Jump to content

Криогенная электронная микроскопия

(Перенаправлено с Крио-ЭМ )
Титан Криос в Университете Лидса

Криогенная электронная микроскопия ( криоЭМ ) — это метод криомикроскопии, применяемый к образцам, охлажденным до криогенных температур. Для биологических образцов структура сохраняется путем помещения в среду стекловидного льда . Водный раствор образца наносится на сетку и замораживается погружением в жидкий этан или смесь жидкого этана и пропана . [ 1 ] Хотя разработка этого метода началась в 1970-х годах, последние достижения в области детекторных технологий и алгоритмов программного обеспечения позволили определять биомолекулярные структуры с разрешением, близким к атомному. [ 2 ] Это привлекло широкое внимание к этому подходу как альтернативе рентгеновской кристаллографии или ЯМР-спектроскопии для определения структуры макромолекул без необходимости кристаллизации. [ 3 ]

В 2017 году Нобелевская премия по химии была присуждена Жаку Дюбоше , Иоахиму Франку и Ричарду Хендерсону «за разработку криоэлектронной микроскопии для определения структуры биомолекул в растворе с высоким разрешением». [ 4 ] Компания Nature Methods также назвала крио-ЭМ «методом года» в 2015 году. [ 5 ]

Раннее развитие

[ редактировать ]

В 1960-е годы использование просвечивающей электронной микроскопии для определения структуры было ограничено из-за радиационного повреждения пучками электронов высокой энергии. Ученые предположили, что исследование образцов при низких температурах уменьшит радиационные повреждения, вызванные лучом. [ 6 ] И жидкий гелий (-269 ° C , или 4 K , или -452,2 ° F ), и жидкий азот (-195,79 ° C, или 77 K, или -320 ° F) считались криогенами. В 1980 году Эрвин Кнапек и Жак Дюбоше опубликовали комментарии о повреждении пучка при криогенных температурах, поделившись наблюдениями о том, что:

Было обнаружено, что тонкие кристаллы, закрепленные на углеродной пленке, в 30–300 раз более устойчивы к лучу при 4 К, чем при комнатной температуре... Большую часть наших результатов можно объяснить, предположив, что криозащита в области 4 К сильно зависит от температура. [ 7 ]

Однако эти результаты не удалось воспроизвести, и всего два года спустя в журнале Nature были опубликованы поправки , в которых сообщалось, что сопротивление луча было менее значительным, чем первоначально предполагалось. Защита, полученная при 4 К, была ближе к «десятикратной для стандартных образцов L- валина ». [ 8 ] чем было заявлено ранее.

В 1981 году Аласдер МакДауэлл и Жак Дюбоше, ученые из Европейской лаборатории молекулярной биологии , сообщили о первом успешном внедрении крио-ЭМ. [ 9 ] Макдауэлл и Дюбоше остекловали чистую воду в виде тонкой пленки, распылив ее на гидрофильную углеродную пленку, которую быстро погрузили в криоген (жидкий пропан или жидкий этан, охлажденный до 77 К). Тонкий слой аморфного льда имел толщину менее 1 мкм, и электронограмма подтвердила наличие аморфного/стекловидного льда. В 1984 году группа Дюбоше продемонстрировала возможности крио-ЭМ в структурной биологии с анализом витрифицированного аденовируса типа 2, бактериофага Т4 , вируса леса Семлики , бактериофага CbK и вируса везикулярного стоматита . [ 10 ]

Последние достижения

[ редактировать ]

2010-е годы ознаменовались резким развитием электронных камер. Примечательно, что усовершенствования детекторов прямых электронов привели к «революции разрешения». [ 11 ] сдвигая барьер разрешения ниже критического предела ~ 2-3 Å для определения положения и ориентации аминокислот. [ 12 ]

Хендерсон ( Лаборатория молекулярной биологии MRC , Кембридж, Великобритания) сформировал консорциум с инженерами лаборатории Резерфорда Эпплтона и учеными Общества Макса Планка для финансирования и разработки первого прототипа. Затем консорциум объединил усилия с производителем электронных микроскопов FEI, чтобы представить и продать новую конструкцию. Примерно в то же время компания Gatan Inc. из Плезантона, Калифорния, представила аналогичный детектор, разработанный Питером Денесом ( Национальная лаборатория Лоуренса Беркли ) и Дэвидом Агардом ( Калифорнийский университет, Сан-Франциско ). Третий тип камеры был разработан Нгуеном-Хуу Сюонгом в компании Direct Electron ( Сан-Диего, Калифорния ). [ 11 ]

