Начальная точка (дрожжи)
Начальная точка — это основная контрольная точка клеточного цикла у дрожжей , известная как точка ограничения у многоклеточных организмов. [ 1 ] Контрольная точка «Начало» обеспечивает вход в клеточный цикл, даже если условия позже станут неблагоприятными. Физиологические факторы, которые контролируют прохождение контрольной точки «Старт», включают внешние концентрации питательных веществ, наличие фактора спаривания/феромона, формы стресса и контроль размера. [ 2 ]
Ранняя характеристика Старта
[ редактировать ]Стремясь изучить упорядоченные события клеточного цикла, Леланд Хартвелл и др. скринировали и охарактеризовали чувствительные к температуре мутанты, также известные как мутанты цикла клеточного деления (мутанты cdc), которые демонстрируют остановку клеточного развития на различных стадиях цикла. [ 3 ] Хартвелл не только идентифицировал мутант cdc28, который останавливается на очень ранних стадиях клеточного цикла, но также признал, что присутствие факторов спаривания может привести к сходным фенотипам ингибирования образования почек и отсутствия синтеза ДНК. Примечательно, что клетки, подвергшиеся воздействию факторов спаривания на более поздних стадиях цикла, продолжали деление и останавливались только тогда, когда образовавшиеся дочерние клетки достигли «ранних стадий» (или, более технически, фазы G1) клеточного цикла. Эти результаты позволяют предположить, что и cdc28, и феромоны спаривания опосредуют такие ранние события, а также позволяют предположить, что существует точка в клеточном цикле, когда клетка переходит к делению, а не к спариванию. Хартвелл назвал эту точку «Начало», когда клетки чувствительны к феромонам спаривания до достижения этой стадии, но нечувствительны к факторам спаривания после этого.
За годы, прошедшие после трудоемких экспериментов Хартвелла, было показано, что другие факторы окружающей среды способствуют клеточной судьбе у дрожжей и, аналогично, у других организмов. Критическое исследование, проведенное Зеттербергом и др . , хотя и не специфично для дрожжей. в 1985 году представили доказательства наличия точки коммитирования в клетках Swiss 3T3 или фибробластах эмбрионов мышей при выращивании в условиях сыворотки или сыворотки. [ 4 ] Как и реакция на спаривающиеся феромоны в экспериментах Хартвелла, реакция на сывороточное голодание не была одинаковой для всех клеток. В этих условиях только постмитотические клетки моложе трех часов задерживали клеточное деление, тогда как клетки старше четырех часов были нечувствительны к отсутствию факторов роста. Эти экспериментальные результаты демонстрируют убедительные доказательства наличия точки фиксации для вступления в митоз и, следовательно, предполагают, что клетка способна воспринимать окружающую среду на предмет таких сигналов, как факторы роста, прежде чем совершить митоз.
Транскрипция генов G1/S
[ редактировать ]Транскрипция нескольких генов G1/S необходима для прохождения клетками клеточного цикла. У почкующихся дрожжей транскрипция более 200 генов активируется при переходе G1/S. [ 5 ] Транскрипция этих генов G1/S в первую очередь регулируется двумя регуляторными белками генов: SBF и MBF. Эти регуляторные белки образуют комплексы с SCB и MCB соответственно, которые расположены на промоторах генов G1/S. [ 2 ]
Регуляторные белки SBF и MBF
[ редактировать ]Комплексы SBF и MBF способны активировать транскрипцию G1/S только в том случае, если белок-ингибитор, известный как Whi5 диссоциирует . Диссоциация Whi5 требует фосфорилирования комплексом Cln3- Cdk1 . [ 2 ] Это указывает на то, что активность Cln3-Cdk1 играет важную роль в контрольной точке Start из-за ее необходимости одновременно активировать белки SBF и MBF. Активность Cln3 коррелирует со скоростью роста клеток. [ 2 ]
Активация S-Cdks с помощью G1/S-Cdks
[ редактировать ]Гены G1/S включают циклины Cln1 и Cln2, которые могут образовывать активные комплексы с Cdk1. Эти активированные комплексы Cln-Cdk помогают активировать комплексы S-Cdk, которые обычно ингибируются Sic1. [ 2 ] Sic1 не влияет на комплексы Cln-Cdk. Комплексы Cln-Cdk активируют комплексы S-Cdk посредством разрушения Sic1 путем фосфорилирования и последующего убиквитинирования SCF .
