✖


Jump to content

Иммунопреципитация хроматина

(Перенаправлен из анализа чипов )
Чип-последовательный рабочий процесс

Иммунопреципитация хроматина ( ЧИП ) является типом экспериментальной техники иммунопреципитации , используемой для изучения взаимодействия между белками и ДНК в клетке. Он направлен на определение того, связаны ли специфические белки с специфическими геномными областями, такими как транскрипционные факторы на промоторах или других сайтах связывания ДНК , и, возможно, определяют цитромы . Чип также направлен на определение конкретного местоположения в геноме, с которым связаны различные модификации гистонов , что указывает на цель модификаторов гистонов. [ 1 ] Чип имеет решающее значение для достижений в области эпигеномики и узнать больше об эпигенетических явлениях. [ 2 ]

Вкратце, обычный метод заключается в следующем:

  1. ДНК и связанные с ними белки на хроматине в живых клетках или тканях сшиваются (этот этап опущен в нативном чипе).
  2. ДНК-белковые комплексы (хроматин-белок) затем сдвигаются на фрагменты ДНК ~ 500 п.н. путем обработки ультразвуком или расщеплением нуклеазы.
  3. Сшитые фрагменты ДНК, связанные с интересующим белком (S), избирательно иммунопреципитируются из клеточного мусора с использованием соответствующего белка-специфического антитела.
  4. Связанные фрагменты ДНК очищаются, и их последовательность определяется. Обогащение специфических последовательностей ДНК представляет области на геноме, что интересный белок связан с in vivo .

Типичный чип

[ редактировать ]

В основном существуют два типа чипа, в основном различающиеся в начальном препарате хроматина. Первый использует обратимо сшитого хроматина, сдвигаемый ультразвуком, называемым сшитым чипом (XCHIP). Native Chip (NCHIP) использует нативный хроматин, сдвинутый микрококковым яростным пищеварением. [ Цитация необходима ]

Сшитый чип (XCHIP)

[ редактировать ]

Сшитый чип в основном подходит для картирования ДНК-мишени транскрипционных факторов или других белков, связанных с хроматином, и использует обратимо сшитого хроматина в качестве начального материала. Агент для обратимого сшивания может быть формальдегидом [ 3 ] или ультрафиолетовый свет . [ 4 ] Затем сшитый хроматин обычно сдвигается ультразвуком, обеспечивая фрагментов из 300-11000 пар длина (п.н.). Мягкое сшивание формальдегида, сопровождаемое перевариванием нуклеазы, использовалось для сдвига хроматина. [ 5 ] Фрагменты хроматина 400 - 500BP оказались подходящими для анализов чипа, поскольку они охватывают два -три нуклеосомы .

Клеточный мусор в сдвигном лизате затем очищается седиментацией, а комплексы белка -ДНК избирательно иммунопреципитируют с использованием специфических антител к интересам белка (ов). Антитела обычно связаны с агарозой , сефарозой или магнитными шариками. Альтернативно, комплексы хроматина-антител могут быть избирательно сохранены и элюированы инертными полимерными дисками. [ 6 ] [ 7 ] Иммунопреципитированные комплексы (т.е. затем собирают и промывают и промывают и промывают для удаления неспецифично связанного хроматина, сшивки белка-ДНК обращаются, и белки удаляют расщеплением белка k . Эпитопная версия интересующего белка или in vivo биотинилирование [ 8 ] может быть использован вместо антител к нативному белку, представляющему интерес.

ДНК, связанная с комплексом, затем очищается и идентифицируется с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), микрочипов ( чип-на-чип ), молекулярного клонирования и секвенирования или прямого высокопроизводительного секвенирования ( CHIP-seq ). [ Цитация необходима ]

Нативный чип (NCHIP)

[ редактировать ]

Нативный чип в основном подходит для картирования ДНК -мишени модификаторов гистонов . Как правило, нативный хроматин используется в качестве начального хроматина. Поскольку гистоны обертывают ДНК с образованием нуклеосом, они естественным образом связаны. Затем хроматин выдвигается с помощью микрококкового расщепления нуклеазы, которое разрезает ДНК на длине линкера, оставляя нуклеосомы неповрежденными и обеспечивая ДНК -фрагменты одной нуклеосомы (200 п.н.) до пяти нуклеосом (1000BP) в длину. После этого методы, аналогичные XCHIP, используются для очистки клеточного мусора, иммунопреципитации интересующего белка, удаляя белок из иммунопреципитированного комплекса, а также очищать и анализируя комплексную ДНК. [ Цитация необходима ]

Сравнение XCHIP и NCHIP

[ редактировать ]

Основным преимуществом NCHIP является специфичность антител . Большинство антител к модифицированным гистонам поднимаются против нефиксированных синтетических пептидных антигенов. Эпитопы , которые они должны распознавать в XCHIP, могут быть нарушены или уничтожены с помощью сшивки формальдегида , особенно в связи с тем, что поперечные соединения, вероятно, будут включать лизинные электронные группы в N-конце, нарушающие эпитопы. Это может объяснить неизменно низкую эффективность протоколов XCHIP по сравнению с NCHIP.

