Белковая инженерия

Белковая инженерия — это процесс разработки полезных или ценных белков путем создания и производства неприродных полипептидов , часто путем изменения аминокислотных последовательностей, встречающихся в природе. Это молодая дисциплина, в которой проводится много исследований, направленных на понимание сворачивания белков и признание принципов проектирования белков . Его использовали для улучшения функции многих ферментов промышленного катализа. Это также рынок товаров и услуг, оценочная стоимость которого к 2017 году составит 168 миллиардов долларов.

Существует две основные стратегии белковой инженерии: рациональный дизайн белка и направленная эволюция . Эти методы не являются взаимоисключающими; исследователи часто применяют оба подхода. В будущем более подробные знания о белков структуре и функциях , а также достижения в области высокопроизводительного скрининга могут значительно расширить возможности белковой инженерии. В конце концов, даже неприродные аминокислоты могут быть включены с помощью новых методов, таких как расширенный генетический код , которые позволяют кодировать новые аминокислоты в генетическом коде. Приложения во многих областях, включая медицину и промышленную биопереработку, обширны и многочисленны.

Подходы

Рациональный дизайн

Основная статья: Белковый дизайн

При рациональном проектировании белка ученый использует подробные знания о структуре и функции белка, чтобы внести желаемые изменения. В целом, это имеет то преимущество, что оно недорогое и технически простое, поскольку методы сайт-направленного мутагенеза хорошо разработаны. Однако его основным недостатком является то, что подробные знания о структуре белка часто недоступны, и даже если они доступны, может быть очень трудно предсказать эффекты различных мутаций, поскольку структурная информация чаще всего дает статическую картину структуры белка. Однако такие программы, как Folding@home и Foldit, использовали методы краудсорсинга , чтобы получить представление о мотивах сворачивания белков.

вычислительного проектирования белков Алгоритмы направлены на идентификацию новых аминокислотных последовательностей, которые имеют низкую энергию при сворачивании в заранее заданную целевую структуру. Хотя пространство конформаций последовательностей, которое необходимо искать, велико, наиболее сложным требованием для вычислительного дизайна белка является быстрая, но точная энергетическая функция, которая может отличать оптимальные последовательности от аналогичных субоптимальных.

Множественное выравнивание последовательностей

Без структурной информации о белке анализ последовательности часто полезен для выяснения информации о белке. Эти методы включают выравнивание последовательностей целевых белков с последовательностями других родственных белков. Это выравнивание может показать, какие аминокислоты консервативны между видами и важны для функции белка. Эти анализы могут помочь выявить аминокислоты «горячих точек», которые могут служить местами-мишенями для мутаций. Множественное выравнивание последовательностей использует такие базы данных, как PREFAB, SABMARK, OXBENCH, IRMBASE и BALIBASE, чтобы перекрестно ссылаться на последовательности целевого белка с известными последовательностями. Ниже перечислены несколько методов выравнивания последовательностей.

Этот метод начинается с выполнения попарного выравнивания последовательностей с использованием методов k-кортежей или методов Нидлмана – Вунша . Эти методы вычисляют матрицу, которая отображает попарное сходство пар последовательностей. Оценки сходства затем преобразуются в оценки расстояний, которые используются для создания направляющего дерева с использованием метода соединения соседей. Это направляющее дерево затем используется для обеспечения множественного выравнивания последовательностей.

Кластерная омега

Этот метод способен выравнивать до 190 000 последовательностей с использованием метода k-кортежей. Следующие последовательности кластеризуются с использованием методов mBed и k -means . Затем строится направляющее дерево с использованием метода UPGMA , который используется пакетом HH align. Это направляющее дерево используется для создания множественных выравниваний последовательностей.

МАФФТ

В этом методе используется быстрое преобразование Фурье (БПФ), которое преобразует аминокислотные последовательности в последовательность, состоящую из значений объема и полярности для каждого аминокислотного остатка. Эта новая последовательность используется для поиска гомологичных областей.

K-выравнивание

Этот метод использует алгоритм приблизительного сопоставления строк Ву-Манбера для создания множественных выравниваний последовательностей.

Сравнение множественных последовательностей по логарифмическому ожиданию (MUSCLE)

Этот метод использует расстояния Кмера и Кимуры для создания множественных выравниваний последовательностей.

Т-Кофе

Этот метод использует древовидные целевые функции согласованности для эволюции выравнивания. Было показано, что этот метод на 5–10% точнее, чем метод Clustal W.

Коэволюционный анализ

Коэволюционный анализ также известен как коррелированная мутация, ковариация или козамена. Этот тип рационального замысла предполагает взаимные эволюционные изменения в эволюционно взаимодействующих локусах. Обычно этот метод начинается с создания тщательно подобранного множественного выравнивания последовательностей для целевой последовательности. Это выравнивание затем подвергается ручному уточнению, которое включает удаление последовательностей с большим количеством пробелов, а также последовательностей с низкой идентичностью последовательностей. Этот шаг повышает качество выравнивания. Затем обработанное вручную выравнивание используется для дальнейших коэволюционных измерений с использованием различных алгоритмов коррелированных мутаций. Эти алгоритмы приводят к созданию матрицы оценок коэволюции. Эта матрица фильтруется с применением различных тестов значимости для извлечения значимых значений коэволюции и устранения фонового шума. Коэволюционные измерения дополнительно оцениваются для оценки их эффективности и строгости. Наконец, результаты этого коэволюционного анализа подтверждаются экспериментально.

Структурный прогноз

Генерация белка de novo выгодна благодаря знанию существующих белковых структур. Эти знания о существующей структуре белка помогают прогнозировать новые структуры белка. Методы предсказания структуры белка относятся к одному из четырех следующих классов: ab initio, методы на основе фрагментов, моделирование гомологии и формирование нитей белка.

С самого начала

Эти методы включают свободное моделирование без использования какой-либо структурной информации о шаблоне. Ab initio методы направлены на предсказание нативной структуры белка, соответствующей глобальному минимуму его свободной энергии. Некоторыми примерами методов ab initio являются AMBER, GROMOS, GROMACS, CHARMM, OPLS и ENCEPP12. Общие шаги для методов ab initio начинаются с геометрического представления интересующего белка. Затем разрабатывается модель функции потенциальной энергии белка. Эта модель может быть создана с использованием потенциалов молекулярной механики или потенциальных функций, полученных из структуры белка. После разработки потенциальной модели к белку применяются методы поиска энергии, включая молекулярно-динамическое моделирование, моделирование Монте-Карло и генетические алгоритмы.

