Усвояемый дрожжами азот
Усвояемый дрожжами азот или YAN представляет собой комбинацию свободного аминного азота (FAN), аммиака (NH 3 ) и аммония (NH 4 + ), который доступен для дрожжей, например, винных дрожжей Saccharomyces cerevisiae , для использования во время ферментации . Помимо сбраживаемых сахаров, глюкозы и фруктозы , азот является наиболее важным питательным веществом, необходимым для проведения успешного брожения, которое не заканчивается до намеченной точки высыхания или не приводит к развитию неприятных запахов и связанных с ними дефектов вина . В связи с этим виноделы часто дополняют имеющиеся ресурсы ЯН азотными добавками, такими как диаммонийфосфат (ДАФ). [ 1 ]
Однако добавление чрезмерного количества азота также может создать опасность, поскольку другие организмы, помимо полезных винных дрожжей, могут использовать питательные вещества. такие как Brettanomyces , Acetobacter и молочнокислые бактерии родов Lactobacillus и Pediococcus К ним относятся микроорганизмы, вызывающие порчу , . Вот почему многие винодельческие предприятия измеряют YAN после сбора урожая и измельчения , используя один из нескольких доступных сегодня методов, включая анализ азота с помощью о-фтальдиальдегида (NOPA), который требует использования спектрометра или метода формольного титрования . Знание YAN в сусле позволяет виноделам рассчитать правильное количество добавок, необходимых для прохождения ферментации, оставляя только «питательную пустыню» для любых организмов, вызывающих порчу, которые могут появиться впоследствии. [ 2 ]
Количество YAN, которое виноделы увидят в своем виноградном сусле, зависит от ряда компонентов, включая сорт винограда , подвои , почвы виноградников и методы виноградарства (такие как использование удобрений и уход за пологом ), а также климатические условия конкретных урожаев . [ 3 ]
Компоненты
[ редактировать ]
YAN — это показатель первичных органических (свободные аминокислоты) и неорганических (аммиак и аммоний) источников азота, которые могут усваиваться S. cerevisiae . В сусле и вине содержится несколько азотистых соединений, включая пептиды , более крупные белки , амиды , биогенные амины , пиридины , пурины и нуклеиновые кислоты , но они не могут напрямую использоваться дрожжами для метаболизма. В совокупности общее содержание азота в виноградном сусле может составлять от 60 до 2400 мг азота на литр, однако не весь этот азот будет усваиваемым. [ 1 ] Отсутствие ферментов протеаз , которые расщепляют более крупные пептиды на более мелкие компоненты, способные работать вне клетки, ограничивает размер молекул, которые дрожжи могут использовать в качестве источника азота. [ 3 ] [ 4 ]
Количество YAN, которое виноделы увидят в своих виноградных суслах, зависит от ряда компонентов, включая сорт винограда, подвои, почвы виноградников и методы виноградарства (например, использование удобрений и уход за пологом), а также климатические условия конкретных урожаев. Заражение плесенью, такой как Botrytis cinerea (известное как благородная гниль , когда это необходимо), может снизить содержание аминокислот в виноградном сусле на целых 61%. [ 1 ] Некоторые регионы известны низким уровнем YAN, например, штат Вашингтон , где в течение типичного урожая 90% протестированного сусла будет ниже 400 мг N/л. [ 5 ] и почти четверть – ниже 150 мг N/л. [ 2 ]
На винограднике азот поглощается виноградной лозой в виде нитрата (NO 3 − ), аммоний или мочевина , которая восстанавливается до аммиака. Посредством дополнительных реакций азот включается в глутамин и глутамат и в конечном итоге используется в синтезе других аминокислот и азотистых соединений. [ 1 ] После сбора урожая большая часть (около 80%) доступных азотистых соединений, содержащихся в винограде, концентрируется в кожице и семенах. Эти соединения попадают в сусло в процессе измельчения и при мацерации /контакте с кожей. [ 4 ] Даже после прессования до 80% первоначального содержания азота в каждой ягоде винограда остается в выжимках . [ 3 ]
Аминокислоты
[ редактировать ]аминокислоты аргинин , пролин Из свободного аминоазота (FAN), входящего в состав YAN, наиболее распространены и глютамин, за которыми следуют аланин , треонин , серин и аспарагиновая кислота в гораздо меньших концентрациях. [ 1 ] хотя следовые количества большинства известных аминокислот можно найти в виноградном сусле. [ 2 ] Пролин обычно является наиболее концентрированным и может составлять до 30% от общего количества аминокислот. [ 4 ] Точное количество FAN будет варьироваться и может составлять от 22 до 1242 мг азота/литр YAN, полученного из свободных аминокислот. [ 5 ]
