Космид

Космида представляет собой тип гибридной плазмиды , которая содержит фага лямбда последовательность cos . ^{[ 1 ]} Космиды, которые часто используются в качестве векторов клонирования в генной инженерии , могут быть использованы для создания геномных библиотек . Впервые они были описаны Коллинзом и Хоном в 1978 году. ^{[ 2 ]} Космиды могут содержать от 37 до 52 (обычно 45) т.п.н. ДНК, ограничения основаны на нормальном размере упаковки бактериофага. Они могут реплицироваться как плазмиды, если у них есть подходящий источник репликации (ori): например, SV40 ori в клетках млекопитающих, ColE1 ori для репликации двухцепочечной ДНК или f1 ori для репликации одноцепочечной ДНК у прокариот . Они часто также содержат ген селекции, такой как устойчивость к антибиотикам , так что трансформированные клетки можно идентифицировать путем посева на среду, содержащую антибиотик. Те клетки, которые не поглотили космиду, не смогли бы расти. ^{[ 3 ]}

В отличие от плазмид, их также можно упаковать in vitro в фаговые капсиды , для чего необходимы слипшиеся концы , также известные как сайты cos , которые также используются при клонировании с фагом лямбда в качестве вектора, однако почти все гены лямбда были удалены, за исключением из cos -последовательности. Гибридная космидная ДНК в капсидах затем может быть перенесена в бактериальные клетки путем трансдукции . Поскольку существует требование к упаковке in vitro, согласно которому между cos-сайтами требуется не менее 38 т.п.н. ДНК, вектор без вставки ДНК не будет упакован (нестабильность плазмиды увеличивается, если новая вставленная ДНК содержит много прямых повторов или палиндромных (инвертированных) повторов). повторы) ДНК. Этой нестабильности можно в значительной степени противодействовать, используя бактерию-хозяина со специфическими мутациями, влияющими на рекомбинацию ДНК (NB. Отсутствие инвертированных повторов было отмечено в первой публикации Hohn & Collins, цитированной выше; см. также). ^{[ 4 ]}).

Cos- последовательности

Последовательности Cos имеют длину около 200 пар оснований и необходимы для упаковки. Они содержат сайт cosN , где ДНК разрывается на каждой цепи на расстоянии 12 п.о. друг от друга терминазой . Это вызывает линеаризацию кольцевой космиды с двумя «слипшимися» или «липкими концами» по 12 пар оснований. (ДНК должна быть линейной, чтобы поместиться в головку фага.) Сайт cosB удерживает терминазу, пока она разрезает и разделяет цепи. Сайт cosQ следующей космиды (поскольку репликация по катящемуся кругу часто приводит к образованию линейных конкатемеров ) удерживается терминазой после того, как предыдущая космида была упакована, чтобы предотвратить деградацию клеточными ДНКазами .

Особенности и использование Cosmid

Космиды представляют собой преимущественно плазмиды с бактериальным oriV , маркером селекции антибиотика и сайтом клонирования, но они несут один, а в последнее время два сайта cos, полученные из бактериофага лямбда. В зависимости от конкретной цели эксперимента доступны космиды широкого круга хозяев, челночные космиды или космиды «млекопитающих» (связанные с SV40 oriV и маркерами селекции млекопитающих). Загрузочная способность космид варьируется в зависимости от размера самого вектора, но обычно составляет около 40–45 кб. Процедура клонирования включает создание двух векторных плеч, которые затем присоединяются к чужеродной ДНК. Отбор против космидной ДНК дикого типа просто осуществляется путем исключения размера. Таким образом, космиды всегда образуют колонии, а не бляшки. Кроме того, плотность клонов намного ниже — около 10 ⁵ – 10 ⁶ КОЕ на мкг лигированной ДНК.

После создания рекомбинантных лямбда-библиотек или космидных библиотек полную ДНК переносят в соответствующий хозяин E. coli с помощью метода, называемого упаковкой in vitro. Необходимые упаковочные экстракты получены из лизогенов E. coli cI857 (red-gam-Sam и Dam (головка) и Eam (хвост) соответственно). Эти экстракты распознают и упаковывают рекомбинантные молекулы in vitro , генерируя либо зрелые фаговые частицы (векторы на основе лямбда), либо рекомбинантные плазмиды, содержащиеся в фаговых оболочках (космиды). Эти различия отражаются в различной частоте заражения, наблюдаемой в пользу векторов лямбда-замены. Это компенсирует их немного меньшую грузоподъемность. Фаговые библиотеки также легче хранить и проверять, чем библиотеки космид.

Целевая ДНК: клонируемую геномную ДНК необходимо разрезать на фрагменты рестрикции соответствующего размера. Обычно это делается путем частичного ограничения с последующим фракционированием по размеру или дефосфорилированием (с использованием фосфатазы телячьего кишечника), чтобы избежать скремблирования хромосом, т.е. лигирования физически несвязанных фрагментов.

Примеры космидных векторов

Обычно используемые векторы включают «SuperCos 1».

Ссылки

^ Хон Б., Мюррей К. (август 1977 г.). «Упаковка молекул рекомбинантной ДНК в частицы бактериофага in vitro» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 74 (8): 3259–63. Бибкод : 1977PNAS...74.3259H . дои : 10.1073/pnas.74.8.3259 . ПМК 431522 . ПМИД 333431 .
^ Коллинз Дж., Хон Б. (сентябрь 1978 г.). «Космиды: тип вектора для клонирования плазмидных генов, который можно упаковывать in vitro в головки лямбда-бактериофагов» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 75 (9): 4242–6. Бибкод : 1978PNAS...75.4242C . дои : 10.1073/pnas.75.9.4242 . ПМК 336088 . ПМИД 360212 .
^ «Космиды» . Филипп МакКлин . Проверено 4 апреля 2014 г.
^ Коллинз Дж (1981). «Нестабильность палиндромной ДНК у Escherichia coli». Симпозиумы Колд-Спринг-Харбор по количественной биологии . 45 Пт 1: 409–16. дои : 10.1101/SQB.1981.045.01.055 . ПМИД 6271486 .

Дальнейшее чтение

Страйер, Люберт (1995) Биохимия, 4-е изд. ISBN 0-7167-2009-4
Коллекция бионаук «Эврика»: вирусы, @NCBI

[1] Хон Б., Мюррей К. (август 1977 г.). «Упаковка молекул рекомбинантной ДНК в частицы бактериофага in vitro» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 74 (8): 3259–63. Бибкод : 1977PNAS...74.3259H . дои : 10.1073/pnas.74.8.3259 . ПМК 431522 . ПМИД 333431 .

[2] Коллинз Дж., Хон Б. (сентябрь 1978 г.). «Космиды: тип вектора для клонирования плазмидных генов, который можно упаковывать in vitro в головки лямбда-бактериофагов» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 75 (9): 4242–6. Бибкод : 1978PNAS...75.4242C . дои : 10.1073/pnas.75.9.4242 . ПМК 336088 . ПМИД 360212 .

[3] «Космиды» . Филипп МакКлин . Проверено 4 апреля 2014 г.

[pmid6271486-4] Коллинз Дж (1981). «Нестабильность палиндромной ДНК у Escherichia coli». Симпозиумы Колд-Спринг-Харбор по количественной биологии . 45 Пт 1: 409–16. дои : 10.1101/SQB.1981.045.01.055 . ПМИД 6271486 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]