На основе фрагментов

Эти методы используют информацию базы данных о структурах для сопоставления гомологичных структур с созданными белковыми последовательностями. Эти гомологичные структуры собираются в компактные структуры с использованием процедур оценки и оптимизации с целью достижения наименьшего показателя потенциальной энергии. Веб-серверы для информации о фрагментах: I-TASSER, ROSETTA, ROSETTA @ home, FRAGFOLD, CABSfold, PROFESY, CREF, QUARK, UNDERTAKER, HMM и ANGLOR.

Гомологическое моделирование

Эти методы основаны на гомологии белков. Эти методы также известны как сравнительное моделирование. Первым шагом в моделировании гомологии обычно является идентификация шаблонных последовательностей известной структуры, которые гомологичны запрашиваемой последовательности. Затем последовательность запросов выравнивается с последовательностью шаблона. После выравнивания структурно консервативные регионы моделируются с использованием структуры шаблона. Далее следует моделирование боковых цепей и петель, отличных от шаблона. В завершение смоделированная структура подвергается уточнению и оценке качества. Серверы, доступные для данных моделирования гомологии, перечислены здесь: SWISS MODEL, MODELLER, ReformAlign, PyMOD, TIP-STRUCTFAST, COMPASS, 3d-PSSM, SAMT02, SAMT99, HHPRED, FAGUE, 3D-JIGSAW, META-PP, ROSETTA и Я-ТАССЕР.

Белковая нить

Распределение белков можно использовать, когда не удается найти надежный гомолог запрашиваемой последовательности. Этот метод начинается с получения последовательности запросов и библиотеки структур шаблонов. Затем последовательность запросов распределяется по известным структурам шаблонов. Эти модели-кандидаты оцениваются с использованием оценочных функций. Они оцениваются на основе моделей потенциальной энергии как последовательности запроса, так и последовательности шаблонов. Затем выбирается соответствие с моделью с наименьшей потенциальной энергией. Здесь перечислены методы и серверы для получения данных о потоках и выполнения вычислений: GenTHREADER, pGenTHREADER, pDomTHREADER, ORFEUS, PROSPECT, BioShell-Threading, FFASO3, RaptorX, HHPred, сервер LOOPP, Sparks-X, SEGMER, THREADER2, ESYPRED3D, LIBRA, TOPITS. , РАПТОР, КОТ, МАСТЕР.

Для получения дополнительной информации о рациональном дизайне см. Сайт-направленный мутагенез .

Мультивалентное связывание

Основная статья: Поливалентность (химия)

Мультивалентное связывание можно использовать для повышения специфичности и аффинности связывания за счет эффектов авидности . Наличие нескольких доменов связывания в одной биомолекуле или комплексе увеличивает вероятность возникновения других взаимодействий посредством отдельных событий связывания. Авидность или эффективная близость могут быть намного выше, чем сумма отдельных аффинностей, что обеспечивает эффективный с точки зрения затрат и времени инструмент для целевого связывания.

Мультивалентные белки

Мультивалентные белки относительно легко получить путем посттрансляционных модификаций или умножения последовательности ДНК, кодирующей белок. Основное преимущество мультивалентных и мультиспецифических белков состоит в том, что они могут повысить эффективное сродство к мишени известного белка. В случае неоднородной мишени использование комбинации белков, приводящей к мультиспецифическому связыванию, может повысить специфичность, что имеет высокую применимость в белковой терапии.

Наиболее распространенным примером мультивалентного связывания являются антитела, и проводятся обширные исследования биспецифических антител. Применение биспецифических антител охватывает широкий спектр, который включает диагностику, визуализацию, профилактику и терапию.

Направленная эволюция

Основная статья: Направленная эволюция

При направленной эволюции к белку применяется случайный мутагенез , например, с помощью подверженной ошибкам ПЦР или мутагенеза с насыщением последовательностей , а для отбора вариантов, обладающих желаемыми признаками, используется режим отбора. Затем применяются дальнейшие раунды мутации и отбора. Этот метод имитирует естественную эволюцию и в целом дает результаты, превосходящие рациональный дизайн. Дополнительный процесс, называемый перетасовкой ДНК , смешивает и сопоставляет части успешных вариантов для получения лучших результатов. Такие процессы имитируют рекомбинацию , которая происходит естественным образом при половом размножении . Преимущества направленной эволюции заключаются в том, что она не требует предварительных знаний о структуре белка и не требует возможности предсказать, какой эффект будет иметь данная мутация. Действительно, результаты экспериментов по направленной эволюции часто удивляют тем, что желаемые изменения часто вызываются мутациями, от которых не ожидалось какого-либо эффекта. Недостаток заключается в том, что они требуют высокопроизводительного скрининга , который невозможен для всех белков. Большие количества рекомбинантная ДНК должна быть мутирована, а продукты проверены на наличие желаемых признаков. Большое количество вариантов часто требует дорогостоящего роботизированного оборудования для автоматизации процесса. Кроме того, не все желаемые виды деятельности можно легко отследить.

Естественную дарвиновскую эволюцию можно эффективно имитировать в лаборатории, чтобы адаптировать свойства белков для различных применений, включая катализ. Существует множество экспериментальных технологий для создания больших и разнообразных белковых библиотек, а также для скрининга или отбора свернутых функциональных вариантов. Свернутые белки возникают на удивление часто в пространстве случайных последовательностей, и это явление можно использовать при разработке селективных связующих веществ и катализаторов. Хотя редизайн существующих белков путем случайного мутагенеза и отбора/скрининга более консервативен, чем прямой отбор из глубокого пространства последовательностей, он является особенно надежным методом оптимизации или изменения существующих свойств. Он также представляет собой отличную отправную точку для достижения более амбициозных инженерных целей. Объединение экспериментальной эволюции с современными вычислительными методами, вероятно, является самой широкой и самой плодотворной стратегией создания функциональных макромолекул, неизвестных природе.

