данных. [ 12 ]

Чтобы количественно оценить экспрессию генов, (C q ) для РНК или ДНК из интересующего гена вычитается из (C q ) РНК/ДНК из гена домашнего хозяйства в том же образце, чтобы нормализовать изменение количества и качества РНК между разными образцами. Эта процедура нормализации обычно называют ΔC T -метод [ 13 ] и позволяет сравнивать экспрессию интересующего гена среди разных образцов. Однако для такого сравнения экспрессия нормализующего эталонного гена должна быть очень похожей по всем образцам. Таким образом, выбор эталонного гена, выполняющий этот критерий, имеет большое значение и часто сложно, потому что лишь очень немногие гены показывают равные уровни экспрессии в ряде различных состояний или тканей. [ 14 ] [ 15 ] Хотя анализ порогового цикла интегрирован со многими коммерческими программными системами, существуют более точные и надежные методы анализа данных профиля амплификации, которые следует учитывать в тех случаях, когда воспроизводимость вызывает беспокойство. [ 12 ]

Также были предложены методы количественного определения QPCR на основе механизма, и они не требуют стандартной кривой для количественной оценки. Методы, такие как mak2 [ 16 ] Было показано, что они имеют равные или лучшие количественные характеристики по стандартным методам кривой. Эти методы, основанные на механизме, используют знания о процессе амплификации полимеразы для получения оценок исходной концентрации выборки. Расширение этого подхода включает в себя точную модель всего профиля реакции ПЦР, которая позволяет использовать данные с высоким уровнем сигнала / шум и способность проверять качество данных до анализа. [ 12 ]

Согласно исследованию Ruijter et al. [ 17 ] MAK2 предполагает постоянную эффективность усиления во время реакции ПЦР. Тем не менее, теоретический анализ полимеразной цепной реакции, из которой был получен MAK2, показал, что эффективность амплификации не является постоянной на протяжении всей ПЦР. В то время как количественное определение MAK2 обеспечивает надежные оценки концентрации ДНК -мишени в образце в нормальных условиях КПЦР, MAK2 не достоверно определяет концентрацию мишени для анализов QPCR с конкурентами.

Приложения

[ редактировать ]

Существует множество применений для количественной полимеразной цепной реакции в лаборатории . Он обычно используется как для диагностических , так и для фундаментальных исследований . Использование метода в промышленности включает количественную оценку микробной нагрузки в пищевых продуктах или на растительные вещества, обнаружение ГМО ( генетически модифицированные организмы ), а также количественное определение и генотипирование вирусных патогенов человека.

Количественная оценка экспрессии генов

[ редактировать ]

Количественная оценка экспрессии генов традиционными методами обнаружения ДНК является ненадежной. Обнаружение мРНК на северной блот -блот или ПЦР -продуктах на геле или южном блотте не позволяет точно определить количественное определение. [ 18 ] Например, в течение 20–40 циклов типичной ПЦР количество продукта ДНК достигает плато , которое напрямую не коррелирует с количеством целевой ДНК в начальной ПЦР. [ 19 ]

ПЦР в реальном времени может использоваться для количественной оценки нуклеиновых кислот двумя общими методами: относительной количественной оценкой и абсолютной количественной оценкой. [ 20 ] Абсолютное количественное определение дает точное количество молекул ДНК -мишени в сравнении со стандартами ДНК с использованием калибровочной кривой . Поэтому важно, чтобы ПЦР образца и стандарта имел одинаковую эффективность усиления . [ 21 ] Относительная количественная оценка основана на внутренних эталонных генах для определения сгибающих дифференциаций в экспрессии целевого гена. Количественная оценка экспрессируется как изменение уровней экспрессии мРНК, интерпретируемой как комплементарная ДНК (кДНК, генерируемое обратной транскрипцией мРНК). Относительное количественное определение легче выполнить, поскольку она не требует калибровочной кривой, поскольку количество изученного гена сравнивается с количеством контрольного эталонного гена.