В то время как аргинин, глютамин и другие аминокислоты быстро расходуются, часто на очень ранних стадиях ферментации, пролин вообще не потребляется дрожжами во время нормальных, анаэробных условий ферментации. Это связано с тем, что одним из ферментов, необходимых для его использования, является оксидаза ( требующая молекулярного кислорода), а другой подавляется присутствием аммония (еще одного источника усваиваемого азота, необходимого дрожжам) в сусле. Однако в хорошо аэрированных заквасочных культурах , содержащих сусло, в которое не был добавлен диаммонийфосфат, обычно наблюдается некоторое использование пролина до того, как начнутся анаэробные условия ферментации. [ 1 ] Когда виноделы измеряют FAN, им необходимо знать, включает ли их анализ пролин, поскольку это повысит их показатель YAN. Шардоне и Каберне Совиньон — два сорта Vitis vinifera , которые, как известно, имеют очень высокий уровень пролина, тогда как Рислинг и Совиньон блан обычно имеют очень низкий уровень. [ 4 ]
Дрожжи переносят аминокислоты и небольшие пептиды (менее 5 аминокислотных остатков ) в клетку посредством активного процесса транспорта , в котором используются специализированные мембранные белки и разница в градиенте pH кислого винного раствора (pH между 3-4) и ближайшего нейтральный pH цитоплазмы внутри дрожжевых клеток. Белки протон- симпорта в мембране поглощают аминокислоту, связанную с ионом водорода, которая позже выбрасывается клеткой через насос ионов водорода . Это энергозависимый процесс, который становится более энергетически невыгодным для дрожжевой клетки по мере прогрессирования ферментации и повышения уровня этанола, создавая «пассивную утечку» избыточных ионов водорода в клетку. Насосам ионов водорода в клетке приходится работать еще усерднее, чтобы поддерживать внутренний pH, поэтому они посылают сигнал симпортным белкам, чтобы они прекратили приносить другие ионы. Это одна из причин, почему добавление азота на поздней стадии ферментации практически неэффективно, поскольку механизмы транспортировки азота в клетку отключены. [ 4 ]
Аммиачные соединения
[ редактировать ]
На протяжении всего брожения аммоний является основной формой усваиваемого азота, доступной дрожжам. [ 1 ] Однако при измельчении сок может содержать от 0 до 150 мг/л солей аммония, в зависимости от того, сколько азота виноградная лоза получила на винограднике. [ 4 ]
В клетке неорганический аммиак и ионы аммония «фиксируются» посредством серии химических реакций, которые в конечном итоге дают глутамат органического азота. [ 2 ] Ион аммония также служит аллостерическим регулятором для одного из ферментов, используемых в гликолизе , а также может влиять на то, как дрожжевые клетки транспортируют глюкозу и фруктозу в клетку. [ 4 ] Было показано, что белки, используемые в основной системе транспорта глюкозы, имеют период полураспада 12 часов. В исследованиях, в которых дрожжевые клетки подвергались «аммиачному голоданию», вся система отключалась через 50 часов, что дает убедительные доказательства того, что недостаток аммиака/аммония может повысить риск остановки брожения. [ 3 ]
Глутатион (GSH: L-гамма-глутамил-L-цистеинилглицин) присутствует в высоких концентрациях до 10 мМ в дрожжевых клетках. Он играет ключевую роль в ответ на серное и азотное голодание. [ 6 ]
Аммиак не используется такими бактериями, как Acetobacter и молочнокислыми бактериями, используемыми при малолактической ферментации . [ 2 ]
Значение в виноделии
[ редактировать ]Ассимилируемый азот является важным питательным веществом, необходимым винным дрожжам для полного завершения ферментации с образованием минимального количества нежелательных побочных продуктов (таких как соединения, такие как сероводород , которые могут создавать неприятный запах). В ходе ферментации дрожжи могут использовать до 1000 мг/л аминокислот, хотя зачастую их количество гораздо меньше необходимого. [ 2 ] Дрожжи могут хранить аминокислоты во внутриклеточных вакуолях , а затем либо использовать их напрямую, включая в белки, либо расщеплять их и использовать их углеродные и азотистые компоненты отдельно. [ 4 ]