Но XCHIP и NCHIP имеют разные цели и преимущества относительно друг друга. XCHIP предназначен для картирования целевых сайтов транскрипционных факторов и других белков, ассоциированных с хроматином; NCHIP предназначен для отображения целевых сайтов модификаторов гистонов (см. Таблицу 1).

Сравнение чипа-seq и chip-chip

[ редактировать ]

Секвенирование иммунопреципитации хроматина, также известное как CHIP-seq , является экспериментальной техникой, используемой для идентификации событий связывания фактора транскрипции на протяжении всего генома . Знание того, как белки в организме человека взаимодействуют с ДНК для регулирования экспрессии генов, является ключевым компонентом наших знаний о заболеваниях человека и биологических процессах. CHIP-Seq является основным методом для выполнения этой задачи, поскольку оказалось чрезвычайно эффективным для разрешения того, как белки и факторы транскрипции влияют на фенотипические механизмы. Общий чип-seq был очень эффективным методом для определения этих факторов, но есть метод конкуренции, известный как Chip-on-Chip.

Chip-on-Chip , также известный как Chip-Chip, является экспериментальной техникой, используемой для изоляции и идентификации геномных сайтов, занятых специфическими ДНК-связывающими белками в живых клетках. Chip-on-Chip является относительно новой техникой, как это было представлено в 2001 году Пегги Фарнхэмом и Майклом Чжаном. Chip-on-Chip получает свое название, объединив методы иммунопреципитации хроматина и микрочипа ДНК , создавая тем самым чип-чип.

Два метода ищут аналогичные результаты, поскольку они оба стремятся найти сайты связывания белка, которые могут помочь идентифицировать элементы в геноме человека. Эти элементы в человеческом геноме важны для развития знаний в отношении заболеваний человека и биологических процессов. Разница между чип-seq и chip-chip определяется специфическим сайтом идентификации связывания белка. Основное различие заключается в эффективности двух методов, CHIP-Seq дает результаты с более высокой чувствительностью и пространственным разрешением из-за широкого диапазона геномного охвата. Несмотря на то, что Chip-Seq оказался более эффективным, чем Chip-Chip, CHIP-Seq не всегда является первым выбором для ученых. Стоимость и доступность Chip-Seq являются основным недостатком, что привело к более преобладающему использованию чип-чипа в лабораториях по всему миру. [ 2 ]

Эта фотография сравнивает эффективность двух экспериментальных методов, Chip-seq и Chip-Chip.

Таблица 1 Преимущества и недостатки NCHIP и XCHIP

XCHIP Что
Преимущества Подходит для транскрипционных факторов или любых других слабосвязанных белков, связанных с хроматином.
Применимо к любым организмам, где нативного белка трудно подготовить 		Тестируемая специфичность антител
Лучшая специфичность антител как целевой белок естественным образом не поврежден

Лучшая эффективность повторного хроматина и белка благодаря лучшей специфичности антител

Недостатки Неэффективное восстановление хроматина из -за нарушения эпитопа -мишня антител
Может вызвать ложный положительный результат из -за фиксации переходных белков к хроматину
Широкий диапазон размера сдвига хроматина из -за случайного вырезания ультразвуком. 		Обычно не подходит для неистоновых белков
Нуклеосомы могут переставить во время пищеварения

История и новые методы чипа

[ редактировать ]