Поскольку подразделения, используемые для выражения результатов относительной количественной оценки, не важны, результаты можно сравнить по ряду различных RTQPCR. Причиной использования одного или нескольких генов домашнего хозяйства является исправление неспецифических вариаций, таких как различия в количестве и качеством используемой РНК, которые могут влиять на эффективность обратной транскрипции и, следовательно, на весь процесс ПЦР. Однако наиболее важным аспектом процесса является то, что эталонный ген должен быть стабильным. [ 22 ]

Отбор этих эталонных генов традиционно проводился в молекулярной биологии с использованием качественных или полуколичественных исследований, таких как визуальное исследование РНК-гелей, северная денситометрия или полуколичественная ПЦР (ПЦР-мимики). Теперь, в эпоху генома , можно провести более подробную оценку для многих организмов с использованием транскриптомных технологий . [ 23 ] Тем не менее, исследования показали, что амплификация большинства контрольных генов, используемых для количественной оценки экспрессии мРНК, варьируется в зависимости от экспериментальных условий. [ 24 ] [ 25 ] [ 26 ] Поэтому необходимо провести начальное статистически звукообое методологическое исследование, чтобы выбрать наиболее подходящий эталонный ген.

Был разработан ряд статистических алгоритмов, которые могут обнаружить, какие гены или гены наиболее подходят для использования в заданных условиях. Те, такие как Genorm или Bestkeeper, могут сравнивать пар или геометрические средства для матрицы различных эталонных генов и тканей . [ 4 ] [ 6 ]

Диагностическое использование

[ редактировать ]

Диагностическая качественная ПЦР применяется для быстрого обнаружения нуклеиновых кислот , которые являются диагностическими, например, инфекционными заболеваниями , [ 27 ] [ 28 ] Рак и генетические аномалии. Внедрение качественных анализов ПЦР в лабораторию клинической микробиологии значительно улучшило диагноз инфекционных заболеваний, [ 29 ] и используется как инструмент для обнаружения новых возникающих заболеваний, таких как новые штаммы гриппа и коронавируса , [ 30 ] в диагностических тестах . [ 31 ] [ 32 ]

Микробиологическое использование

[ редактировать ]

Количественная ПЦР также используется микробиологами, работающими в области безопасности пищевых продуктов, порчи и ферментации пищевых продуктов, а также для оценки качества воды в микробном риске (питьевые и развлекательные воды) и защиты общественного здравоохранения. [ 33 ]

QPCR также может использоваться для амплификации таксономических или функциональных маркеров генов в ДНК, взятых из образцов окружающей среды. [ 34 ] Маркеры представлены генетическими фрагментами ДНК или комплементарной ДНК. [ 34 ] Усиливая определенный генетический элемент, можно количественно оценить количество элемента в образце до усиления. [ 34 ] Использование таксономических маркеров (рибосомных генов) и QPCR могут помочь определить количество микроорганизмов в выборке и может идентифицировать различные семейства, роды или виды на основе специфичности маркера. [ 34 ] Использование функциональных маркеров (гены кодирования белка) может показать экспрессию генов в сообществе, что может выявить информацию об окружающей среде. [ 34 ]

Обнаружение фитопатогенов

[ редактировать ]

Сельскохозяйственная промышленность постоянно стремится производить пропагулы растений или саженцы, которые не имеют патогенных микроорганизмов, чтобы предотвратить экономические потери и защитить здоровье. Были разработаны системы, которые позволяют обнаружить небольшие количества ДНК Phytophthora ramorum , оомицета, который убивает дубы и другие виды, смешанные с ДНК растения -хозяина. Дискриминация между ДНК патогена и растения основана на усилении его последовательностей, проставки, расположенных в области кодирования рибосомного гена РНК, которые характерны для каждого таксона. [ 35 ] Полевые версии этой техники также были разработаны для выявления того же патогена. [ 36 ]

Обнаружение генетически модифицированных организмов

[ редактировать ]

КПЦР с использованием обратной транскрипции (RT-QPCR) может использоваться для обнаружения ГМО , учитывая его чувствительность и динамический диапазон в обнаружении ДНК. Альтернативы, такие как анализ ДНК или белка, обычно менее чувствительны. Используются специфические праймеры, которые усиливают не трансген, а промотор , терминатор или даже промежуточные последовательности, используемые в процессе разработки вектора. Поскольку процесс создания трансгенного растения обычно приводит к введению более одной копии трансгена, его количество также обычно оценивается. Это часто осуществляется путем относительной количественной оценки с использованием контрольного гена от обработанного вида, который присутствует только в виде одной копии. [ 37 ] [ 38 ]

Клиническая количественная оценка и генотипирование

[ редактировать ]