В последнее время достижения в использовании каркасов для визуализации на основе белков помогают решить проблемы смещения ориентации образца и ограничения размера. Белки размером менее ~50 кДа обычно имеют недостаточное соотношение сигнал/шум для разрешения белковых частиц на изображении, что затрудняет или делает невозможным трехмерную реконструкцию. [ 13 ] Каркасы для визуализации повышают SNR более мелких белков, связывая их с более крупным объектом — каркасом. Группа Йейтса из Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе смогла создать более четкое изображение трех вариантов KRAS (размером примерно 19 кДа), используя жесткий каркас для визуализации и используя DARPins в качестве модульного связывающего домена между каркасом и интересующим белком. [ 14 ]

Нобелевская премия по химии 2017 г.

[ редактировать ]

В знак признания влияния крио-ЭМ на биохимию трое учёных, Жак Дюбоше , Иоахим Франк и Ричард Хендерсон , были удостоены Нобелевской премии по химии «за разработку криоэлектронной микроскопии для определения структуры биомолекул в растворе с высоким разрешением». ." [ 4 ]

Сравнение с рентгеновской кристаллографией

[ редактировать ]

Традиционно рентгеновская кристаллография была самым популярным методом определения трехмерных структур биологических молекул. [ 15 ] Однако вышеупомянутые усовершенствования крио-ЭМ увеличили ее популярность как инструмента для изучения деталей биологических молекул. С 2010 года ежегодные депозиты крио-ЭМ структур опередили рентгеновскую кристаллографию. [ 16 ] Хотя рентгеновская кристаллография имеет значительно больше общих месторождений из-за более длительной истории, общее количество месторождений этих двух методов, по прогнозам, затмит около 2035 года. [ 16 ]

Разрешение рентгеновской кристаллографии ограничено однородностью кристалла. [ 17 ] а приведение биологических молекул с неизвестными идеальными условиями кристаллизации в кристаллическое состояние может занять очень много времени, в крайних случаях — месяцы или даже годы. [ 18 ] Напротив, подготовка проб с помощью крио-ЭМ может потребовать нескольких раундов скрининга и оптимизации для преодоления таких проблем, как агрегация белков и предпочтительная ориентация. [ 19 ] [ 20 ] но для этого не требуется, чтобы образец сформировал кристалл, а образцы для крио-ЭМ подвергаются мгновенной заморозке и исследуются в их почти нативном состоянии. [ 21 ]

По данным Proteopedia , среднее разрешение, достигнутое с помощью рентгеновской кристаллографии (по состоянию на 19 мая 2019 года) в банке данных белков, составляет 2,05 Å . [ 17 ] а самое высокое зарегистрированное разрешение (по состоянию на 30 сентября 2022 г.) составляет 0,48 Å. [ 22 ] По состоянию на 2020 год большинство белковых структур, определенных с помощью криоЭМ, имеют более низкое разрешение - 3–4 Å. [ 23 ] Однако по состоянию на 2020 год лучшее разрешение крио-ЭМ было зафиксировано при 1,22 Å. [ 20 ] в некоторых случаях это делает его конкурентом по разрешению.

Коррелятивный световой крио-ТЭМ и крио-ЭТ.

[ редактировать ]

В 2019 году корреляционные световые крио-ПЭМ и крио-ЭТ были использованы для наблюдения туннелирующих нанотрубок (ТНТ) в нейрональных клетках. [ 24 ]

Сканирующая электронная криомикроскопия

[ редактировать ]

Сканирующая электронная криомикроскопия (криоСЭМ) — это метод сканирующей электронной микроскопии с использованием холодного столика сканирующего электронного микроскопа в криогенной камере.

Криогенная трансмиссионная электронная микроскопия

[ редактировать ]

Криогенная трансмиссионная электронная микроскопия (крио-ТЕМ) — это метод трансмиссионной электронной микроскопии , который используется в структурной биологии и материаловедении . В просторечии термин «криогенная электронная микроскопия» или его сокращение «крио-ЭМ» по умолчанию относится к криогенной трансмиссионной электронной микроскопии, поскольку подавляющее большинство крио-ЭМ выполняется в трансмиссионных электронных микроскопах, а не в сканирующих электронных микроскопах.

Федеральный технологический институт , Лозаннский университет и Женевский университет открыли Центр визуализации Дюбоше (DCI) в конце ноября 2021 года с целью применения и дальнейшего развития крио-ЭМ. [ 25 ] Менее чем через месяц после первой идентификации варианта Омикрон SARS-CoV-2 исследователи из DCI смогли определить его структуру, выявить важные мутации, позволяющие обойти отдельные вакцины, и дать представление о новых терапевтических подходах. [ 26 ]

Датский национальный крио-ЭМ центр, также известный как EMBION, был открыт 1 декабря 2016 года. EMBION — это крио-ЭМ консорциум датских университетов (принимающий Орхусский университет и соучредитель Копенгагенского университета).