Фактор спаривания/феромон
[ редактировать ]Белковые взаимодействия между путем спаривания и развитием клеточного цикла
[ редактировать ]Реакция на спаривание феромонов, описанная в экспериментах Хартвелла. [ 3 ] Это неудивительно, учитывая антагонистические биохимические взаимодействия между путем спаривания и циклинами G1, которые способствуют прогрессированию клеточного цикла.
Как показано на прилагаемом рисунке, [ 6 ] Путь спаривания состоит из каскада MAPK (митоген-активируемой протеинкиназы), где Ste5 является промежуточным звеном в сигнале феромона и последующих киназных реакциях с помощью Ste11, Ste7 и Fus3. Благодаря своим последующим и даже непосредственным эффектам Fus3 в конечном итоге активирует Far1, который напрямую ингибирует активность циклинов G1, Cln1/2.
В свою очередь, Cln1/2 напрямую ингибирует путь спаривания посредством ингибирования Far1 и Ste5. Активность Cln1/2 опосредована активацией циклина G1, расположенного выше, Cln3. Cln3 вместе с циклин-зависимой киназой Cdc28 инактивирует и способствует экспорту ядерного Whi5. Экспорт Whi5 приводит к частичной активации факторов транскрипции SBF и MBF, которые в конечном итоге способствуют развитию клеточного цикла. Эти факторы транскрипции способствуют экспрессии Cln1/2 и усиливают реакцию клеточного цикла, образуя петлю положительной обратной связи, поскольку Cln1/2 способствует активации SBF и экспорту Whi5.
Количественное описание старта
[ редактировать ]Современное исследование, описывающее взаимосвязь между остановкой спаривания и прогрессированием клеточного цикла, было проведено Doncic et al. в июне 2011 года. [ 6 ] Признавая, что количество ядерного Whi5 является индикатором активности циклина G1, авторы решили количественно понять момент, когда клетки начинают делиться. С помощью микрофлюидной платформы асинхронная популяция клеток подвергалась воздействию феромона альфа-фактора. Используя слитый белок Whi5-GFP, они отслеживали количество ядерного Whi5 после добавления альфа-фактора и отмечали, останавливалась ли клетка или продолжала деление. Как и ожидалось, клетки pre-Start прекращали клеточное деление при добавлении феромона, на что указывает небольшая доля экспорта Whi5. И наоборот, клетки post-Start были нечувствительны к альфа-фактору и продолжали делиться, о чем свидетельствует большая доля экспорта Whi5. Таким образом, дифференциальный ответ на присутствие феромонов отражается в том, находится ли клетка в состоянии до или после старта, которое можно охарактеризовать тем, сколько Whi5 присутствует в ядре. Затем логистическая регрессия была использована для расчета вероятности остановки по отношению к доле экспортированного Whi5 и показала резкое переключение между остановкой и прогрессированием, когда примерно 50% Whi5 было экспортировано из ядра. Было также показано, что эта доля экспортируемого Whi5 соответствует активации петли положительной обратной связи Cln1/2 (см. ниже). В заключение это означает, что этот старт определяется активацией контура обратной связи Cln1/2.
Роль Whi5 в развитии клеточного цикла
[ редактировать ]Как упоминалось выше, циклины G1, Cln1/2, являются частью петли положительной обратной связи, которая способствует их собственной транскрипции и активации транскрипционных факторов SBF и MBF. В 2008 году Скотхайм и др. предположили, что эта петля обратной связи обеспечивает сильный сигнал, способствующий клеточному делению, с помощью генов, регулируемых SBF и MBF. [ 5 ] Они выдвинули гипотезу, что без согласованной экспрессии генов, необходимых для ранних событий, таких как репликация ДНК и образование зачатков, случайные отдельные клеточные сигналы создают шум, который ослабляет реакцию обязательства. Отмечая длительное и асинхронное время индукции CLN2 и RAD27 (гена в регулоне SBF/MBF) в клетках cln1∆cln2∆ по сравнению с клетками дикого типа, Skotheim et al. Таким образом, пришли к выводу, что механизм положительной обратной связи Cln1/2 обеспечивает синхронную и более эффективную экспрессию регулона SBF/MBF.
