Слитый белок

Слитые белки или химерные (Kī-ˈmir-ik) белки (буквально, изготовленные из частей из разных источников)-это белки, созданные посредством соединения двух или более генов , которые первоначально кодировали для отдельных белков. Трансляция этого гена слияния приводит к одному или нескольким полипептидам с функциональными свойствами, полученными из каждого из исходных белков. Рекомбинантные слитые белки создаются искусственно с помощью рекомбинантной технологии ДНК для использования в биологических исследованиях или терапии . Химерная или химера обычно обозначают гибридные белки, изготовленные из полипептидов, имеющих различные функции или физико-химические паттерны. Химерные мутантные белки встречаются естественным образом, когда сложная мутация , такая как хромосомная транслокация , тандемная дупликация или ретротранспозиция, создает новую кодирующую последовательность, содержащую части кодирующих последовательностей из двух разных генов. Природные слитые белки обычно встречаются в раковых клетках, где они могут функционировать как онкопротеины . Слитый белок BCR -ABL является хорошо известным примером онкогенного слитого белка и считается основным онкогенным фактором хронической мигогенной лейкозы .

Функции

Некоторые слитые белки объединяют целые пептиды и, следовательно, содержат все функциональные домены исходных белков. Тем не менее, другие слитые белки, особенно те, которые встречаются естественным образом, объединяют только части кодирующих последовательностей и, следовательно, не поддерживают исходные функции родительских генов, которые их образовали.

Многие слияния целых генов являются полностью функциональными и все еще могут заменить исходные пептиды. Некоторые, однако, испытывают взаимодействия между двумя белками, которые могут изменить их функции. Помимо этих эффектов, некоторые слияния генов могут вызвать регуляторные изменения , которые изменяются, когда и где эти гены действуют. Для частичных слияний генов перетасовка различных активных сайтов и доменов связывания может привести к новым белкам с новыми функциями.

Зеленый флуоресцентный белок (GFP), вставленные в нейроны *червей Caenorhabditis elegans* для отслеживания развития нейронов

Флуоресцентные белковые метки

Слияние флуоресцентных тегов с белками в клетке -хозяине является широко популярным методом, используемым в исследованиях экспериментальных клеток и биологии для отслеживания взаимодействий белка в режиме реального времени. Первая флуоресцентная метка, зеленый флуоресцентный белок (GFP), была выделена из Aequorea Victoria и до сих пор часто используется в современных исследованиях. Более поздние производные включают фотоконвертируемые флуоресцентные белки (PCFPS), которые были сначала выделены из Anthozoa . Наиболее часто используемым PCFP является флуоресцентная тега Kaede , но развитие Kikume Green-Red (Kikgr) в 2005 году обеспечивает более яркий сигнал и более эффективную фотоконверсию. Преимущество использования флуоресцентных тегов PCFP - это возможность отслеживать взаимодействие перекрывающихся биохимических путей в режиме реального времени. Тэг изменит цвет от зеленого на красный, как только белок достигнет точки интереса к пути, а альтернативный цветный белок можно контролировать на протяжении всей пути. Этот метод особенно полезен при изучении G-белок, связанный с рецептором (GPCR), пути рециркуляции. Судьбы переработанных рецепторов G-белка могут быть отправлены либо в плазматическую мембрану для переработки, отмеченной зеленой флуоресцентной меткой, либо могут быть отправлены в лизосому для деградации, отмеченной красной флуоресцентной меткой. ^{[ 1 ]}

Химерные белковые препараты

Целью создания слитых белков в разработке лекарств является передача свойств из каждого из «родительских» белков к полученному химерному белку. Несколько химерных белковых препаратов в настоящее время доступны для медицинского использования.

Многие химерные белковые препараты представляют собой моноклональные антитела , специфичность которых была разработана для целевой молекулы с использованием мышей и, следовательно, первоначально была «мыши». Как нечеловеческие белки, мышиные антитела, как правило, вызывают иммунную реакцию, если вводится людям. Процесс химеризации включает в себя разработку замены сегментов молекулы антител, которые отличают ее от человеческого антитела. Например, могут быть введены постоянные домены человека , тем самым устраняя большинство потенциально иммуногенных частей лекарственного средства без изменения его специфичности для предполагаемой терапевтической цели. Номенклатура антитела указывает на этот тип модификации, вставляя -x-- в непотенционное имя (например, abci -xi -mab ). Если части переменных доменов также заменяются человеческими частями, гуманизированные получаются антитела. Хотя этот тип не концептуально отличается от химеров, указан с использованием -zu-, например, в dacli -zu -mab . См. Список моноклональных антител для получения дополнительных примеров.