анализа одиночных частиц Рабочий процесс

Расширенные методы

[ редактировать ]

См. также

[ редактировать ]
  1. ^ Тивол В.Ф., Бригель А., Дженсен Г.Дж. (октябрь 2008 г.). «Улучшенный криоген для погружной заморозки» . Микроскопия и микроанализ . 14 (5): 375–379. Бибкод : 2008MiMic..14..375T . дои : 10.1017/S1431927608080781 . ПМК   3058946 . ПМИД   18793481 .
  2. ^ Ченг Ю., Григорьев Н., Пенчек П.А., Уолц Т. (апрель 2015 г.). «Букварь к одночастичной криоэлектронной микроскопии» . Клетка . 161 (3): 438–449. дои : 10.1016/j.cell.2015.03.050 . ПМЦ   4409659 . ПМИД   25910204 .
  3. ^ Стоддарт С. (1 марта 2022 г.). «Структурная биология: как белки оказались крупным планом» . Знающий журнал . doi : 10.1146/knowable-022822-1 . S2CID   247206999 . Проверено 25 марта 2022 г.
  4. ^ Перейти обратно: а б «Нобелевская премия по химии 2017» . NobelPrize.org . Проверено 30 сентября 2022 г.
  5. ^ Дорр А. (январь 2017 г.). «Криоэлектронная томография». Природные методы . 14 (1): 34. doi : 10.1038/nmeth.4115 . ISSN   1548-7091 . S2CID   27162203 .
  6. ^ Дубочет Дж., Кнапек Э. (апрель 2018 г.). «Взлёты и падения ранней электронной криомикроскопии» . ПЛОС Биология . 16 (4): e2005550. doi : 10.1371/journal.pbio.2005550 . ПМЦ   5929567 . ПМИД   29672565 .
  7. ^ Кнапек Э., Дубочет Дж (август 1980 г.). «Лучевое повреждение органического материала значительно снижается при криоэлектронной микроскопии». Журнал молекулярной биологии . 141 (2): 147–161. дои : 10.1016/0022-2836(80)90382-4 . ПМИД   7441748 .
  8. ^ Ньюмарк П. (30 сентября 1982 г.). «Криотрансмиссионная микроскопия. Угасающие надежды» . Природа . 299 (5882): 386–387. Бибкод : 1982Natur.299..386N . дои : 10.1038/299386c0 .
  9. ^ Дубоше Дж., МакДауэлл А.В. (декабрь 1981 г.). «Витрификация чистой воды для электронной микроскопии» . Журнал микроскопии . 124 (3): 3–4. дои : 10.1111/j.1365-2818.1981.tb02483.x .
  10. ^ Адриан М., Дюбоше Дж., Лепо Дж., Макдауэлл А.В. (март 1984 г.). «Криоэлектронная микроскопия вирусов» . Природа . 308 (5954): 32–36. Бибкод : 1984Natur.308...32A . дои : 10.1038/308032a0 . ПМИД   6322001 . S2CID   4319199 .
  11. ^ Перейти обратно: а б Кюльбрандт, Вернер (28 марта 2014 г.). «Революция разрешения» . Наука . 343 (6178): 1443–1444. Бибкод : 2014Sci...343.1443K . дои : 10.1126/science.1251652 . ISSN   0036-8075 . ПМИД   24675944 . S2CID   35524447 .
  12. ^ Кастер, Дэниел Дж.; Лю, Чэнъюй; Фан, Чжэн; Подумайте, Джей В.; Маршалл, Гарланд Р. (20 апреля 2015 г.). «Кристаллические структуры белковых спиралей высокого разрешения, согласованные с трехцентровыми водородными связями, и мультипольная электростатика» . ПЛОС ОДИН . 10 (4): e0123146. Бибкод : 2015PLoSO..1023146K . дои : 10.1371/journal.pone.0123146 . ISSN   1932-6203 . ПМК   4403875 . ПМИД   25894612 .
  13. ^ Герзик, Марк А.; Ву, Мэнъюй; Ландер, Габриэль К. (04 марта 2019 г.). «Определение структуры комплексов с массой менее 100 кДа с высоким разрешением с использованием традиционной криоЭМ» . Природные коммуникации . 10 (1): 1032. Бибкод : 2019NatCo..10.1032H . дои : 10.1038/s41467-019-08991-8 . ISSN   2041-1723 . ПМК   6399227 . ПМИД   30833564 .
  14. ^ Кастельс-Граэллс Р., Мидор К., Арбинг М.А., Савайя М.Р., Джи М., Касио Д. и др. (сентябрь 2023 г.). «Крио-ЭМ определение структуры небольших терапевтических белковых мишеней с разрешением 3 Å с использованием жесткого каркаса для визуализации» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 120 (37): e2305494120. Бибкод : 2023PNAS..12005494C . дои : 10.1073/pnas.2305494120 . ПМК   10500258 . PMID   37669364 .