В недавнем прошлом основные проблемы создания высококачественных библиотек мутантов продемонстрировали значительный прогресс. Этот прогресс выразился в улучшении описания влияния мутационной нагрузки на свойства белков. Кроме того, вычислительные подходы показали значительный прогресс в неисчислимо большом пространстве последовательностей до более управляемых размеров, поддающихся скринингу, что позволило создать умные библиотеки мутантов. Размер библиотеки также был уменьшен до более удобных для скрининга размеров за счет идентификации ключевых полезных остатков с использованием алгоритмов систематической рекомбинации. Наконец, значительный шаг вперед на пути к эффективному реинжинирингу ферментов был сделан благодаря разработке более точных статистических моделей и алгоритмов, позволяющих количественно оценить и предсказать связанные мутационные эффекты на функции белков.

В целом направленную эволюцию можно резюмировать как итеративный двухэтапный процесс, который включает в себя создание библиотек мутантных белков и процессы высокопроизводительного скрининга для отбора вариантов с улучшенными характеристиками. Этот метод не требует предварительных знаний о структуре белка и взаимосвязи функций. Направленная эволюция использует случайный или целенаправленный мутагенез для создания библиотек мутантных белков. Случайные мутации могут быть введены с использованием либо ПЦР, подверженной ошибкам, либо сайт-насыщенного мутагенеза. Мутанты также могут быть созданы с использованием рекомбинации множества гомологичных генов. Природа создала ограниченное количество полезных последовательностей. Направленная эволюция позволяет идентифицировать еще не открытые белковые последовательности, обладающие новыми функциями. Эта способность зависит от способности белков толерантно относиться к заменам аминокислотных остатков без ущерба для сворачивания или стабильности.

Методы направленной эволюции можно разделить на две стратегии: бесполые и сексуальные методы.

Бесполые методы

Бесполые методы не создают перекрестных связей между родительскими генами. Отдельные гены используются для создания мутантных библиотек с использованием различных мутагенных методов. Эти бесполые методы могут вызывать как случайный, так и целенаправленный мутагенез.

Случайный мутагенез

Случайные мутагенные методы вызывают случайные мутации по всему интересующему гену. Случайный мутагенез может вызвать следующие типы мутаций: переходы, трансверсии, инсерции, делеции, инверсии, миссенс и нонсенс. Примеры методов проведения случайного мутагенеза приведены ниже.

ПЦР, подверженная ошибкам

В ПЦР, подверженной ошибкам, используется тот факт, что ДНК-полимераза Taq лишена экзонуклеазной активности от 3' до 5'. Это приводит к частоте ошибок 0,001–0,002% на нуклеотид за репликацию. Этот метод начинается с выбора гена или области внутри гена, которую нужно мутировать. Затем рассчитывается степень требуемой ошибки в зависимости от типа и масштаба деятельности, которую необходимо создать. Степень ошибки определяет используемую стратегию ПЦР, подверженную ошибкам. После ПЦР гены клонируют в плазмиду и вводят в компетентные клеточные системы. Затем эти клетки проверяют на наличие желаемых признаков. Плазмиды затем выделяют для колоний, демонстрирующих улучшенные характеристики, а затем используют в качестве матриц для следующего раунда мутагенеза. Склонная к ошибкам ПЦР показывает отклонения для определенных мутаций по сравнению с другими. Например, предвзятость переходов по сравнению с трансверсиями.

Уровень ошибок в ПЦР можно увеличить следующими способами:

1. Увеличьте концентрацию хлорида магния, который стабилизирует некомплементарные пары оснований.
2. Добавьте хлорид марганца, чтобы уменьшить специфичность пар оснований.
3. Повышенное и несбалансированное добавление дНТФ.
4. Добавление базовых аналогов, таких как dITP, 8 оксо-dGTP и dPTP.
5. Увеличение концентрации Taq-полимеразы.
6. Увеличьте время продления.
7. Увеличьте время цикла.
8. Используйте менее точную Taq-полимеразу.

Также см. Полимеразную цепную реакцию для получения дополнительной информации.

ПЦР с катящимся кругом, подверженная ошибкам

Этот метод ПЦР основан на амплификации по катящемуся кругу, которая смоделирована на основе метода, который бактерии используют для амплификации кольцевой ДНК. Этот метод приводит к получению линейных дуплексов ДНК. Эти фрагменты содержат тандемные повторы кольцевой ДНК, называемые конкатамерами, которые можно трансформировать в бактериальные штаммы. Мутации вводятся путем предварительного клонирования целевой последовательности в соответствующую плазмиду. Затем начинается процесс амплификации с использованием случайных гексамерных праймеров и ДНК-полимеразы Φ29 в условиях амплификации по катящемуся кругу, подверженных ошибкам. Дополнительными условиями для проведения склонной к ошибкам амплификации по типу катящегося круга являются 1,5 пМ матричной ДНК, 1,5 мМ MnCl ₂ и время реакции 24 часа. MnCl ₂ добавляется в реакционную смесь для стимулирования случайных точечных мутаций в цепях ДНК. Скорость мутаций можно повысить, увеличив концентрацию MnCl ₂ или уменьшив концентрацию матричной ДНК. Предрасположенная к ошибкам амплификация по катящемуся кругу имеет преимущество по сравнению с склонной к ошибкам ПЦР из-за использования универсальных случайных гексамерных праймеров, а не специфических праймеров. Также продукты реакции этой амплификации не требуют обработки лигазами или эндонуклеазами. Эта реакция изотермическая.

Химический мутагенез

Химический мутагенез предполагает использование химических агентов для внесения мутаций в генетические последовательности. Ниже приведены примеры химических мутагенов.

Бисульфат натрия эффективен при мутации геномных последовательностей, богатых G/C. Это связано с тем, что бисульфат натрия катализирует дезаминирование неметилированного цитозина до урацила.

Этилметансульфонат алкилирует остатки гуанидина. Это изменение вызывает ошибки во время репликации ДНК.

Азотистая кислота вызывает трансверсию путем деаминирования аденина и цитозина.

Двойной подход к случайному химическому мутагенезу представляет собой итеративный двухэтапный процесс. Сначала он включает in vivo химический мутагенез интересующего гена с помощью EMS. Затем обработанный ген изолируют и клонируют в необработанный вектор экспрессии, чтобы предотвратить мутации в основной цепи плазмиды. Этот метод сохраняет генетические свойства плазмид.