При отсутствии азота дрожжи начнут закрываться и погибать. Некоторые штаммы начинают расщеплять серосодержащие аминокислоты, такие как цистеин и метионин, высвобождая атом серы, который может соединяться с водородом с образованием сероводорода ( H
2 S ), которые могут придавать вину запах тухлых яиц. Однако прямой корреляции между уровнями YAN и выработкой сероводорода не существует, поскольку дрожжи могут производить H 2 S даже при наличии большого количества азота, но при недостатке других жизненно важных питательных веществ (таких как витамин пантотеновая кислота ). Существуют даже некоторые штаммы S. cerevisiae , которые производят H 2 S в ответ на слишком большое количество доступного азота (особенно на слишком большое количество глутаминовой кислоты и аланина). [ 3 ] ). Вот почему профилактический подход, заключающийся в безразборном добавлении азотных добавок при каждой ферментации, может не дать желаемых результатов по предотвращению H 2 S. [ 2 ]
Уровень азота в вине может влиять на многие органолептические аспекты полученного вина, включая синтез многих ароматических соединений. Сивушные спирты образуются в результате разложения аминокислот, хотя в присутствии высоких уровней аммиака и мочевины их производство снижается. Когда доступный азот ограничен, уровни глицерина и трегалозы , которые могут влиять на вкусовые ощущения , повышаются. [ 3 ]
Прикидки сколько нужно
[ редактировать ]Необходимое количество YAN будет зависеть от целей винодела в отношении ферментации, особенно от того, желательно ли дикое брожение или вино будет полностью сброжено до сухого состояния. Состояние винограда и условия брожения будут влиять на необходимое количество азота. Поврежденные, заплесневелые или зараженные серой гнилью плоды обычно в большей степени обеднены азотом (а также другими витаминными ресурсами), когда они поступают с виноградника, чем чистый, неповрежденный виноград. Это истощение может еще больше усугубиться чрезмерным осветлением сусла и высоким содержанием сахара. Вина, ферментированные при более высоких температурах, имеют тенденцию развиваться быстрее, требуя больше азота, чем более длительное и прохладное брожение. Кроме того, количество воздействия кислорода будет влиять на скорость поглощения азота дрожжами в винах, ферментированных в полностью анаэробных условиях (например, многие белые вина в резервуарах из нержавеющей стали), требующих меньше азота, чем вина, ферментированные в бочках или ферментерах с открытым верхом. [ 7 ]
Рекомендуемый диапазон, данный энологами, варьируется от 150 мг/л ЯН. [ 8 ] до 400 мг азота на литр. [ 9 ] Некоторые исследования показали, что максимальная скорость ферментации может быть достигнута при использовании YAN в диапазоне от 400 до 500 мг N/л. [ 10 ] Однако не все виноделы захотят, чтобы ферментация проходила с максимальной скоростью (с точки зрения биомассы дрожжей, температуры и скорости) из-за влияния, которое она может оказать на другие сенсорные аспекты вина, такие как развитие аромата и сохранение фруктов. [ 3 ]
Исследование, проведенное Департаментом виноградарства и энологии Калифорнийского университета в Дэвисе, показало, что рекомендации по оптимальному уровню азота для завершения успешной ферментации могут быть сделаны на основе уровня урожая по шкале Брикса , который был принят многими производителями дрожжей и питательных веществ. [ 11 ] [ 12 ]
- 21°Bx = 200 мг N/л
- 23°Bx = 250 мг N/л
- 25°Bx = 300 мг N/л
- 27°Bx = 350 мг N/л
Однако другие исследования показали, что успешное брожение может проводиться при уровнях YAN ниже этих рекомендаций, а также вялое/приостановленное брожение, происходящее даже тогда, когда уровни YAN соответствуют рекомендациям. [ 1 ]
При яблочно-молочном брожении
[ редактировать ]
Как и дрожжи, молочнокислые бактерии (LAB), используемые при яблочно-молочной ферментации (обычно Oenococcus oeni ), требуют азота. Однако, в отличие от S. cerevisiae, LAB не могут использовать аммиак, а такие добавки, как диаммонийфосфат (DAP), не приносят никакой питательной пользы. Виноделы, которые случайно используют DAP в качестве питательной добавки для прививки MLF, рискуют вместо этого предоставить питательные вещества для организмов, вызывающих порчу, таких как Brettanomyces . [ 2 ]