  15. ^ Смит М.С., Мартин Дж.Х. (февраль 2000 г.). «рентгеновская кристаллография» . Молекулярная патология . 53 (1): 8–14. дои : 10.1136/mp.53.1.8 . ПМЦ   1186895 . ПМИД   10884915 .
  16. ^ Перейти обратно: а б Чиу, Вау; Шмид, Майкл Ф.; Пинтилие, Григоре Д.; Лоусон, Кэтрин Л. (январь 2021 г.). «Эволюция стандартизации и распространение крио-ЭМ структур и данных совместно сообществом, PDB и EMDB» . Журнал биологической химии . 296 : 100560. doi : 10.1016/j.jbc.2021.100560 . ISSN   0021-9258 . ПМК   8050867 . ПМИД   33744287 .
  17. ^ Перейти обратно: а б «Разрешение — Протеопедия, жизнь в 3D» . сайт proteopedia.org . Проверено 27 октября 2020 г.
  18. ^ Каллауэй Э (февраль 2020 г.). «Революционная криоЭМ захватывает структурную биологию» . Природа . 578 (7794): 201. Бибкод : 2020Natur.578..201C . дои : 10.1038/d41586-020-00341-9 . ПМИД   32047310 .
  19. ^ Люмкис, Дмитрий (29 марта 2019 г.). «Проблемы и возможности криоЭМ одночастичного анализа» . Журнал биологической химии . 294 (13): 5181–5197. дои : 10.1074/jbc.rev118.005602 . ISSN   0021-9258 . ПМК   6442032 . ПМИД   30804214 .
  20. ^ Перейти обратно: а б Накане Т., Котеча А., Сенте А., Макмаллан Г., Масиулис С., Браун П.М. и др. (ноябрь 2020 г.). «Одночастичная криоЭМ атомного разрешения» . Природа . 587 (7832): 152–156. Бибкод : 2020Natur.587..152N . дои : 10.1038/s41586-020-2829-0 . ПМК   7611073 . ПМИД   33087931 .
  21. ^ Ван Х.В., Ван Дж.В. (январь 2017 г.). «Как криоэлектронная микроскопия и рентгеновская кристаллография дополняют друг друга» . Белковая наука . 26 (1): 32–39. дои : 10.1002/pro.3022 . ПМК   5192981 . ПМИД   27543495 .
  22. ^ Шмидт А., Титер М., Векерт Э., Ламзин В.С. (апрель 2011 г.). «Кристаллическая структура небольшого белка крамбина с разрешением 0,48 Å» . Акта Кристаллографика. Раздел F. Структурная биология и кристаллизационные связи . 67 (Часть 4): 424–428. дои : 10.1107/S1744309110052607 . ПМК   3080141 . ПМИД   21505232 .
  23. ^ Йип К.М., Фишер Н., Пакния Э., Чари А., Старк Х. (ноябрь 2020 г.). «Определение структуры белка с атомным разрешением методом криоЭМ». Природа . 587 (7832): 157–161. Бибкод : 2020Natur.587..157Y . дои : 10.1038/s41586-020-2833-4 . ПМИД   33087927 . S2CID   224823207 .
  24. ^ Сартори-Рупп А., Кордеро Сервантес Д., Пепе А., Гуссе К., Делаж Е., Корройер-Дульмонт С. и др. (январь 2019 г.). «Корреляционная криоэлектронная микроскопия выявляет структуру ТНТ в нейрональных клетках» . Природные коммуникации . 10 (1): 342. Бибкод : 2019NatCo..10..342S . дои : 10.1038/s41467-018-08178-7 . ПМК   6341166 . ПМИД   30664666 .
  25. ^ «Открытие Центра визуализации Дубоше (DCI) в кампусах UNIGE, UNIL и EPFL» . unige.ch . 30 ноября 2021 г. Проверено 30 апреля 2022 г.
  26. ^ «Ученые раскрывают тайны варианта Омикрона с помощью микроскопов» . Swissinfo.ch . 30 декабря 2021 г. Проверено 30 апреля 2022 г.
  27. ^ Бауэрляйн, Феликс Дж.Б.; Баумайстер, Вольфганг (01 октября 2021 г.). «На пути к визуальной протеомике в высоком разрешении» . Журнал молекулярной биологии . От последовательности белка к структуре на сверхскорости: как альфафолд влияет на биологию. 433 (20): 167187. doi : 10.1016/j.jmb.2021.167187 . ISSN   0022-2836 . ПМИД   34384780 .