Нацеливание гликозилаз на встроенные массивы для мутагенеза (TaGTEAM)

Этот метод был использован для создания целевого мутагенеза in vivo в дрожжах. Этот метод включает слияние 3-метиладенин-ДНК-гликозилазы с ДНК-связывающим доменом tetR. Было показано, что это увеличивает частоту мутаций более чем в 800 раз в областях генома, содержащих сайты tetO.

Мутагенез путем случайной вставки и делеции

Этот метод включает изменение длины последовательности путем одновременного удаления и вставки фрагментов оснований произвольной длины. Было показано, что этот метод позволяет производить белки с новыми функциональными возможностями за счет введения новых сайтов рестрикции, специфических кодонов и четырехосновных кодонов для неприродных аминокислот.

Случайный мутагенез на основе транспозонов

В последнее время сообщалось о многих методах случайного мутагенеза на основе транспозонов. Эти способы включают, помимо прочего, следующее: случайную круговую перестановку PERMUTE, случайное усечение белка, случайную замену триплета нуклеотидов, случайную вставку домена/метки/множества аминокислот, сканирующий мутагенез кодонов и сканирующий мутагенез мультикодонов. Все эти вышеупомянутые методы требуют создания транспозонов mini-Mu. Компания Thermo Scientific производит наборы для разработки этих транспозонов.

Методы случайного мутагенеза, изменяющие длину целевой ДНК

Эти методы включают изменение длины гена посредством мутаций вставки и делеции. Примером может служить метод вставки тандемных повторов (TRINS). Этот метод приводит к генерации тандемных повторов случайных фрагментов целевого гена посредством амплификации по катящемуся кругу и одновременного включения этих повторов в целевой ген.

Мутаторные штаммы

Штаммы-мутаторы представляют собой линии бактериальных клеток, у которых отсутствует один или несколько механизмов репарации ДНК. Примером мутаторной цепи является E. coli XL1-RED. Этот подчиненный штамм E. coli лишен путей репарации ДНК MutS, MutD, MutT. Использование штаммов-мутаторов полезно для введения многих типов мутаций; однако эти штаммы демонстрируют прогрессирующую болезнь культуры из-за накопления мутаций в собственном геноме штамма.

Целенаправленный мутагенез

Методы целенаправленного мутагенного воздействия вызывают мутации в заранее определенных аминокислотных остатках. Эти методы требуют понимания взаимосвязи последовательность-функция интересующего белка. Понимание этой взаимосвязи позволяет идентифицировать остатки, которые важны для стабильности, стереоселективности и каталитической эффективности. Ниже приведены примеры методов, обеспечивающих целенаправленный мутагенез.

Сайт-насыщенный мутагенез

Сайт-насыщенный мутагенез - это метод, основанный на ПЦР, используемый для нацеливания на аминокислоты, играющие важную роль в функции белка. Двумя наиболее распространенными методами для этого являются однократная ПЦР всей плазмиды и ПЦР с перекрытием.

Одиночная ПЦР всей плазмиды также называется сайт-направленным мутагенезом (SDM). Продукты SDM подвергаются расщеплению эндонуклеазой Dpn. Это расщепление приводит к расщеплению только родительской цепи, поскольку родительская цепь содержит GmATC, который метилирован по N6 аденина. SDM не очень хорошо работает для больших плазмид размером более десяти килобаз. Кроме того, этот метод способен заменять только два нуклеотида одновременно.

ПЦР с перекрытием требует использования двух пар праймеров. Один праймер в каждом наборе содержит мутацию. Проводится первый раунд ПЦР с использованием этих наборов праймеров и образуются два дуплекса двухцепочечной ДНК. Затем проводится второй раунд ПЦР, в ходе которого эти дуплексы денатурируются и снова отжигаются с наборами праймеров для получения гетеродуплексов, в которых каждая цепь имеет мутацию. Любые пробелы в этих вновь образованных гетеродуплексах заполняются ДНК-полимеразами и далее амплифицируются.

Мутагенез с насыщением последовательностей (SeSaM)

Мутагенез с насыщением последовательности приводит к рандомизации целевой последовательности в каждом положении нуклеотида. Этот метод начинается с генерации фрагментов ДНК переменной длины, содержащих универсальные основания, посредством использования матричных трансфераз на 3'-концах. Далее эти фрагменты удлиняются на всю длину с использованием одноцепочечного шаблона. Универсальные основания заменяются случайной стандартной базой, что приводит к мутациям. Существует несколько модифицированных версий этого метода, таких как SeSAM-Tv-II, SeSAM-Tv+ и SeSAM-III.

Параллельные реакции с одним праймером (SPRINP)

Этот метод мутагенеза с насыщением сайта включает две отдельные реакции ПЦР. В первой реакции используются только прямые праймеры, а во второй реакции используются только обратные праймеры. Это позволяет избежать образования праймерного димера.

Мегапраймированный и безлигазный фокусированный мутагенез

Этот мутагенный метод насыщения сайта начинается с одного мутагенного олигонуклеотида и одного универсального фланкирующего праймера. Эти два реагента используются для начального цикла ПЦР. Продукты этого первого цикла ПЦР используются в качестве мегапраймеров для следующей ПЦР.

ом-ПЦР

Этот мутагенный метод насыщения сайтов основан на ПЦР с перекрытием. Он используется для внесения мутаций в любой участок кольцевой плазмиды.

PFunkel-ominchange-OSCARR

В этом методе используется определяемый пользователем сайт-направленный мутагенез в одном или нескольких сайтах одновременно. OSCARR — это аббревиатура от простой методики рандомизации и рекомбинации кассет с одним горшком . Эта рандомизация и рекомбинация приводят к рандомизации желаемых фрагментов белка. Omnichange - это независимый от последовательности многосайтовый насыщенный мутагенез, который может насыщать до пяти независимых кодонов в гене.

Тример-димерный мутагенез

Этот метод удаляет избыточные кодоны и стоп-кодоны.