Хотя некоторые виноделы прививают свои молочнокислые бактерии питательными веществами, содержащими азот, большая часть питательных веществ, необходимых для MLF, поступает в результате распада (или автолиза ) мертвых дрожжевых клеток. Кроме того, большинство бактерий, используемых в MLF, обладают способностью вырабатывать внеклеточные ферменты протеазы, которые также могут расщеплять более крупные пептидные цепи на их основные аминокислотные остатки, которые затем могут быть использованы для метаболизма. [ 4 ]
Измерения и тесты
[ редактировать ]Анализ азота с помощью о-фтальдальдегида (NOPA) используется для измерения доступных первичных аминокислот в виноградном соке с помощью спектрофотометра , который может измерять длину волны 335 нм . Поскольку анализ измеряет только первичные аминокислоты, полученные результаты не будут включать концентрации пролина или аммиака. [ 13 ] Пролин можно измерить отдельно с помощью анализа, в котором используется нингидрин для реакции с аминокислотой в присутствии муравьиной кислоты , в результате чего образуется соединение, которое может абсорбироваться при длине волны 517 нм. [ 1 ]
Титрование формалом , изобретенное датским химиком С.П.Л. Соренсеном в 1907 году, использует формальдегид в присутствии гидроксида калия или натрия для измерения концентрации аминокислот и аммиака с помощью рН-метра . Реагенты также будут реагировать с пролином, что может дать немного более высокое значение YAN, чем NOPA. [ 14 ] Формальный метод также имеет недостатки, связанные с использованием и утилизацией формальдегида, который является известным канцерогеном. [ 15 ] и высокотоксичный реагент хлорид бария . [ 1 ]
Аммиак и аммиак можно измерить с помощью ионоселективного электрода-зонда и pH-метра. [ 1 ]
Добавки азота
[ редактировать ]Виноделы давно знали, что некоторые ферментации протекали более предсказуемо и «здоровее», если выжимки (твердые кожицы, семена и остатки после прессования в партию добавляли ) от другого вина. Этот метод до сих пор используется для изготовления итальянского вина Рипассо . В Тоскане 14-го века техника гуверно , использовавшаяся в некоторых из первых Кьянти, заключалась в добавлении в смесь сушеного винограда. [ 16 ] Хотя при этом также добавлялся сахар, оба метода обеспечивали дополнительный азот и другие питательные вещества, все еще доступные в кожуре и семенах. [ 17 ]
Когда энологи начали лучше понимать науку о брожении, азот был признан основным питательным веществом, и виноделы еще в 1900-х годах начали добавлять в свое сусло соли аммония. [ 4 ] Мочевина также использовалась в качестве ранней азотной добавки, но исследования, связывающие ее с разработкой этилкарбамата, привели к ее запрету во многих странах, включая Соединенные Штаты , с 1990 года. [ 2 ] [ 18 ] [ 19 ]
Виноделам доступно множество типов азотных добавок. Большинство из них представляют собой сложные составы, которые включают азот (из аминокислот или солей аммония), а также витамины, минералы и другие факторы роста и продаются под такими торговыми марками, как Go-Ferm , Superfood , Fermaid K (последние два также содержат некоторое количество DAP). . [ 2 ] Аминокислоты можно добавлять непосредственно в сусло, хотя с 2010 года только глицин . в США разрешено добавлять в сусло [ 4 ]
Дрожжевые оболочки (или дрожжевые призраки) — это остатки клеточных стенок дрожжей, оставшиеся после коммерческого производства штаммов дрожжей, которые будут использоваться для инокуляции. Помимо того, что они являются источником усваиваемого азота из аминокислот, они также обеспечивают липиды и стеролы , которые могут использоваться клетками для укрепления их плазматической мембраны, позволяя усваивать другие источники азота. [ 2 ]
Риск добавления слишком большого количества
[ редактировать ]Азотные добавки, особенно DAP, стимулируют размножение дрожжей и могут значительно увеличить биомассу. Это может привести к ускорению скорости брожения быстрее, чем хотелось бы виноделу, а также к увеличению температуры брожения из-за тепла, выделяемого дрожжами. Избыточная биомасса также может привести к нехватке других питательных веществ для дрожжей, таких как витамины и стерины, из-за усиления конкуренции и может привести к образованию неприятных запахов (например, сероводорода) и даже остановке ферментации. [ 1 ]