В дополнение к химерным и гуманизированным антителам, существуют другие фармацевтические цели для создания химерных конструкций. этанерцепт Например, представляет собой блокатор TNFα, созданный посредством комбинации рецептора фактора некроза опухоли (TNFR) с иммуноглобулина G 1 сегментом . Считается, что TNFR обеспечивает специфичность для лекарственной цели, а сегмент ФК антитела добавляет стабильность и доставку препарата. ^{[ 2 ]} Дополнительные химерные белки, используемые для терапевтических применений, включают:

Aflibercept : человеческий рекомбинантный белок, который помогает в лечении оксалиплатина-резистентного метастатического колоректального рака , неососудистых макулярных дегенераций и отека желтого пятна . ^{[ 2 ]}
Рилонацепт : уменьшает воспаление за счет предотвращения активации рецепторов IL-1 для лечения периодических синдромов, связанных с криопирином (CAPS). ^{[ 2 ]}
Alefacept : регулируемые Т-клеточные ответы путем избирательного нацеливания на Т-клетки эффекторной памяти для лечения псориаза vulgaris . ^{[ 2 ]}
Ромиплостим : пептибитное, которое лечит иммунную тромбоцитопению . ^{[ 2 ]}
Абатацепт / Белатацепт : мешает костимуляции Т-клеток для лечения аутоиммунных расстройств, таких как ревматоидный артрит , псориатический артрит и псориаз . ^{[ 2 ]}
Denileukin-Diftitox : обрабатывает кожную лимфому . ^{[ 2 ]}

Рекомбинантная технология

Слияние двух генов (BCR-ABL) для кодирования рекомбинантного онкогенного белка

Рекомбинантный слитый белок - это белок, созданный посредством генетической инженерии гена слияния. Обычно это включает в себя удаление стоп -кодона из последовательности кДНК, кодирующей для первого белка, а затем добавление последовательности кДНК второго белка в кадре посредством ПЦР для лигирования или перекрытия . будет затем экспрессироваться клеткой Эта последовательность ДНК в виде единого белка. Белок может быть спроектирован, чтобы включить полную последовательность обоих оригинальных белков или только часть любого.

Если эти две сущности являются белками, часто добавляются пептиды линкера (или «спейсер»), что повышает вероятность того, что белки складываются независимо и ведут себя как ожидалось. Особенно в случае, когда линкеры обеспечивают очистку белка , линкеры в белковых или пептидных слияниях иногда сконструированы с сайтами расщепления для протеаз или химических агентов, которые позволяют освободить двух отдельных белков. Этот метод часто используется для идентификации и очистки белков, путем объединения белка GST , флагского пептида или пептида Hexa-His (6xhis-tag), который может быть выделен с использованием аффинной хроматографии с никельными или кобальтами. Ди- или мультимерные химерные белки могут быть изготовлены с помощью генетической инженерии путем слияния с исходными белками пептидных доменов, которые индуцируют искусственный белок ди- или мультимеризацию (например, стрептавидин или лейциновые молнии ). Слитые белки также могут быть изготовлены с прикрепленными к ним токсинами или антителами для изучения развития заболевания. Гидрогеназа промотор, с _SH , изучали построение слияния PH _SH -промотора GFP с использованием зеленого флуоресцентного белка ( GFP) репортерного гена . ^{[ 3 ]}

Рекомбинантная функциональность

Новые рекомбинантные технологии позволили улучшить конструкцию слитого белка для использования в таких разнообразных областях, как биодинг, бумажная и пищевая промышленность, а также биофармацевтические препараты. Недавние улучшения включали слияние отдельных пептидов или фрагментов белка с областями существующих белков, таких как N и C -термина , и, как известно, увеличивают следующие свойства: ^{[ 4 ]}