Кассетный мутагенез

Это метод, основанный на ПЦР. Кассетный мутагенез начинается с синтеза кассеты ДНК, содержащей интересующий ген, которая с обеих сторон окружена сайтами рестрикции. Эндонуклеаза, расщепляющая эти сайты рестрикции, также расщепляет сайты в целевой плазмиде. Кассета ДНК и целевая плазмида обрабатываются эндонуклеазами для расщепления этих сайтов рестрикции и создания липких концов. Затем продукты этого расщепления лигируются вместе, что приводит к вставке гена в целевую плазмиду. Альтернативная форма кассетного мутагенеза, называемая комбинаторным кассетным мутагенезом, используется для идентификации функций отдельных аминокислотных остатков в интересующем белке. Затем рекурсивный ансамблевый мутагенез использует информацию из предыдущего комбинаторного кассетного мутагенеза. Мутагенез кодонной кассеты позволяет вставлять или заменять одиночный кодон в определенном сайте двухцепочечной ДНК.

Сексуальные методы

Сексуальные методы направленной эволюции включают рекомбинацию in vitro , имитирующую естественную рекомбинацию in vivo . Обычно эти методы требуют высокой гомологии последовательностей между родительскими последовательностями. Эти методы часто используются для рекомбинации двух разных родительских генов, и эти методы действительно создают кроссинговеры между этими генами.

in vitro Гомологичная рекомбинация

Гомологичную рекомбинацию можно разделить на in vivo и in vitro. Гомологичная рекомбинация in vitro имитирует естественную рекомбинацию in vivo . Эти методы рекомбинации in vitro требуют высокой гомологии между родительскими последовательностями. Эти методы используют естественное разнообразие родительских генов путем их рекомбинации с получением химерных генов. Получившаяся химера демонстрирует смесь родительских характеристик.

перетасовка ДНК

Этот метод in vitro был одним из первых методов в эпоху рекомбинации. Он начинается с расщепления гомологичных родительских генов на небольшие фрагменты с помощью ДНКазы 1. Эти небольшие фрагменты затем очищаются от непереваренных родительских генов. Очищенные фрагменты затем повторно собираются с помощью ПЦР без праймера. В этой ПЦР используются гомологичные фрагменты разных родительских генов, праймирующие друг друга, в результате чего образуется химерная ДНК. Химерную ДНК родительского размера затем амплифицируют с использованием концевых праймеров в обычной ПЦР.

Случайное праймирование рекомбинации in vitro (RPR)

Этот метод гомологичной рекомбинации in vitro начинается с синтеза множества коротких фрагментов генов, демонстрирующих точечные мутации, с использованием праймеров случайной последовательности. Эти фрагменты повторно собираются в полноразмерные родительские гены с помощью ПЦР без праймеров. Эти повторно собранные последовательности затем амплифицируются с помощью ПЦР и подвергаются дальнейшим процессам отбора. Этот метод имеет преимущество по сравнению с перетасовкой ДНК, поскольку здесь не используется ДНКаза 1, а значит, нет предвзятости в отношении рекомбинации рядом с пиримидиновым нуклеотидом. Этот метод также выгоден благодаря использованию синтетических случайных праймеров, которые имеют одинаковую длину и не имеют систематических ошибок. Наконец, этот метод не зависит от длины матричной последовательности ДНК и требует небольшого количества родительской ДНК.

Усеченная метагеномная геноспецифическая ПЦР

Этот метод генерирует химерные гены непосредственно из метагеномных образцов. Он начинается с выделения нужного гена путем функционального скрининга из образца метагеномной ДНК. Затем разрабатываются и используются специальные праймеры для амплификации гомологичных генов из различных образцов окружающей среды. Наконец, создаются химерные библиотеки для получения желаемых функциональных клонов путем перетасовки этих амплифицированных гомологичных генов.

Поэтапный процесс расширения (StEP)

Этот метод in vitro основан на переключении матрицы для создания химерных генов. Этот метод, основанный на ПЦР, начинается с начальной денатурации матрицы, за которой следует отжиг праймеров и короткое время удлинения. Все последующие циклы генерируют отжиг между короткими фрагментами, созданными в предыдущих циклах, и различными частями шаблона. Эти короткие фрагменты и матрицы отжигаются вместе на основе комплементарности последовательностей. Этот процесс отжига фрагментов ДНК-матрицы известен как переключение матрицы. Эти отожженные фрагменты затем будут служить праймерами для дальнейшего расширения. Этот метод осуществляют до тех пор, пока не будет получена последовательность химерного гена родительской длины. Для реализации этого метода требуются только фланкирующие праймеры. Также нет необходимости в ферменте Dnase1.

Случайный химерагенез на временных матрицах (RACHITT)

Было показано, что этот метод позволяет создавать библиотеки химерных генов со средним числом 14 кроссинговеров на химерный ген. Он начинается с выравнивания фрагментов родительской верхней цепи с нижней цепью матрицы, содержащей урацил гомологичного гена. 5'- и 3'-выступающие лоскуты расщепляются, а пробелы заполняются экзонуклеазной и эндонуклеазной активностью ДНК-полимераз Pfu и taq. Затем содержащую урацил матрицу удаляют из гетеродуплекса путем обработки урацил-ДНК-гликозилазой с последующей амплификацией с помощью ПЦР. Преимущество этого метода заключается в том, что он генерирует химеры с относительно высокой частотой пересечения. Однако он несколько ограничен из-за сложности и необходимости получения одноцепочечной ДНК и урацилсодержащей одноцепочечной матричной ДНК.

Синтетическая перетасовка

Перетасовка синтетических вырожденных олигонуклеотидов добавляет гибкости методам перетасовки, поскольку могут быть включены олигонуклеотиды, содержащие оптимальные кодоны и полезные мутации.

in vivo Гомологичная рекомбинация

Клонирование, выполняемое в дрожжах, включает ПЦР-зависимую повторную сборку фрагментированных векторов экспрессии. Эти повторно собранные векторы затем вводятся и клонируются в дрожжах. Использование дрожжей для клонирования вектора позволяет избежать токсичности и контрселекции, которые могут возникнуть при лигировании и размножении E. coli.

Мутагенный организованный процесс рекомбинации путем гомологичной группировки in vivo (МОРФИНГ)

Этот метод вводит мутации в определенные области генов, оставляя при этом другие части нетронутыми, за счет использования высокой частоты гомологичной рекомбинации у дрожжей.