Чрезмерный уровень аминокислоты аргинин (более 400 мг/л), особенно ближе к концу ферментации, может представлять риск увеличения производства этилкарбамата. Это связано с тем, что аргинин расщепляется на мочевину, которая может реабсорбироваться и использоваться дрожжами или метаболизироваться в аммиак. Однако мочевина также вступает в реакцию с этанолом , если она не полностью метаболизируется, что в сочетании с длительным воздействием (а также высокими температурами) может привести к образованию сложного эфира этилкарбамата . [ 1 ]
Однако наибольший риск чрезмерного добавления сусла заключается в том, что избыток азота и других питательных веществ останется после завершения ферментации. Это может создать микробную нестабильность, поскольку организмы, вызывающие порчу, могут использовать эти излишки питательных веществ. [ 3 ]
Винные законы и правила
[ редактировать ]В Соединенных Штатах Бюро по налогам и торговле алкоголем и табаком (TTB) ограничивает использование диаммонийфосфата в качестве азотной добавки до 968 мг/л (8 фунтов/1000 галлонов), что обеспечивает 203 мг N/л YAN. В Европейском Союзе большинство стран следуют рекомендациям Международной организации винограда и вина (OIV), которые устанавливают предел в 300 мг/л. В Австралии предел основан на уровне неорганического фосфата с максимально допустимым пределом 400 мг/л фосфата. [ 2 ]
Влияние времени
[ редактировать ]Поскольку большинство питательных добавок питают все живые микроорганизмы в сусле (желательно это или нет), виноделы часто откладывают добавление питательных веществ до тех пор, пока не будут готовы инокулировать сусло желаемым штаммом S. cerevisiae . Производители, использующие дикие ферменты, могут также подождать, пока добавление диоксида серы не уничтожит нежелательные микробы, или начать кормить раньше, потому что им нужна потенциальная сложность, которую другие микробы могут добавить в вино. При добавлении азот обычно находится в форме аминокислот в сочетании с витаминами и минералами, которые помогают запустить ферментацию. [ 2 ]
Вскоре после инокуляции дрожжи начинают быстро потреблять доступный усваиваемый азот, причем к началу полного брожения полностью расходуется до 46% ЯН. [ 1 ] Поскольку неорганический азот, такой как соли аммония в DAP, в высоких концентрациях токсичны для дрожжей, его никогда не добавляют во время инокуляции, когда биомасса вновь регидратированных дрожжей низкая. Многие виноделы разделяют дозировку DAP, причем первое добавление вносится в конце лаг-фазы , когда дрожжи вступают в период экспоненциального роста и начинается алкогольное брожение. В большинстве случаев это происходит через 48–72 часа после прививки. Затем вторая доза часто добавляется примерно на трети пути ферментации сахара и часто до того, как уровень сахара достигнет 12-10 Брикса (от 6,5 до 5,5 по Боме, от 48,3 до 40,0 по Оксле), потому что по мере прогрессирования ферментации дрожжевые клетки больше не способны доставить азот в клетку из-за возрастающей токсичности этанола, окружающего клетки. Это оставляет азот неиспользованным и доступным для организмов, вызывающих порчу, которые могут появиться впоследствии. [ 2 ] [ 3 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б с д и ж г час я дж к л м н Б. Цокляйн, К. Фугельсанг, Б. Гамп, Ф. Нури Анализ и производство вина, стр. 152–163, 340–343, 444–445, 467 Kluwer Academic Publishers, Нью-Йорк (1999). ISBN 0834217015
- ^ Jump up to: а б с д и ж г час я дж к л м н К. Фугельсанг, К. Эдвардс, Микробиология вина, второе издание, стр. 16–17, 35, 115–117, 124–129 Springer Science and Business Media, Нью-Йорк (2010 г.) ISBN 0387333495
- ^ Jump up to: а б с д и ж г час я Р. Джексон «Виноведение: принципы и приложения», третье издание, стр. 90–98, 151, 167, 183, 305–310, 356–357, 375–387, 500, 542 Academic Press, 2008 г. ISBN 9780123736468
- ^ Jump up to: а б с д и ж г час я дж к Р. Бултон, В. Синглтон, Л. Биссон, Р. Кунки Принципы и практика виноделия, стр. 46–48, 80–81, 153–167, 256 Springer, 1996, Нью-Йорк. ISBN 978-1-4419-5190-8
- ^ Jump up to: а б Сара Э. Спайд и Джой Андерсен-Багге « Состав свободных аминокислот виноградного сока из 12 сортов Vitis vinifera в Вашингтоне » Am. Дж. Энол. Витич 1996 т. 47 нет. 4 389-402
- ^ Пеннинкс, MJ (2002). «Обзор глутатиона в Saccharomyces по сравнению с нетрадиционными дрожжами» . Исследование дрожжей FEMS . 2 (3): 295–305. дои : 10.1016/s1567-1356(02)00081-8 . ПМИД 12702279 .