Вирусы могут присутствовать у людей из-за прямой инфекции или коинфекции, что затрудняет диагноз , используя классические методы и может привести к неправильному прогнозу и лечению. Использование КПЦР позволяет как количественно, так и генотипированию (характеристика штамма, выполняемой с использованием кривых плавления) вируса, такого как гепатита В. вирус [ 39 ] Степень инфекции, определяемая количественно как копии вирусного генома на единицу ткани пациента, является актуальной во многих случаях; Например, вероятность реактивации вируса простого герпеса типа 1 связана с количеством инфицированных нейронов в ганглиях . [ 40 ] Это количественное определение осуществляется либо с обратной транскрипцией, либо без нее, как это происходит, если вирус становится интегрированным в геном человека в любой точке его цикла, например, в случае ВПЧ (папилломавирус человека), где некоторые из его вариантов связан с появлением рака шейки матки . [ 41 ] ПЦР в реальном времени также привела к квантованию цитомегаловируса человека (CMV), который наблюдается у пациентов, которые иммунодепрессированы после трансплантации твердого органа или костного мозга. [ 42 ]

Ссылки

[ редактировать ]
  1. ^ Jump up to: а беременный Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, Mueller R, Nolan T, Pfaffl MW, Shipley GL, Vandesompele J, Wittwer CT (2009). «Руководящие принципы MIQE: минимальная информация для публикации количественных экспериментов в ПЦР в реальном времени» . Клиническая химия . 55 (4): 611–622. doi : 10.1373/clinchem.2008.112797 . PMID   19246619 .
  2. ^ Логан, Джули; Эдвардс, Кирстин и Сондерс, Ник, ред. (2009). ПЦР в реальном времени: текущие технологии и приложения . Caister Academic Press. ISBN  978-1-904455-39-4 .
  3. ^ Уотсон, JD; Бейкер, Та; Белл, sp; Ганн, а; Левин, м; Losick, R (2004). Молекулярная биология гена (пятое изд.). Сан -Франциско: Бенджамин Каммингс. ISBN  978-0-321-22368-5 .
  4. ^ Jump up to: а беременный в Pfaffl, MW; Тихопад, а; Prgomet, c; Neuvians, TP (март 2004 г.). «Определение стабильных генов домашнего хозяйства, дифференциально регулируемых генов-мишеней и целостности образца: инструмент Bestkeeper-Excel с использованием парных корреляций». Биотехнологические письма . 26 (6): 509–15. doi : 10.1023/b: bile.0000019559.84305.47 . PMID   15127793 . S2CID   977404 .
  5. ^ Pfaffl, MW; Хорган, GW; Dempfle, L (2002). «Инструмент программного обеспечения относительного экспрессии (REST ©) для группового сравнения и статистического анализа относительного выражения приводит к ПЦР в реальном времени» . Нуклеиновые кислоты Res . 30 (9): E36. doi : 10.1093/nar/30.9.e36 . PMC   113859 . PMID   11972351 .
  6. ^ Jump up to: а беременный Vandesompele, J; De Preter, k; Паттин, Ф; Poppe, B; Ван Рой, н; Де Папе, а; Speleman, F (2002). «Точная нормализация количественных данных ОТ-ПЦР в реальном времени путем геометрического усреднения нескольких генов внутреннего контроля» . Биология генома . 3 (7): 1–12. doi : 10.1186/gb-2002-3-7-research0034 . PMC   126239 . PMID   12184808 .
  7. ^ Rychlik W, Spencer WJ, Rhoads RE (1990). «Оптимизация температуры отжига для амплификации ДНК in vitro » . Нуклеиновые кислоты Res . 18 (21): 6409–6412. doi : 10.1093/nar/18.21.6409 . PMC   332522 . PMID   2243783 .
  8. ^ Pfaffl, Michael (2000). «Разработка и проверка внешне стандартизированной количественной инсулиноподобной RT-PCR Factor-1 с использованием технологии LightCycler Sybr Green I» (PDF) . Biochemica (3)-через gene-quantification.org.
  9. ^ Самбрук, Джозеф; Рассел, Дэвид В. (2001). Молекулярное клонирование: лабораторное руководство (3 -е изд.). Cold Spring Harbour, NY: Laboratory Press Cold Spring Harbour. ISBN  978-0-87969-576-7 .
  10. ^ Пончель F; Toomes C; Брансфилд К; Леонг Форт; Дуглас Ш; Поле SL; Белл С.М.; Комбарет V; Puisieux a; Mighell AJ (2003). «ПЦР в реальном времени на основе флуоресценции Sybr-Green I: альтернатива анализу Taqman для относительной количественной оценки перестройки генов, амплификаций генов и делеций микро генов» . BMC Biotechnol . 3 : 18. doi : 10.1186/1472-6750-3-18 . PMC   270040 . PMID   14552656 .
  11. ^ Рири К.М.; Расмуссен RP; Wittwer CT (1997). «Дифференциация продукта путем анализа кривых плавления ДНК во время полимеразной цепной реакции» (PDF) . Аналитическая биохимия . 245 (2): 154–160. doi : 10.1006/abio.1996.9916 . PMID   9056205 .