В 1984 году Джон Т. Лис и Дэвид Гилмор, в то время аспирант в лаборатории LIS, использовали ультрафиолетовое облучение, сшивающее агент с нулевой нулевой кислотой, к ковалентному сшитым белкам, связанным с ДНК в живых бактериальных клетках. После лизиса сшитых клеток и иммунопреципитации бактериальной РНК-полимеразы ДНК, связанной с обогащенной РНК-полимеразой, гибридизовали с зондами, соответствующими различным областям известных генов для определения распределения in vivo и плотности РНК-полимеразы в этих генах. Год спустя они использовали ту же методологию для изучения распределения эукариотической РНК -полимеразы II на генах теплового шока фруктов. Эти отчеты считаются новаторскими исследованиями в области иммунопреципитации хроматина. [ 9 ] [ 10 ] XCHIP был дополнительно модифицирован и разработан Александром Варшавским и коллегами, которые исследовали распределение гистона H4 на генах теплового шока с использованием сшивки формальдегида. [ 11 ] [ 12 ] Этот метод был тщательно разработан и утончен после этого. [ 13 ] Подход NCHIP был впервые описан Hebbes et al ., 1988, [ 14 ] и также был разработан и утончен быстро. [ 15 ] Типичный анализ чипа обычно занимает 4–5 дней и требует 10 6 ~ 10 7 клетки, по крайней мере. Теперь новые методы на чипе могут быть достигнуты всего 100 ~ 1000 ячеек и завершены в течение одного дня.

  • Чип без бисера : в этом новом чипе метода используются диски инертного, пористого полимера, функционализированного либо белком, или G, в спиновых колонках или микропланшетах. Комплекс хроматина-антител избирательно сохраняется диском и элюируется для получения обогащенной ДНК для нижестоящих применений, таких как QPCR и секвенирование. Пористая среда специально разработана для максимизации эффективности захвата и снижения неспецифического связывания. Из -за меньшего ручного обработки и оптимизированных протоколов CHIP может быть выполнен через 5 часов. [ 7 ]
  • Чип -носитель (CCHIP): этот подход может использовать всего лишь 100 клеток, добавляя клетки Drosophila в качестве хроматина -носителя, чтобы уменьшить потери и облегчить осаждение целевого хроматина. Тем не менее, он требует очень специфических праймеров для обнаружения целевого клеточного хроматина на фоне хроматина иностранного носителя, и это занимает два -три дня. [ 16 ]
  • Быстрый чип (QCHIP): анализ быстрого чипа уменьшал время, сокращая два этапа в типичном анализе ChIP: (i) ультразвуковая ванна ускоряет скорость связывания антител с белками-мишенями и тем самым уменьшает время иммунопреципитации II) ( Основанная на основе (CHELEX-100) процедура выделения ДНК уменьшает время реверса сшивки и выделения ДНК. Тем не менее, быстрый протокол подходит только для больших образцов клеток (в диапазоне 10 6 ~10 7 ). [ 17 ] [ 18 ] До 24 образцов хроматина можно обработать до получения ПЦР-готовой ДНК за 5 часов, что позволяет исследовать множественные коэффициенты хроматина одновременно и/или рассматривать геномные события в течение нескольких моментов времени. [ 19 ]
  • Быстрый и количественный чип (Q 2 Чип): в анализе используется 100 000 ячеек в качестве начального материала и подходит для 1000 чипов гистонов или 100 чипов транскрипции. Таким образом, многие образцы хроматина могут быть получены параллельно и хранятся, и Q 2 Чип может быть предпринят через день. [ 20 ]
  • Microchip (μChip): хроматин обычно готовится из 1000 клеток, а до 8 чипов можно выполнять параллельно без носителей. Анализ также может начинаться с 100 ячеек, но только для одного чипа. Он также может использовать маленький (1 мм 3 ткани ) Биопсия и микрочип могут быть сделаны в течение одного дня. [ 21 ] [ 22 ]
  • Матричный чип : это анализ микропланшетов на основе микропланшетов с увеличением пропускной способности и упрощенной процедурой. Все шаги сделаны в микропланшетных лунках без пробы пробов, что обеспечивает потенциал для автоматизации. Это позволяет 96 анализов чипа для гистонов и различных ДНК-связанных белков за один день. [ 23 ]
  • Патологическая чипа (Pat-chip): этот метод позволяет чип из фиксированных формалин-фиксированных и парафиновых тканей и, следовательно, использования архивов патологии (даже те, которые в течение нескольких лет) для эпигенетического анализа и идентификации эпигенетических биомаркеров-кандидатов цели. [ 24 ]

Чип также был применен для анализа по всему геному путем объединения с технологией микрочипов ( Chip-on-Chip ) или технологии ДНК-секвенирования второго поколения ( чип-секвенирование ). Чип также может сочетаться с секвенированием меток парных тегов в анализе взаимодействия хроматина с использованием парного секвенирования конечных меток (CHIA-PET), метода, разработанного для крупномасштабного анализа DE Novo структур хроматина высшего порядка. [ 25 ] [ 26 ] [ 27 ]