Каталитическая эффективность : слияние определенных пептидов обеспечивает большую каталитическую эффективность путем изменения третичной и четвертичной структуры белка -мишени. ^{[ 4 ]}
Растворимость . Общая задача в конструкции слитого белка-это проблема нерастворимости вновь синтезированных слитых белков у рекомбинантного хозяина, что приводит к чрезмерной агрегации целевого белка в клетке. Молекулярные шапероны , способные помочь в складывании белка, могут быть добавлены, тем самым лучше сегрегировать гидрофобные и гидрофильные взаимодействия в растворенном веществе для увеличения растворимости белка. ^{[ 4 ]}
Термостабильность : обычно добавляются единственные пептиды или белковые фрагменты, чтобы снизить гибкость либо N или C -конца белка -мишени, который усиливает термостабильность и стабилизирует диапазон pH . ^{[ 4 ]}
Активность фермента: слияние, включающее введение водородных связей , может использоваться для расширения общей активности ферментов. ^{[ 4 ]}
Уровни экспрессии: добавление многочисленных фьюжн-фрагментов, таких как белок, связывающий мальтозу (MBP) или небольшая убиквитиноподобная молекула ( SUMO ), служат для повышения экспрессии фермента и секреции целевого белка. ^{[ 4 ]}
Иммобилизация: PHA Synthase, фермент, который позволяет иммобилизации интересующих белков, является важной тегом слияния в промышленных исследованиях. ^{[ 4 ]}
Качество кристалла: качество кристалла может быть улучшено, добавив ковалентные связи между белками, помогая в методах определения структуры. ^{[ 4 ]}

Рекомбинантный белок дизайн

Самое раннее применение конструкции рекомбинантного белка может быть задокументировано при использовании отдельных пептидных метков для очистки белков в аффинной хроматографии . С тех пор были разработаны различные методы проектирования слитого белка для таких разнообразных применений, как флуоресцентные белковые метки для рекомбинантных препаратов слитого белка. Три часто используемые методы проектирования включают тандемное слияние, вставку домена и посттрансляционное сопряжение. ^{[ 5 ]}

Тандем слияния

Белки, представляющие интерес, просто связаны с сквозным слиянием путем слияния N или C терминами между белками. Это обеспечивает гибкую структуру моста, позволяющую достаточно места между партнерами Fusion, чтобы обеспечить правильное складывание . Тем не менее, N или C-концерты пептида часто являются важными компонентами при получении желаемой схемы складывания для рекомбинантного белка, что делает простое соединение доменов неэффективным в этом случае. По этой причине белковый линкер часто необходим для поддержания функциональности интересующих доменов белков. ^{[ 5 ]}

Доменная вставка

Этот метод включает в себя слияние последовательных белковых доменов путем кодирования желаемых структур в одну полипептидную цепь, но иногда может потребовать введения домена в другой домен. Этот метод, как правило, относится к тому, чтобы выполнить более трудную, чем тандемное слияние, из -за трудностей с поиском подходящего сайта лигирования в интересующем генке. ^{[ 5 ]}

Посттрансляционное сопряжение

Этот метод объединяет белковые домены после рибосомальной трансляции интересующих белков, в отличие от генетического слияния перед трансляцией, используемой в других рекомбинантных технологиях. ^{[ 5 ]}

Белковые линкеры

Белковые линкеры помогают конструкции слитого белка, обеспечивая соответствующее расстояние между доменами, поддерживая правильное складывание белка в том случае, когда взаимодействие N или C термини имеет решающее значение для складывания. Обычно белковые линкеры позволяют важным доменным взаимодействиям, укрепляют стабильность и уменьшают стерические помехи, что делает их предпочтительными для использования в конструкции слияния белка, даже если N и C термины могут быть объединены. Три основных типа линкеров являются гибкими, жесткими и in vivo расщеплены. ^{[ 5 ]}^{[ 6 ]}

Гибкие линкеры могут состоять из многих небольших остатков глицина , что дает им способность скручиваться в динамическую, адаптируемую форму. ^{[ 6 ]}
Жесткие линкеры могут быть сформированы из больших циклических остатков пролина , которые могут быть полезны, когда необходимо поддерживать очень специфический интервал между доменами. ^{[ 6 ]}
in vivo Расщепные линкеры уникальны тем, что они предназначены для того, чтобы разрешить высвобождение одного или нескольких слитых доменов в определенных условиях реакции, таких как специфический градиент рН , или при контакте с другой биомолекулой в клетке. ^{[ 6 ]}

Естественное явление

Природные гены слияния чаще всего создаются, когда хромосомная транслокация заменяет терминальные экзоны одного гена неповрежденными экзонами из второго гена. Это создает один ген, который может быть транскрибирован , сплайсирован и переводится для получения функционального слитого белка. Многие важные раковые онкогены -это гены слияния , продуцируемые таким образом.