  12. ^ Jump up to: а беременный в Карр, AC; Мур, SD (2012). Люсия, Алехандро (ред.). «Надежная количественная оценка полимеразной цепной реакции с использованием глобальной подгонки» . Plos один . 7 (5): E37640. BIBCODE : 2012PLOSO ... 737640C . doi : 10.1371/journal.pone.0037640 . PMC   3365123 . PMID   22701526 .
  13. ^ Schefe JH, Lehmann KE, Buschmann IR, Unger T, Funke-Kaiser H (2006). «Количественный анализ данных RT-PCR в реальном времени: текущие концепции и новая формула« Разница в экспрессии гена ». J Mol Med . 84 (11): 901–910. doi : 10.1007/s00109-006-0097-6 . PMID   16972087 . S2CID   10427299 .
  14. ^ Nailis H, Coenye T, Van Nieuwerburgh F, Deforce D, Nelis HJ (2006). «Разработка и оценка различных стратегий нормализации для исследований экспрессии генов в биопленках Candida Albicans с помощью ПЦР в реальном времени» . BMC Mol. Биол . 7 (1): 25. doi : 10.1186/1471-2199-7-25 . PMC   1557526 . PMID   16889665 .
  15. ^ Нолан Т., Руки Р. Р., Байн С.А. (2006). «Количественная оценка мРНК с использованием RT-PCR в реальном времени». НАТ Проток . 1 (3): 1559–1582. doi : 10.1038/nprot.2006.236 . PMID   17406449 . S2CID   10108148 .
  16. ^ Boggy G, Woolf PJ (2010). Раваси Т (ред.). «Механистическая модель ПЦР для точной количественной оценки количественных данных ПЦР» . Plos один . 5 (8): E12355. BIBCODE : 2010PLOSO ... 512355B . doi : 10.1371/journal.pone.0012355 . PMC   2930010 . PMID   20814578 .
  17. ^ Ruijter JM, Pfaffl MW, Zhao S, Spiess AN, Boggy G, Blom J, Rutledge RG, Sisti D, Lievens A, De Preter K, Derveaux S, Hellemans J, Vandesompele J (2012). «Оценка методов анализа кривой КПЦР для надежного обнаружения биомаркеров: смещение, разрешение, точность и последствия». Методы ​ 59 (1): 32–46. doi : 10.1016/j.ymeth.2012.08.011 . PMID   22975077 .
  18. ^ Брюс Гелертер. «PEMF для лечения расстройств роговицы» . Lemuriatechnologies.com . Архивировано из оригинала 2014-06-09.
  19. ^ Overbergh, L.; Giulietti, A.; Valckx, D.; Decallonne, R.; Bouillon, R.; Матье, С. (2003). «Использование ПЦР обратной транскриптазы в реальном времени для количественной оценки экспрессии гена цитокина» . Журнал биомолекулярных методов . 14 (1): 33–43. PMC   2279895 . PMID   12901609 .
  20. ^ С. Дханасекаран; Т. Марк Доэрти; Джон Кеннет; Исследовательская группа TB (март 2010 г.). «Сравнение различных стандартов для абсолютной количественной оценки на основе ПЦР в реальном времени». Журнал иммунологических методов . 354 (1–2): 34–39. doi : 10.1016/j.jim.2010.01.004 . PMID   20109462 .
  21. ^ Бар, Цачи; Кубиста, Микаэль; Thichopad, Ales (2011-10-19). «Валидация сходства кинетики в КПЦР» . Исследование нуклеиновых кислот . 40 (4): 1395–1406. doi : 10.1093/nar/gkr778 . ISSN   0305-1048 . PMC   3287174 . PMID   22013160 .
  22. ^ Бруннер, Ам; Яковлев, ИА; Штраус, SH (2004). «Проверка внутренних контролей для количественных исследований экспрессии генов растений» . BMC Plant Biol . 4 : 14. doi : 10.1186/1471-2229-4-14 . PMC   515301 . PMID   15317655 .
  23. ^ McGettigan, Paul A (2013). «Транскриптомика в эпоху РНК-seq». Современное мнение о химической биологии . 17 (1): 4–11. doi : 10.1016/j.cbpa.2012.12.008 . PMID   23290152 .
  24. ^ Thellin, O; Зорзи, w; Лакай, б; De Borman, B; Куманы, б; Henne, G; Грисар, т; Igout, a; Heinen, E (1999). «Гены домашнего хозяйства как внутренние стандарты: использование и ограничения» . J Biotechnol . 75 (2–3): 197–200. doi : 10.1016/s0168-1656 (99) 00163-7 . HDL : 2268/3661 . PMID   10617337 .
  25. ^ Радон, а; Thulke, S; Маккей, IM; Ландт, о; Siegert, W; Nitsche, A (2004). «Руководство для справочного выбора генов для количественной ПЦР в реальном времени» . Biochem Biophys Res Commun . 313 (4): 856–862. doi : 10.1016/j.bbrc.2003.11.177 . PMID   14706621 . Архивировано из оригинала 2013-08-02.
  26. ^ Dheda, k; Huggett, JF; Бурюн, СА; Джонсон, Массачусетс; Rook, G; Zumla, A (2004). «Проверка генов домашнего хозяйства для нормализации экспрессии РНК в ПЦР в реальном времени» . Биотехники . 37 (1): 112–119. doi : 10.2144/04371rr03 . PMID   15283208 .
  27. ^ Джаверт, Николь (27 марта 2020 года). «Как вирус Covid-19 обнаруживается с использованием обратной транскрипционной цепной реакции в реальном времени?» Полем Международное агентство по атомной энергии . Получено 16 февраля 2023 года .