- ^ Лаллеманд « Питание дрожжей и защита для надежного алкогольного брожения » Современное состояние. Доступ: 31 марта 2013 г.
- ^ С.М. Уикс и П.А. Хеншке « Усвояемый дрожжами азот » Австралийский научно-исследовательский институт вина. Доступ: 31 марта 2013 г.
- ^ Маурицио Ульяно, Пол А. Хеншке, Маркус Дж. Хердерих, Исак С. Преториус « Управление азотом имеет решающее значение для вкуса и стиля вина » Австралийский научно-исследовательский институт вина. ТОМ 22 № 6 НОЯБРЬ/ДЕКАБРЬ 2007 ГОДА
- ^ Брюс В. Цокляйн « I. Азотные соединения » Уголок винодела, Энологические заметки Технологического университета Вирджинии, Vol. 13, № 4 июль - август 1998 г.
- ^ Линда Ф. Биссон и Кристиан Э. Буцке « Диагностика и исправление застоявшегося и вялого брожения » Am. Дж. Энол. Витич 2000 об. 51 нет. 2 168-177
- ^ Крис Герлинг « Часто задаваемые вопросы о YAN » Veraison to Harvest # 6, Кооперативное расширение Корнельского университета. октябрь 2010 г.
- ↑ Расширение сотрудничества Калифорнийского университета в Дэвисе « Процедура NOPA » Butzke & Dukes (1998), доступ: 31 марта 2013 г.
- ^ Барри Х. Гамп, Брюс В. Цокляйн, Кеннет К. Фугельсанг и Роберт С. Уитон « Сравнение аналитических методов прогнозирования пищевого статуса виноградного сока при предферментации » Am. Дж. Энол. Витич 2002 вып. 53 нет. 4 325-329
- ^ Технологический университет Вирджинии « Оценка FAN с помощью титрования формалом » Адаптировано из Zoecklein et al., 1999 и Gump, Zoecklein and Fugelsang, 2002. Доступ: 31 марта 2013 г.
- ^ Винтаж Х. Джонсона : История вина, стр. 415, Саймон и Шустер, 1989 г. ISBN 0-671-68702-6
- ^ Дж. Робинсон (редактор) «Оксфордский спутник вина», третье издание, стр. 319 Oxford University Press, 2006 г. ISBN 0-19-860990-6
- ^ КРИСТИАН Э. БУЦКЕ И ЛИНДА Ф. БИССОН « Руководство по профилактическим действиям по этилкарбамату » ' Расширение сотрудничества Калифорнийского университета в Дэвисе. Доступ: 31 марта 2013 г.
- ^ М. Эллин Дойл, Кэрол Э. Стейнхарт и Барбара А. Кокрейн « Безопасность пищевых продуктов: 1994 », стр. 297, Институт пищевых исследований Университета Висконсина-Мэдисона, CRC Press (1994) ISBN 0824792904
| Урожай | |
|---|---|
| Прессование | |
| Мацерация | |
| Ферментация | |
| Старение | |
| Другие шаги | |
| Связанный | |