Примеры включают:

Антитела представляют собой слитые белки, продуцируемые рекомбинацией V (D) J.

Существуют также редкие примеры природных полипептидов, которые, по -видимому, представляют собой слияние двух четко определенных модулей, в которых каждый модуль отображает свою характерную активность или функцию, независимо от другого. Два основных примера: двойная химера PP2C в Plasmodium falciparum (малярия паразит), в котором каждый модуль PP2C проявляет ферментативную активность белковой фосфатазы 2C, ^{[ 7 ]} и двойные иммунофилины , которые встречаются в ряде одноклеточных организмов (таких как простейшие паразиты и флавобактерии ) и содержат полноразмерные циклофилина и паперона FKBP . модули ^{[ 8 ]}^{[ 9 ]} Эволюционное происхождение такой химеры остается неясным.

Смотрите также

Ссылки

^ Schmidt A, Wiesner B, Schülein R, Teichmann A (2014). «Использование Kaede и Kikume Green-Red слияния для визуализации живых клеток рецепторов, связанных с G-белком». Экзоцитоз и эндоцитоз . Методы в молекулярной биологии. Тол. 1174. Нью -Йорк, Нью -Йорк: Humana Press. С. 139–156. doi : 10.1007/978-1-4939-0944-5_9 . ISBN 9781493909438 Полем PMID 24947379 .
^ Jump up to: ^а ^{беременный} ^в ^{дюймовый} ^и ^фон ^глин Балдо Ба (май 2015 г.). «Химерные слитые белки, используемые для терапии: показания, механизмы и безопасность». Безопасность лекарств . 38 (5): 455–79. doi : 10.1007/s40264-015-0285-9 . PMID 25832756 . S2CID 23852865 .
^ Jugder BE, Welch J, Braidy N, Marquis CP (2016-07-26). «Строительство и использование слияния Cupriavidus necator H16 растворимого гидрогеназы (PSH) с GFP (зеленый флуоресцентный белок)» . ПЕРЕЙ . 4 : E2269. doi : 10.7717/peerj.2269 . PMC 4974937 . PMID 27547572 .
^ Jump up to: ^а ^{беременный} ^в ^{дюймовый} ^и ^фон ^глин ^час Ян Х, Лю Л, Сюй Ф. (октябрь 2016 г.). «Обещания и проблемы слияния конструкций в биохимии белка и фермере». Прикладная микробиология и биотехнология . 100 (19): 8273–81. doi : 10.1007/s00253-016-7795-y . PMID 27541749 . S2CID 14316893 .
^ Jump up to: ^а ^{беременный} ^в ^{дюймовый} ^и Ю. К., Лю С, Ким Б.Г., Ли Дай (2015-01-01). «Синтетический слитый белок и применение». Биотехнологические достижения . 33 (1): 155–164. doi : 10.1016/j.biotechadv.2014.11.005 . PMID 25450191 .
^ Jump up to: ^а ^{беременный} ^в ^{дюймовый} Chen X, Zaro JL, Shen WC (октябрь 2013 г.). «Линкеры белка слияния: свойство, дизайн и функциональность» . Расширенные обзоры доставки наркотиков . 65 (10): 1357–69. doi : 10.1016/j.addr.2012.09.039 . PMC 3726540 . PMID 23026637 .
^ Mamoun CB, Sullivan DJ, Banerjee R, Goldberg DE (май 1998). «Идентификация и характеристика необычной двойной сериновой/треониновой белкопофосфатазы 2C в малярийном паразите Plasmodium falciparum» . Журнал биологической химии . 273 (18): 11241–7. doi : 10.1074/jbc.273.18.11241 . PMID 9556615 .
^ Адамс Б., Мусиенко А., Кумар Р., Барик С. (июль 2005 г.). «Новый класс иммунофилинов двойной семьи» . Журнал биологической химии . 280 (26): 24308–14. doi : 10.1074/jbc.m500990200 . PMC 2270415 . PMID 15845546 .
^ Барик С (ноябрь 2017). «О роли, экологии, филогении и структуре иммунофилинов с двойной семьей» . Клеточный стресс и шапероны . 22 (6): 833–845. doi : 10.1007/s12192-017-0813-x . PMC 5655371 . PMID 28567569 .