Непрерывная эволюция с помощью фага (PACE)

Основная статья: Непрерывная эволюция с помощью фагов

В этом методе используется бактериофаг с измененным жизненным циклом для переноса развивающихся генов от хозяина к хозяину. Жизненный цикл фага устроен таким образом, что перенос коррелирует с активностью интересующего фермента. Этот метод выгоден, поскольку требует минимального вмешательства человека для непрерывной эволюции гена.

in vitro. Методы негомологической рекомбинации

Эти методы основаны на том факте, что белки могут проявлять сходную структурную идентичность, но при этом не иметь гомологии последовательностей.

Перетасовка экзонов

Перетасовка экзонов — это объединение экзонов разных белков путем рекомбинации, происходящей в интронах. Перетасовка ортологичных экзонов включает объединение экзонов ортологичных генов разных видов. Перетасовка ортологичных доменов включает перетасовку целых белковых доменов ортологичных генов разных видов. Паралогичная перетасовка экзонов включает перетасовку экзонов разных генов одного и того же вида. Перетасовка паралогичных доменов включает перетасовку целых белковых доменов паралогичных белков одного и того же вида. Перетасовка функциональных гомологов включает перетасовку негомологичных доменов, которые функционально связаны. Все эти процессы происходят с амплификацией нужных экзонов разных генов с использованием химерных синтетических олигонуклеотидов. Эти продукты амплификации затем повторно собираются в полноразмерные гены с помощью ПЦР без праймера. Во время этих циклов ПЦР фрагменты действуют как матрицы и праймеры. В результате получаются химерные полноразмерные гены, которые затем подвергаются скринингу.

Постепенное усечение для создания гибридных ферментов (ITCHY)

Фрагменты родительских генов создаются с помощью контролируемого расщепления экзонуклеазой III. Эти фрагменты затупляются с помощью эндонуклеазы и лигируются с образованием гибридных генов. THIOITCHY — это модифицированная методика ITCHY, в которой используются аналоги нуклеотидтрифосфатов, такие как α-фосфотиоат dNTP. Включение этих нуклеотидов блокирует расщепление экзонуклеазой III. Это ингибирование пищеварения экзонуклеазой III называется пикированием. Добавление может быть достигнуто путем первого усечения генов экзонуклеазой для создания фрагментов с короткими одноцепочечными выступами. Эти фрагменты затем служат матрицами для амплификации ДНК-полимеразой в присутствии небольших количеств фосфотиоатных dNTP. Эти полученные фрагменты затем лигируются вместе с образованием полноразмерных генов. Альтернативно, интактные родительские гены могут быть амплифицированы с помощью ПЦР в присутствии нормальных dNTP и фосфотиоатных dNTP. Эти полноразмерные продукты амплификации затем подвергаются расщеплению экзонуклеазой. Переваривание будет продолжаться до тех пор, пока экзонуклеаза не встретит α-pdNTP, в результате чего образуются фрагменты разной длины. Эти фрагменты затем лигируются вместе для создания химерных генов.

царапающий

Этот метод генерирует библиотеки гибридных генов, ингибирующих множественные кроссинговеры, путем сочетания перетасовки ДНК и ITCHY. Этот метод начинается с создания двух независимых библиотек ITCHY. Первый с геном А на N-конце. А другой имеет ген B на N-конце. Эти гибридные генные фрагменты разделяют либо с помощью расщепления ферментами рестрикции, либо с помощью ПЦР с концевыми праймерами посредством электрофореза в агарозном геле. Эти изолированные фрагменты затем смешивают вместе и дополнительно расщепляют с помощью ДНКазы 1. Переваренные фрагменты затем повторно собираются с помощью ПЦР без праймера с переключением матрицы.

Рекомбинированное расширение по усеченным шаблонам (RETT)

Этот метод генерирует библиотеки гибридных генов путем переключения матрицы однонаправленно растущих полинуклеотидов в присутствии одноцепочечных фрагментов ДНК в качестве матриц для химер. Этот метод начинается с получения одноцепочечных фрагментов ДНК путем обратной транскрипции с целевой мРНК. Затем ген-специфичные праймеры отжигаются с одноцепочечной ДНК. Эти гены затем расширяются во время цикла ПЦР. За этим циклом следует переключение матрицы и отжиг коротких фрагментов, полученных в результате более раннего удлинения праймера, на другие одноцепочечные фрагменты ДНК. Этот процесс повторяется до тех пор, пока не будет получена одноцепочечная ДНК полной длины.

Рекомбинация белков, независимая от гомологии последовательностей (SHIPREC)

Этот метод вызывает рекомбинацию между генами с незначительной гомологией последовательностей или без нее. Эти химеры слиты посредством линкерной последовательности, содержащей несколько сайтов рестрикции. Затем эта конструкция переваривается с помощью ДНКазы1. Фрагменты затупляют с помощью нуклеазы S1. Эти фрагменты с тупыми концами соединяются в круговую последовательность путем лигирования. Эту кольцевую конструкцию затем линеаризуют с использованием ферментов рестрикции, сайты рестрикции которых присутствуют в линкерной области. В результате создается библиотека химерных генов, в которой вклад генов на 5'- и 3'-концы будет обратным по сравнению с исходной конструкцией.

Сайт-направленный химерагенез, независимый от последовательности (SISDC)

В результате этого метода создается библиотека генов с множественными скрещиваниями нескольких родительских генов. Этот метод не требует идентичности последовательностей родительских генов. Для этого требуется одна или две консервативные аминокислоты в каждой позиции кроссовера. Он начинается с выравнивания родительских последовательностей и идентификации консенсусных областей, которые служат сайтами кроссинговера. За этим следует включение специфических меток, содержащих сайты рестрикции, с последующим удалением меток путем расщепления Bac1, что приводит к образованию генов со слипшимися концами. Эти фрагменты генов смешивают и лигируют в соответствующем порядке с образованием химерных библиотек.

Вырожденная гомодуплексная рекомбинация (DHR)

Этот метод начинается с выравнивания гомологичных генов с последующей идентификацией областей полиморфизма. Затем верхняя цепь гена делится на небольшие вырожденные олигонуклеотиды. Нижняя цепь также расщепляется на олигонуклеотиды, которые служат каркасом. Эти фрагменты объединяются в растворе, при этом олигонуклеотиды верхней цепи собираются с олигонуклеотидами нижней цепи. Промежутки между этими фрагментами заполняются полимеразой и лигируются.