Ограничения

[ редактировать ]
  • Крупномасштабные анализы с использованием чипа сложны с использованием интактных модельных организмов. Это связано с тем, что антитела должны быть получены для каждого TF, или, в качестве альтернативы, необходимо продуцировать трансгенные модели организмов, экспрессирующих эпитопные TF.
  • Исследователи, изучающие дифференциальные паттерны экспрессии генов в небольших организмах, также сталкиваются с проблемами как гены, экспрессируемые на низких уровнях, в небольшом количестве клеток, в узком времени.
  • Эксперименты по чипам не могут различать различные изоформы TF ( изоформа белка ).

Смотрите также

[ редактировать ]
  • Chip-Exo , метод, который добавляет обработку экзонуклеазы к процессу чипа, чтобы получить до единого оснований пары оснований сайтов связывания
  • Чип-на-чип , объединяет чип с технологией микрочипов
  • Дамид , альтернативный метод картирования местоположения, который не требует определенных антител
  • Rip-Chip , аналогичная методика для анализа взаимодействия РНК-белков

Ссылки

[ редактировать ]
  1. ^ Коллас, Филипп. (Январь 2010). «Текущее состояние иммунопреципитации хроматина». Молекулярная биотехнология . 45 (1): 87–100. doi : 10.1007/s12033-009-9239-8 . PMID   20077036 . S2CID   24225210 .
  2. ^ Подпрыгнуть до: а беременный Розенфельд, Джон М; Кук, Трейси; Ли, Зиронг; Сайто, Кан; Таганов, Константин; Тхагараджан, Бхаскар; Солач, Алехандра (март 2013 г.). «Систематическая оптимизация параметров, связанных с подготовкой рабочего процесса хроматина и хроматина иммунопреципитации (CHIP)» . Эпигенетика и хроматин . 6 (S1): P122, 1756–8935–6-S1-P122. doi : 10.1186/1756-8935-6-S1-P122 . ISSN   1756-8935 . PMC   3620580 .
  3. ^ Джексон, Вон (ноябрь 1978 г.). «Исследования по организации гистонов в нуклеосоме с использованием формальдегида в качестве обратимого сшивающего агента». Клетка . 15 (3): 945–54. doi : 10.1016/0092-8674 (78) 90278-7 . PMID   569554 . S2CID   25169609 .
  4. ^ Gilmour DS, LIS JT (август 1985 г.). «Взаимодействие in vivo РНК -полимеразы II с генами Drosophila melanogaster » . Молекулярная и клеточная биология . 5 (8): 2009–18. doi : 10.1128/mcb.5.8.2009 . PMC   366919 . PMID   3018544 .
  5. ^ Bauer UM, Daujat S, Nielsen SJ, Nightingale K, Kouzarides T (январь 2002 г.). «Метилирование у аргинина 17 гистона H3 связано с активацией генов» . Embo сообщает . 3 (1): 39–44. doi : 10.1093/embo-reports/kvf013 . PMC   1083932 . PMID   11751582 .
  6. ^ Бейнон, Эми Л.; Паркс, Линдсей Дж.; Тернер, Мэтью Л.; Рыцарь, Стив; Конлан, Стив; Фрэнсис, Льюис; Акции, Бен (сентябрь 2014 г.). «Chromatrap 96: новая твердотельная платформа для высокопроизводительного чипа» . Природные методы . 11 (9): I - II. doi : 10.1038/nmeth.f.372 . ISSN   1548-7091 .
  7. ^ Подпрыгнуть до: а беременный «Хроматрап» . Революционная твердотельная платформа для хроматиновой иммунопрециптации.
  8. ^ Винс А; и др. (2004). «Использование белкового биотинилирования in vivo для иммунопреципитации хроматина». Аналитическая биохимия . 325 (1): 68–76. doi : 10.1016/j.ab.2003.10.015 . PMID   14715286 .
  9. ^ Gilmour DS, LIS JT (1984). «Обнаружение взаимодействия белка-ДНК in vivo: распределение РНК-полимеразы на специфических бактериальных генах» . Proc Natl Acad Sci USA . 81 (14): 4275–9. Bibcode : 1984pnas ... 81.4275g . doi : 10.1073/pnas.81.14.4275 . PMC   345570 . PMID   6379641 .
  10. ^ Gilmour DS, LIS JT (август 1985 г.). «Взаимодействие in vivo РНК -полимеразы II с генами Drosophila melanogaster» . Мол Клетка. Биол . 5 (8): 2009–18. doi : 10.1128/mcb.5.8.2009 . PMC   366919 . PMID   3018544 .