Авт. далее заметили, что фосфорилирование Whi5 и последующая инактивация играют роль в этой реакции положительной обратной связи. Аллель Whi5, лишенный шести из двенадцати сайтов фосфорилирования, приводит к медленному выходу из ядра и, следовательно, к менее последовательной индукции экспрессии CLN2 и RAD27. Таким образом, неспособность фосфорилировать Whi5 нарушает петлю положительной обратной связи Cln1/2 и, в свою очередь, снижает когерентную экспрессию регулона.
Молекулярная динамика между путем спаривания и развитием клеточного цикла
[ редактировать ]Чтобы дополнительно прояснить биохимическое объяснение между остановкой спаривания и обязательством клеточного цикла, Doncic et al. провели тот же анализ фиксации, описанный выше, на различных мутантных штаммах. [ 6 ] У мутанта FAR1-S87A отсутствуют сайты фосфорилирования CDK, и, таким образом, ингибирование Cln1/2 Far1 нарушено. Результатом является увеличение количества экспорта Whi5, необходимого для участия в клеточном делении, что позволяет предположить, что фосфорилирование Far 1 является ключом к клеточному участию. И наоборот, мутант, STE5-8A, также лишенный сайтов фосфорилирования CDK (и, таким образом, ингибирование Ste5 Cln1/2 нарушено), не смещает точку коммитирования, указывая тем самым, что такое ингибирование пути спаривания не является критическим для Start. Дальнейший временной анализ клеток STE5-8A показывает, что эти мутантные клетки не могут полностью перейти к клеточному делению, поскольку клетки, подвергшиеся воздействию альфа-фактора, отпочковываются, а затем возвращаются к спариванию, не завершая клеточный цикл. Дончич и др. предположили, что неполное деление происходит из-за экспрессии генов как на пути спаривания, так и в клеточной прогрессии, управляемой циклином G1. Действительно, отслеживание экспрессии FUS1pr-GFP, гена пути спаривания, и CLN2pr-mCherry, гена клеточного цикла, показало большую коэкспрессию в клетках STE5-8A по сравнению с клетками дикого типа.
Таким образом, ингибирование Cln1/2 Far1 позволяет войти в клеточный цикл (Start), тогда как ингибирование Ste5 гарантирует четкую экспрессию генов либо для пути спаривания, либо для прогрессирования клеточного цикла.
Контроль роста и размера питательных веществ в клетках
[ редактировать ]Внешние концентрации питательных веществ чрезвычайно важны для прохождения контрольной точки «Старт». Доступность питательных веществ сильно коррелирует с размером роста клеток. Клетки не будут развиваться, если не достигнут определенного размера из-за недостатка питательных веществ, обычно азота. Таким образом, более крупные ячейки проводят меньше времени в контрольной точке «Начало» по сравнению с меньшими ячейками. [ 2 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Ирвали, Д; Шлоттманн, ФП; Муралидхара, П; Надельсон, Я; Климанн, К; Вуд, штат Небраска; Дончич, А; Эвальд, JC (16 января 2023 г.). «Когда дрожжевые клетки передумали: клеточный цикл «Старт» обратим при голодании» . Журнал ЭМБО . 42 (2): e110321. дои : 10.15252/embj.2021110321 . ПМЦ 9841329 . ПМИД 36420556 .
- ^ Jump up to: а б с д и ж Морган, Дэвид. Клеточный цикл: принципы клеточного контроля. New Science Press Ltd., Лондон, 2007 г.; стр. 196-203.
- ^ Jump up to: а б Хартвелл, Л.Х. «Генетический контроль цикла клеточного деления дрожжей, I. Обнаружение мутантов». Труды Национальной академии наук 66.2 (1970): 352-59.
- ^ Зеттерберг А. и Олле Ларссон. «Кинетический анализ регуляторных событий в G1, приводящих к пролиферации или покою клеток Swiss 3T3». ПНАС 82 (1985): 5365-369.
- ^ Jump up to: а б Скотейм, Дж.; ДиТалия, С.; ЭД Сиггия, Э.; Кросс, Ф. Положительная обратная связь циклинов G1 обеспечивает согласованное вступление в клеточный цикл. Природа 454, 291–296 (2008).
- ^ Jump up to: а б с Дончич, Андреас, Мелоди Фаллер-Феттиг и Ян М. Скотхайм. «Различные взаимодействия выбирают и поддерживают определенную судьбу клеток». Молекулярная клетка 43.4 (2011): 528-39.