Случайная мультирекомбинантная ПЦР (РМ-ПЦР)

Этот метод включает перетасовку множества фрагментов ДНК без гомологии в одной ПЦР. Это приводит к реконструкции полных белков путем сборки модулей, кодирующих различные структурные единицы.

Удобная для пользователя рекомбинация ДНК (USERec)

Этот метод начинается с амплификации фрагментов гена, которые необходимо рекомбинировать, с использованием урациловых dNTP. Этот раствор для амплификации также содержит праймеры, PfuTurbo и ДНК-полимеразу Cx Hotstart. Затем амплифицированные продукты инкубируют с ферментом USER. Этот фермент катализирует удаление остатков урацила из ДНК, создавая разрывы в одну пару оснований. Фрагменты, обработанные ферментом USER, смешивают и лигируют с использованием ДНК-лигазы Т4 и подвергают расщеплению Dpn1 для удаления матричной ДНК. Полученные одноцепочечные фрагменты подвергают амплификации с помощью ПЦР и трансформируют в E.coli.

Рекомбинация перетасовки Золотых Ворот (GGS)

Этот метод позволяет рекомбинировать по меньшей мере 9 различных фрагментов в акцепторном векторе с помощью фермента рестрикции типа 2, который разрезает сайты рестрикции за пределами сайтов рестрикции. Он начинается с субклонирования фрагментов в отдельных векторах для создания фланкирующих последовательностей Bsa1 с обеих сторон. Эти векторы затем расщепляются с помощью фермента рестрикции типа II Bsa1, который генерирует одноцепочечные выступы из четырех нуклеотидов. Фрагменты с комплементарными выступами гибридизуют и лигируют с использованием ДНК-лигазы Т4. Наконец, эти конструкции затем трансформируют в клетки E. coli, которые проверяют на уровень экспрессии.

Метод рекомбинации ДНК на основе фосфортиоата (PRTec)

Этот метод можно использовать для рекомбинации структурных элементов или целых белковых доменов. Этот метод основан на химии тиотиоатов фосфора, которая позволяет специфически расщеплять тиотиофосфорные связи. Первый этап процесса начинается с амплификации фрагментов, которые необходимо рекомбинировать вместе с основной цепью вектора. Эту амплификацию осуществляют с использованием праймеров с фосфортиолированными нуклеотидами на 5'-концах. Амплифицированные продукты ПЦР расщепляют в этанольно-йодном растворе при высоких температурах. Затем эти фрагменты гибридизуются при комнатной температуре и трансформируются в E.coli, которая восстанавливает любые дефекты.

интегрирует

Эта система основана на естественной системе рекомбинации, специфичной для сайта E. coli. Эта система называется системой интегронов и производит естественную перетасовку генов. Этот метод был использован для конструирования и оптимизации функционального оперона биосинтеза триптофана в trp-дефицитной E. coli путем доставки индивидуальных рекомбинационных кассет или генов trpA-E вместе с регуляторными элементами с помощью системы интегронов.

Перетасовка на основе Y-лигирования (YLBS)

Этот метод генерирует одноцепочечные цепи ДНК, которые включают одну блок-последовательность на 5'- или 3'-конце, комплементарные последовательности в области петли стебля и область D-ветви, служащую сайтом связывания праймера для ПЦР. Эквивалентные количества как 5'-, так и 3'-полуцепей смешиваются и образуют гибрид из-за комплементарности в области стебля. Гибриды со свободным фосфорилированным 5'-концом в 3'-полуцепи затем лигируют со свободными 3'-концами в 5'-полунитях с использованием ДНК-лигазы Т4 в присутствии 0,1 мМ АТФ. Лигированные продукты затем амплифицируются с помощью двух типов ПЦР для получения продуктов ПЦР до 5'-половины и до 3'-половины. Эти продукты ПЦР преобразуются в одиночные цепи посредством связывания авидина-биотина с 5'-концом праймов, содержащих стволовые последовательности, меченные биотином. Затем биотинилированные 5'-полуцепи и небиотинилированные 3'-полуцепи используются в качестве 5'- и 3'-полуцепей для следующего цикла Y-лигирования.

Полурациональный дизайн

Полурациональный дизайн использует информацию о последовательности, структуре и функции белков в сочетании с алгоритмами прогнозирования. Вместе они используются для идентификации целевых аминокислотных остатков, которые с наибольшей вероятностью могут повлиять на функцию белка. Мутации этих ключевых аминокислотных остатков создают библиотеки мутантных белков, которые с большей вероятностью будут обладать улучшенными свойствами.

Достижения в области полурациональной инженерии ферментов и разработки ферментов de novo предоставляют исследователям новые мощные и эффективные стратегии манипулирования биокатализаторами. Интеграция подходов, основанных на последовательностях и структурах, при проектировании библиотек оказалась отличным руководством для редизайна ферментов. Как правило, современные методы вычислений de novo и редизайна не идут ни в какое сравнение с развитыми вариантами по каталитическим характеристикам. Хотя экспериментальная оптимизация может быть произведена с использованием направленной эволюции, дальнейшее улучшение точности предсказания структуры и большей каталитической способности будет достигнуто за счет усовершенствования алгоритмов проектирования. Дальнейшие функциональные улучшения могут быть включены в будущие симуляции путем интеграции динамики белков.

Биохимические и биофизические исследования, а также точная настройка прогнозных рамок будут полезны для экспериментальной оценки функциональной значимости отдельных конструктивных особенностей. Лучшее понимание этого функционального вклада даст обратную связь для улучшения будущих проектов.