  11. ^ Варшавский А (декабрь 2008 г.). «Обнаружение клеточной регуляции путем деградации белка» . Журнал биологической химии . 283 (50): 34469–89. doi : 10.1074/jbc.x800009200 . PMC   3259866 . PMID   18708349 .
  12. ^ Соломон, Марк Дж; Ларсен Памела L; Варшавский, Александр. (Июнь 1988 г.). «Картирование взаимодействий белка-ДНК in vivo с формальдегидом: доказательства того, что гистон H4 сохраняется на высоко транскрибированном гене». Клетка . 53 (6): 937–47. doi : 10.1016/s0092-8674 (88) 90469-2 . PMID   2454748 . S2CID   11169130 .
  13. ^ Орландо V (март 2000 г.). «Картирование хромосомных белков in vivo с помощью иммунопреципитации с формальдегидом-кроссоцитом хроматина». Тенденции в биохимических науках . 25 (3): 99–104. doi : 10.1016/s0968-0004 (99) 01535-2 . PMID   10694875 .
  14. ^ Hebbes, Тим Р; Торн, Алан В; Крэйн-Робинсон С (май 1988). «Прямая связь между ацетилированием основного гистона и транскрипционно активным хроматином» . Embo Journal . 7 (5): 1395–402. doi : 10.1002/j.1460-2075.1988.tb02956.x . PMC   458389 . PMID   3409869 .
  15. ^ О'Нил, Лора П; Тернер, Брайан М (сентябрь 2003 г.). «Иммунопреципитация нативного хроматина: NCHIP». Методы ​ 31 (1): 76–82. doi : 10.1016/s1046-2023 (03) 00090-2 . PMID   12893176 .
  16. ^ О'Нил, Лора П; Vermilyea, Matthew D; Тернер, Брайан М (июль 2006 г.). «Эпигенетическая характеристика раннего эмбриона с протоколом иммунопреципитации хроматина, применимых к небольшим клеточным популяциям». Природа генетика . 38 (7): 835–41. doi : 10.1038/ng1820 . PMID   16767102 . S2CID   28311996 .
  17. ^ Нельсон, Джоэл Д; Денизенко, Олег; Сова, Павел; Bomsztyk, Karol (2006). «Анализ быстрого иммунопреципитации хроматина» . Исследование нуклеиновых кислот . 34 (1): E2. doi : 10.1093/nar/gnj004 . PMC   1325209 . PMID   16397291 .
  18. ^ Нельсон, Джоэл Д; Денизенко, Олег; Bomsztyk, Karol (2006). «Протокол для метода быстрой иммунопреципитации (чип) быстрого хроматина». Природные протоколы . 1 (1): 179–85. doi : 10.1038/nprot.2006.27 . PMID   17406230 . S2CID   20577722 .
  19. ^ Нельсон Дж., Денизенко О., Бомзтик К. (2009). «Метод быстрого иммунопреципитации хроматина». Анализы иммунопреципитации хроматина . Методы в молекулярной биологии . Тол. 567. С. 45–57. doi : 10.1007/978-1-60327-414-2_3 . ISBN  978-1-60327-413-5 Полем PMID   19588084 .
  20. ^ Дал, Джон Арн; Коллас, Филипп (апрель 2007 г.). "Q. 2 Чип, быстрый и количественный анализ иммунопреципитации хроматина, раскрывает эпигенетическую динамику генов, регулируемых развитием, в клетках карциномы человека » . Стволовые клетки . 25 (4): 1037–46. DOI : 10.1634/Stemcells.2006-0430 . PMID   17272500 .
  21. ^ Дал, Джон Арн; Collas, Philippe (2008). «Анализ быстрого иммунопреципитации микро -хроматина (Microchip)». Природные протоколы . 3 (6): 1032–45. doi : 10.1038/nprot.2008.68 . PMID   18536650 . S2CID   29529307 .
  22. ^ Дал, Джон Арн; Collas, Philippe (2009). «µChip: хроматин иммунопреципитация для небольших клеточных чисел». Анализы иммунопреципитации хроматина . Методы в молекулярной биологии . Тол. 567. С. 59–74. doi : 10.1007/978-1-60327-414-2_4 . ISBN  978-1-60327-413-5 Полем PMID   19588085 .
  23. ^ Фланагин, Стив; Нельсон, Джоэл Д; Кастнер, Дэвид Г; Денизенко, Олег; Bomsztyk, Карол (февраль 2008 г.). «Метод иммунопреципитации на основе микропланшетов, Matrix Chip: платформа для изучения передачи сигналов сложных геномных событий» . Исследование нуклеиновых кислот . 36 (3): E17. doi : 10.1093/nar/gkn001 . PMC   2241906 . PMID   18203739 .