  28. ^ Нанненга Б.Л., Ши Д., Лесли А.Г., Гонен Т. (сентябрь 2014 г.). «Определение структуры высокого разрешения путем сбора данных непрерывного вращения в MicroED» . Природные методы . 11 (9): 927–930. дои : 10.1038/nmeth.3043 . ПМК   4149488 . ПМИД   25086503 .
  29. ^ Джонс К.Г., Мартинович М.В., Хаттне Дж., Фултон Т.Дж., Штольц Б.М., Родригес Дж.А. и др. (ноябрь 2018 г.). «КриоЭМ-метод MicroED как мощный инструмент для определения структуры малых молекул» . Центральная научная служба ACS . 4 (11): 1587–1592. дои : 10.1021/accentsci.8b00760 . ПМК   6276044 . ПМИД   30555912 .
  30. ^ де ла Круз М.Дж., Хаттне Дж., Ши Д., Зейдлер П., Родригес Дж., Рейес Ф.Е. и др. (февраль 2017 г.). «Структуры атомного разрешения из фрагментированных белковых кристаллов криоЭМ-методом MicroED» . Природные методы . 14 (4): 399–402. дои : 10.1038/nmeth.4178 . ПМК   5376236 . ПМИД   28192420 .
  31. ^ Грюен Т., Веннмахер Дж.Т., Заубицер С., Гольштейн Дж.Дж., Хайдлер Дж., Фекто-Лефевр А. и др. (декабрь 2018 г.). «Быстрое определение структуры микрокристаллических молекулярных соединений методом электронной дифракции» . Ангеванде Хеми . 57 (50): 16313–16317. дои : 10.1002/anie.201811318 . ПМК   6468266 . ПМИД   30325568 .
  32. ^ Ченг Ю (август 2018 г.). «Одночастичная крио-ЭМ-Как она сюда попала и куда пойдет» . Наука . 361 (6405): 876–880. Бибкод : 2018Sci...361..876C . дои : 10.1126/science.aat4346 . ПМК   6460916 . ПМИД   30166484 .
  33. ^ Сяо К., Фишер М.Г., Болотауло Д.М., Уллоа-Рондо Н., Авила Г.А. и Саттл, Калифорния (2017) «Крио-ЭМ-реконструкция капсида вируса Cafeteria roenbergensis предполагает новый путь сборки гигантских вирусов. ". Научные отчеты , 7 : 5484. doi : 10.1038/s41598-017-05824-w .
Arc.Ask3.Ru: конец переведенного документа.
Arc.Ask3.Ru
Номер скриншота №: 04eef3131b74217355f406ea90ac0be2__1722786120
URL1:https://arc.ask3.ru/arc/aa/04/e2/04eef3131b74217355f406ea90ac0be2.html
Заголовок, (Title) документа по адресу, URL1:
Cryogenic electron microscopy - Wikipedia
Данный printscreen веб страницы (снимок веб страницы, скриншот веб страницы), визуально-программная копия документа расположенного по адресу URL1 и сохраненная в файл, имеет: квалифицированную, усовершенствованную (подтверждены: метки времени, валидность сертификата), открепленную ЭЦП (приложена к данному файлу), что может быть использовано для подтверждения содержания и факта существования документа в этот момент времени. Права на данный скриншот принадлежат администрации Ask3.ru, использование в качестве доказательства только с письменного разрешения правообладателя скриншота. Администрация Ask3.ru не несет ответственности за информацию размещенную на данном скриншоте. Права на прочие зарегистрированные элементы любого права, изображенные на снимках принадлежат их владельцам. Качество перевода предоставляется как есть. Любые претензии, иски не могут быть предъявлены. Если вы не согласны с любым пунктом перечисленным выше, вы не можете использовать данный сайт и информация размещенную на нем (сайте/странице), немедленно покиньте данный сайт. В случае нарушения любого пункта перечисленного выше, штраф 55! (Пятьдесят пять факториал, Денежную единицу (имеющую самостоятельную стоимость) можете выбрать самостоятельно, выплаичвается товарами в течение 7 дней с момента нарушения.)