  28. ^ Сю, Лешан; Биндер, Ракель А.; Аларджа, Натали А.; Кошек, Кара; Коулман, Кристен К.; Чем, сын Т.; Бейли, Эмили С.; Bui, Vuong N.; Toh, Teck-Hock; Эрдман, Дин Д.; Грей, Грегори С. (июль 2020 г.). «Анализ RT-PCR для обнаружения коронавирусов из четырех родов» . Журнал клинической вирусологии . 128 : 104391. DOI : 10.1016/j.jcv.2020.104391 . PMC   7192118 . PMID   32403008 .
  29. ^ Espy, MJ (январь 2006 г.). «ПЦР в реальном времени в клинической микробиологии: приложения для обычных лабораторных испытаний» . Клинические обзоры микробиологии . 19 (3): 165–256. doi : 10.1128/cmr.19.1.165-256.2006 . PMC   1360278 . PMID   16418529 .
  30. ^ Дхамад, аэ; Абдал Рида, Массачусетс (2020). «Covid-19: методы молекулярного и серологического обнаружения» . ПЕРЕЙ . 8 : E10180. doi : 10.7717/peerj.10180 . PMC   7547594 . PMID   33083156 .
  31. ^ «Анализы RT-PCR с FDA и другие молекулярные анализы на вирусы гриппа» (PDF) . CDC.gov .
  32. ^ «RRT-PCR, метод подтверждения случая Wuhan Coronavirus-искусственный интеллект для химии» . 24 января 2020 года . Получено 2020-01-26 .
  33. ^ Филион, м, изд. (2012). Количественная ПЦР в реальном времени в прикладной микробиологии . Caister Academic Press . ISBN  978-1-908230-01-0 .
  34. ^ Jump up to: а беременный в дюймовый и Bouchez, Blieux, Dequiedt, Domaizon, Dufresne, Ferreira, Godon, Hellal, Joulian, Quaiser, Martin-Laurent, Mauffret, Monier, Peyret, Schmitt-Koplin, Sibourg, D'Oron, Bispo, Deportes, Grad, Cuny, Maron,, Maron,, Maron,, Maron,, Maron,, Maron,, Maron,, Maron,, Maron,, Maron,, Maron,, Maron,, Maron,, Maron,, Maron,, Maron, Maron, Maron, Maron,, Maron,, Maron, Maron, Maron, Maron, Maron, Maron, Maron, Maron, Ранджард (сентябрь 2016 г.). «Методы молекулярной микробиологии для диагностики окружающей среды» . Письма о экологической химии . 14 (4): 423–441. Doi : 10,1007/S10311-016-0581-3 . S2CID   88827291 . Получено 11 мая 2020 года . {{cite journal}}: Cs1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  35. ^ Болдуин, Б.Г. (1992). «Филогенетическая полезность внутренних транскрибированных проставок ядерной рибосомной ДНК в растениях: пример из композитаогии». Молекулярная филогенетика и эволюция . 1 (1): 3–16. doi : 10.1016/1055-7903 (92) 90030-K . PMID   1342921 .
  36. ^ Томлинсон, JA; Баркер, я; Boonham, N. (2007). «Более быстрые, более простые, более специфические методы улучшения молекулярного обнаружения Phytophthora ramorum в поле» . Прикладная и экологическая микробиология . 73 (12): 4040–4047. Bibcode : 2007apenm..73.4040t . doi : 10.1128/aem.00161-07 . PMC   1932743 . PMID   17449689 .
  37. ^ Холст-Дженсен, Арне; Rønning, Sissel B.; Løvseth, Astrid; Бердал, Кнут Г. (2003). «Технология ПЦР для скрининга и количественной оценки генетически модифицированных организмов (ГМО)». Аналитическая и биоаналитическая химия . 375 (8): 985–993. doi : 10.1007/s00216-003-1767-7 . PMID   12733008 . S2CID   43681211 .
  38. ^ Brodmann PD; Ilg ec; Berthoud H; Херрманн А. (2002). «… -Кородовая количественная полимеразная цепная реакция для четырех генетически модифицированных сортов кукурузы…» . Журнал AOAC International . 85 (3): 646–653. doi : 10.1093/jaoac/85.3.646 . PMID   12083257 .
  39. ^ Yeh sh tsai cy kao jh liu cj kuo tj lin mw huang wl lu sf jih jih jh chen ds dis (2004). «Количественная оценка и генотипирование вируса гепатита В в одной реакции с ПЦР в реальном времени и плавлении…». Журнал гепатологии . 41 (4): 659–666. doi : 10.1016/j.jhep.2004.06.031 . PMID   15464248 .
  40. ^ Sawtell NM (1998). «Вероятность реактивации in vivo вируса простого герпеса типа 1 увеличивается с количеством латентно инфицированных нейронов в ганглиях» . Журнал вирусологии . 72 (8): 6888–6892. doi : 10.1128/JVI.72.8.6888-6892.1998 . PMC   109900 . PMID   9658140 .
  41. ^ Питер М. Рости С. Кутюрье Дж. Радвани Ф. Тешима Х. Састре-Гарау Х. (2006). «Активация MYC, связанная с интеграцией ДНК ВПЧ в локусе MYC в генитальных опухолях» . Онкоген . 25 (44): 5985–5993. doi : 10.1038/sj.onc.1209625 . PMID   16682952 .
  42. ^ Маккей, Ян М.; Арден, Кэтрин Э.; Nitsche, Andreas (2002-03-15). «ПЦР в реальном времени в вирусологии» . Исследование нуклеиновых кислот . 30 (6): 1292–1305. doi : 10.1093/nar/30.6.1292 . ISSN   0305-1048 . PMC   101343 . PMID   11884626 .