  24. ^ Фанелли, Мирко; Аматори, Стефано; Barozzi, iros; Сончини, Матиас; Зуфо, Роберто Дал; Буччи, Габриэле; Капра, Мария; Кварто, Микаэла; Dellino, Gaetano Ivan (2010-12-14). «Патологическая ткани-хроматин иммунопреципитация в сочетании с высокопроизводительным секвенированием позволяет эпигенетическое профилирование образцов пациентов» . Труды Национальной академии наук . 107 (50): 21535–21540. Bibcode : 2010pnas..10721535f . doi : 10.1073/pnas.1007647107 . ISSN   0027-8424 . PMC   3003125 . PMID   21106756 .
  25. ^ Фунвуд, Мелисса Дж; Хан, Ююань; Вэй, Чиа-Лин; Руан, Сяоан; Руан, Иджун (январь 2010 г.). Анализ взаимодействия хроматина с использованием секвенирования тегов парного тега . Тол. Глава 21. С. Блок 21.15.1–25. doi : 10.1002/0471142727.mb2115s89 . ISBN  978-0471142720 Полем PMC   6924956 . PMID   20069536 . {{cite book}}: |journal= игнорируется ( помощь )
  26. ^ Ли, Гуолиан; Фунвуд, Мелисса Дж; Сюй, Хан; Мулавади, Фабиан Хендриан; Велков, Стоян; Вега, Винсенсиус; Арияратне, Прамила Нуванта; Мохамед, Юсофф Бин; Оои, Хонг-Сейн; Теннакун, Чандана; Вэй, Чиа-Лин; Руан, Иджун; Sung, Wing-kin (февраль 2010 г.). «Инструмент Chia-Pet для комплексного анализа взаимодействия хроматина с последовательностями парного тега» . Биология генома . 11 (2): R22. doi : 10.1186/gb-2010-11-2-r22 . PMC   2872882 . PMID   20181287 .
  27. ^ «Chia-Pet: новый метод для трехмерного исследования картирования целого генома» . Scienceday . Агентство по науке, технологиям и исследованиям (A*Star), Сингапур. 2009-11-08 . Получено 14 марта 2010 года .
[ редактировать ]
Wikimedia Commons имеет средства массовой информации, связанные с хроматиновым иммунопреципитацией .
Retrieved from "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Chromatin_immunoprecipitation&oldid=1234041465"
Arc.Ask3.Ru: конец переведенного документа.
Arc.Ask3.Ru
Номер скриншота №: e298563a9fe8e75881443a2651edea3b__1720761420
URL1:https://arc.ask3.ru/arc/aa/e2/3b/e298563a9fe8e75881443a2651edea3b.html
Заголовок, (Title) документа по адресу, URL1:
Chromatin immunoprecipitation - Wikipedia
Данный printscreen веб страницы (снимок веб страницы, скриншот веб страницы), визуально-программная копия документа расположенного по адресу URL1 и сохраненная в файл, имеет: квалифицированную, усовершенствованную (подтверждены: метки времени, валидность сертификата), открепленную ЭЦП (приложена к данному файлу), что может быть использовано для подтверждения содержания и факта существования документа в этот момент времени. Права на данный скриншот принадлежат администрации Ask3.ru, использование в качестве доказательства только с письменного разрешения правообладателя скриншота. Администрация Ask3.ru не несет ответственности за информацию размещенную на данном скриншоте. Права на прочие зарегистрированные элементы любого права, изображенные на снимках принадлежат их владельцам. Качество перевода предоставляется как есть. Любые претензии, иски не могут быть предъявлены. Если вы не согласны с любым пунктом перечисленным выше, вы не можете использовать данный сайт и информация размещенную на нем (сайте/странице), немедленно покиньте данный сайт. В случае нарушения любого пункта перечисленного выше, штраф 55! (Пятьдесят пять факториал, Денежную единицу (имеющую самостоятельную стоимость) можете выбрать самостоятельно, выплаичвается товарами в течение 7 дней с момента нарушения.)