Направленная эволюция, скорее всего, не будет заменена в качестве предпочтительного метода белковой инженерии, хотя вычислительный дизайн белков фундаментально изменил способ, с помощью которого белковая инженерия может манипулировать биомакромолекулами. Меньшие, более целенаправленные и функционально богатые библиотеки могут быть созданы с использованием методов, которые включают в себя прогностические рамки для инженерии белков, основанной на гипотезах. Новые стратегии проектирования и технические достижения положили начало отходу от традиционных протоколов, таких как направленная эволюция, которая представляет собой наиболее эффективную стратегию выявления наиболее эффективных кандидатов в специализированных библиотеках. Синтез библиотеки цельных генов заменяет протоколы перетасовки и мутагенеза для подготовки библиотек. Кроме того, вместо колоссальных усилий по скринингу и отбору миллионов кандидатов все чаще применяются высокоспецифичные скрининговые анализы с низкой пропускной способностью. В совокупности эти разработки способны вывести белковую инженерию за пределы направленной эволюции и привести к практическим, более эффективным стратегиям адаптации биокатализаторов.

Методы отбора и отбора

После того, как белок подвергся направленной эволюции, разработке рациона или полурационного дизайна, библиотеки мутантных белков должны быть проверены, чтобы определить, какие мутанты проявляют улучшенные свойства. Методы фагового дисплея являются одним из вариантов скрининга белков. Этот метод включает слияние генов, кодирующих вариантные полипептиды, с генами белков фаговой оболочки. Варианты белка, экспрессируемые на поверхности фагов, отбираются путем связывания с иммобилизованными мишенями in vitro. Фаги с выбранными вариантами белка затем амплифицируются в бактериях с последующей идентификацией положительных клонов с помощью иммуноферментного анализа. Эти выбранные фаги затем подвергают секвенированию ДНК.

Системы отображения клеточной поверхности также можно использовать для скрининга библиотек мутантных полипептидов. Мутантные гены библиотеки включаются в векторы экспрессии, которые затем трансформируются в соответствующие клетки-хозяева. Эти клетки-хозяева подвергаются дальнейшим высокопроизводительным методам скрининга для идентификации клеток с желаемыми фенотипами.

Системы бесклеточного дисплея были разработаны для использования трансляции белков in vitro или бесклеточной трансляции. Эти методы включают дисплей мРНК, дисплей рибосом, ковалентный и нековалентный дисплей ДНК и in vitro . компартментализацию

Ферментная инженерия

Ферментная инженерия - это применение модификации структуры фермента (и, следовательно, его функции) или изменения каталитической активности изолированных ферментов для производства новых метаболитов, чтобы обеспечить новые (катализируемые) пути протекания реакций. или превращаться из одних соединений в другие ( биотрансформация ). Эти продукты используются в качестве химикатов, фармацевтических препаратов, топлива, продуктов питания или сельскохозяйственных добавок.

Ферментный реактор состоит из сосуда, содержащего реакционную среду, которую используют для осуществления желаемого превращения ферментативными средствами. Ферменты, используемые в этом процессе, находятся в растворе бесплатно. Кроме того, микроорганизмы являются одним из важных источников происхождения настоящих ферментов.

Примеры сконструированных белков

Вычислительные методы были использованы для создания белка с новой укладкой, такого как Top7 , и датчики неестественных молекул. Разработка слитых белков привела к созданию рилонацепта , фармацевтического препарата, который получил одобрение Управления по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) для лечения криопирин-ассоциированного периодического синдрома .

Другой вычислительный метод, IPRO, успешно спроектировал переключение специфичности кофактора Candida boidinii . ксилозоредуктазы Итеративный редизайн и оптимизация белков (IPRO) изменяет структуру белков для повышения или придания специфичности нативным или новым субстратам и кофакторам . Это делается путем многократного случайного возмущения структуры белков вокруг заданных проектных положений, определения комбинации ротамеров с наименьшей энергией и определения того, имеет ли новый дизайн более низкую энергию связи, чем предыдущие.

Компьютерное проектирование также использовалось для проектирования сложных свойств высокоупорядоченной сборки нанобелков. Белковый каркас, бактериоферритин E. coli (EcBfr), который естественным образом демонстрирует структурную нестабильность и поведение неполной самосборки за счет заполнения двух состояний олигомеризации, является модельным белком в этом исследовании. Путем компьютерного анализа и сравнения с его гомологами было обнаружено, что этот белок имеет димерный интерфейс меньше среднего на своей двойной оси симметрии, главным образом из-за существования межфазного водного кармана, сосредоточенного на двух остатках аспарагина с водными мостиками. . Чтобы исследовать возможность создания EcBfr для модифицированной структурной стабильности, используется полуэмпирический вычислительный метод для виртуального исследования энергетических различий 480 возможных мутантов на димерном интерфейсе по сравнению с EcBfr дикого типа . с водными мостиками Это компьютерное исследование также касается аспарагинов . Замена этих двух аспарагинов гидрофобными аминокислотами приводит к образованию белков, которые сворачиваются в альфа-спиральные мономеры и собираются в клетки, о чем свидетельствуют данные кругового дихроизма и трансмиссионной электронной микроскопии. Как термическая, так и химическая денатурация подтверждают, что все реконструированные белки, в соответствии с расчетами, обладают повышенной стабильностью. Одна из трех мутаций смещает популяцию в пользу состояния олигомеризации более высокого порядка в растворе, как показано как эксклюзионной хроматографией, так и нативным гель-электрофорезом.

Метод in silico , PoreDesigner, был разработан для изменения конструкции белка бактериального канала (OmpF) с целью уменьшения размера его пор размером 1 нм до любого желаемого размера субнанометра. Эксперименты по транспортировке на самых узких порах показали полное отторжение солей при сборке в биомиметические блок-полимерные матрицы.

См. также

• Отображать:
  • Бактериальный дисплей
  • Фаговый дисплей
  • дисплей мРНК
  • Рибосомный дисплей
  • Дрожжевой дисплей
• Биомолекулярная инженерия
• Энзимология
• Расширенный генетический код
• Быстрый параллельный протеолиз (FASTpp)
• Синтез генов
• Генная инженерия
• Циклизация белков in situ
• Аналоги нуклеиновой кислоты
• Программное обеспечение для прогнозирования структуры белка
• Протеомика
• Протеом
• ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ (белковая инженерия)
• Структурная биология
• Синтетическая биология

Внешние ссылки

• серверы для белковой инженерии и смежных тем на базе программного обеспечения WHAT IF
• Ферменты, созданные с нуля : исследователи разрабатывают невиданные ранее катализаторы, используя новую вычислительную технику, Technology Review , 10 марта 2008 г.