Внешние ссылки

Библиотечные ресурсы о
Слитый белок

Мутант+химерные+белки в Национальной медицинской библиотеке Медицинской библиотеки США (Mesh)
Chippi Archived 2021-11-10 на машине Wayback : взаимодействие белка-белка-белка химерных белков.

[1] Schmidt A, Wiesner B, Schülein R, Teichmann A (2014). «Использование Kaede и Kikume Green-Red слияния для визуализации живых клеток рецепторов, связанных с G-белком». Экзоцитоз и эндоцитоз . Методы в молекулярной биологии. Тол. 1174. Нью -Йорк, Нью -Йорк: Humana Press. С. 139–156. doi : 10.1007/978-1-4939-0944-5_9 . ISBN 9781493909438 Полем PMID 24947379 .

[:0-2] Jump up to: ^а ^{беременный} ^в ^{дюймовый} ^и ^фон ^глин Балдо Ба (май 2015 г.). «Химерные слитые белки, используемые для терапии: показания, механизмы и безопасность». Безопасность лекарств . 38 (5): 455–79. doi : 10.1007/s40264-015-0285-9 . PMID 25832756 . S2CID 23852865 .

[3] Jugder BE, Welch J, Braidy N, Marquis CP (2016-07-26). «Строительство и использование слияния Cupriavidus necator H16 растворимого гидрогеназы (PSH) с GFP (зеленый флуоресцентный белок)» . ПЕРЕЙ . 4 : E2269. doi : 10.7717/peerj.2269 . PMC 4974937 . PMID 27547572 .

[:1-4] Jump up to: ^а ^{беременный} ^в ^{дюймовый} ^и ^фон ^глин ^час Ян Х, Лю Л, Сюй Ф. (октябрь 2016 г.). «Обещания и проблемы слияния конструкций в биохимии белка и фермере». Прикладная микробиология и биотехнология . 100 (19): 8273–81. doi : 10.1007/s00253-016-7795-y . PMID 27541749 . S2CID 14316893 .

[:2-5] Jump up to: ^а ^{беременный} ^в ^{дюймовый} ^и Ю. К., Лю С, Ким Б.Г., Ли Дай (2015-01-01). «Синтетический слитый белок и применение». Биотехнологические достижения . 33 (1): 155–164. doi : 10.1016/j.biotechadv.2014.11.005 . PMID 25450191 .

[:3-6] Jump up to: ^а ^{беременный} ^в ^{дюймовый} Chen X, Zaro JL, Shen WC (октябрь 2013 г.). «Линкеры белка слияния: свойство, дизайн и функциональность» . Расширенные обзоры доставки наркотиков . 65 (10): 1357–69. doi : 10.1016/j.addr.2012.09.039 . PMC 3726540 . PMID 23026637 .

[7] Mamoun CB, Sullivan DJ, Banerjee R, Goldberg DE (май 1998). «Идентификация и характеристика необычной двойной сериновой/треониновой белкопофосфатазы 2C в малярийном паразите Plasmodium falciparum» . Журнал биологической химии . 273 (18): 11241–7. doi : 10.1074/jbc.273.18.11241 . PMID 9556615 .

[8] Адамс Б., Мусиенко А., Кумар Р., Барик С. (июль 2005 г.). «Новый класс иммунофилинов двойной семьи» . Журнал биологической химии . 280 (26): 24308–14. doi : 10.1074/jbc.m500990200 . PMC 2270415 . PMID 15845546 .

[9] Барик С (ноябрь 2017). «О роли, экологии, филогении и структуре иммунофилинов с двойной семьей» . Клеточный стресс и шапероны . 22 (6): 833–845. doi : 10.1007/s12192-017-0813-x . PMC 5655371 . PMID 28567569 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]