Библиография

[ редактировать ]
Retrieved from "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Real-time_polymerase_chain_reaction&oldid=1234060549"
Arc.Ask3.Ru: конец переведенного документа.
Arc.Ask3.Ru
Номер скриншота №: cfe7807afa41707a8458d2006ffaa658__1720771740
URL1:https://arc.ask3.ru/arc/aa/cf/58/cfe7807afa41707a8458d2006ffaa658.html
Заголовок, (Title) документа по адресу, URL1:
Real-time polymerase chain reaction - Wikipedia
Данный printscreen веб страницы (снимок веб страницы, скриншот веб страницы), визуально-программная копия документа расположенного по адресу URL1 и сохраненная в файл, имеет: квалифицированную, усовершенствованную (подтверждены: метки времени, валидность сертификата), открепленную ЭЦП (приложена к данному файлу), что может быть использовано для подтверждения содержания и факта существования документа в этот момент времени. Права на данный скриншот принадлежат администрации Ask3.ru, использование в качестве доказательства только с письменного разрешения правообладателя скриншота. Администрация Ask3.ru не несет ответственности за информацию размещенную на данном скриншоте. Права на прочие зарегистрированные элементы любого права, изображенные на снимках принадлежат их владельцам. Качество перевода предоставляется как есть. Любые претензии, иски не могут быть предъявлены. Если вы не согласны с любым пунктом перечисленным выше, вы не можете использовать данный сайт и информация размещенную на нем (сайте/странице), немедленно покиньте данный сайт. В случае нарушения любого пункта перечисленного выше, штраф 55! (Пятьдесят пять факториал, Денежную единицу (имеющую самостоятельную стоимость) можете выбрать самостоятельно, выплаичвается товарами в течение 7 дней с момента нарушения.)