Варианты ПЦР
Универсальность полимеразной цепной реакции (ПЦР) привела к модификации основного протокола, используемого в большом количестве вариантов методов, предназначенных для различных целей. В этой статье обобщены многие из наиболее распространенных вариантов, которые в настоящее время или ранее использовались в молекулярной биологии лабораториях ; Для понимания этих вариантов методов необходимо знакомство с фундаментальной предпосылкой работы ПЦР и соответствующими терминами и понятиями.
Базовые модификации
[ редактировать ]Часто для достижения желаемой цели необходимо внести лишь небольшую модификацию в стандартный протокол ПЦР:
В мультиплексной ПЦР используется несколько пар праймеров, гибридизующихся с разными целевыми последовательностями. Это позволяет одновременно анализировать несколько целей в одном образце. Например, при тестировании на генетические мутации можно объединить шесть или более амплификаций. В стандартном протоколе дактилоскопии ДНК анализируемые мишени часто амплифицируются в группах по 3 или 4. Мультиплексная амплификация зондов, зависимая от лигирования ( MLPA ), позволяет амплифицировать несколько мишеней с использованием только одной пары праймеров, избегая ограничений разрешения мультиплекса. ПЦР. Мультиплексная ПЦР также использовалась для анализа микросателлитов и SNP . [ 1 ]
ПЦР с переменным числом тандемных повторов (VNTR) нацелена на повторяющиеся области генома, длина которых варьируется . Анализ генотипов в образцах обычно включает определение размеров продуктов амплификации с помощью гель-электрофореза . Анализ более мелких сегментов VNTR, известных как короткие тандемные повторы (или STR), является основой для по дактилоскопии ДНК, баз данных таких как CODIS .
Асимметричная ПЦР предпочтительно амплифицирует одну цепь двухцепочечной ДНК-мишени. Он используется в некоторых методах секвенирования и гибридизации для получения одной цепи ДНК в качестве продукта. Термоциклирование проводят точно так же, как и в обычной ПЦР, но с ограничением количества или без учета одного из праймеров. Когда лимитирующий праймер истощается, репликация увеличивается арифметически , а не экспоненциально за счет расширения избыточного праймера. [ 2 ] В модификации этого процесса, получившей название Linear After- - The - - Exponential PCR (или LATE-PCR ), используется ограничивающий праймер с более высокой температурой плавления (T m ), чем у избыточного праймера, чтобы поддерживать эффективность реакции. поскольку предельная концентрация праймера снижается в середине реакции. [ 3 ] См. также ПЦР с перекрытием-удлинением .
необходимы некоторые модификации Для выполнения длинной ПЦР . Первоначальный процесс ПЦР на основе Кленова не давал продуктов размером более 400 п.н. Однако Taq-полимераза может амплифицировать мишени длиной до нескольких тысяч пар оснований. [ 4 ] С тех пор модифицированные протоколы с использованием фермента Taq позволили амплифицировать мишени размером более 50 т.п.н. [ 5 ]
Вложенная ПЦР используется для повышения специфичности амплификации ДНК. В двух последовательных реакциях используются два набора праймеров. В первой ПЦР одна пара праймеров используется для генерации продуктов ДНК, которые могут содержать продукты, амплифицированные из нецелевых областей. Продукты первой ПЦР затем используются в качестве матрицы во второй ПЦР с использованием одного («геми-гнездование») или двух разных праймеров, сайты связывания которых расположены (вложены) в первый набор, что повышает специфичность. Вложенная ПЦР часто более успешна в специфической амплификации продуктов длинной ДНК, чем обычная ПЦР, но требует более детального знания последовательности-мишени.
Количественная ПЦР ( кПЦР ) используется для измерения определенного количества целевой ДНК (или РНК) в образце. Измеряя усиление только в фазе истинного экспоненциального увеличения, количество измеряемого продукта более точно отражает исходное целевое количество. Используются специальные термоциклеры, которые контролируют количество продукта во время амплификации.
Количественная ПЦР в реальном времени ( QRT-PCR ), иногда просто называемая ПЦР в реальном времени ( RT-PCR ), относится к набору методов, в которых используются флуоресцентные красители, такие как Sybr Green, или содержащие флуорофор зонды ДНК, такие как TaqMan. , для измерения количества амплифицированного продукта в режиме реального времени по мере продвижения амплификации.
ПЦР с горячим стартом — это метод, выполняемый вручную путем нагревания компонентов реакции до температуры плавления ДНК (например, 95 °C) перед добавлением полимеразы. Таким образом предотвращается неспецифическая амплификация при более низких температурах. [ 6 ] Альтернативно, специализированные реагенты ингибируют активность полимеразы при температуре окружающей среды либо за счет связывания антитела , либо за счет присутствия ковалентно связанных ингибиторов, которые диссоциируют только после стадии высокотемпературной активации. «ПЦР с горячим стартом/холодным финишем» достигается с помощью новых гибридных полимераз, которые неактивны при температуре окружающей среды и активируются только при повышенных температурах.
При контактной ПЦР температура отжига постепенно снижается в последующих циклах. Температура отжига в ранних циклах обычно на 3–5 °C выше стандартной T m используемых праймеров, тогда как в более поздних циклах она на такую же величину ниже T m . Начальная более высокая температура отжига приводит к большей специфичности связывания праймера, тогда как более низкие температуры обеспечивают более эффективную амплификацию в конце реакции. [ 7 ]
Сборочная ПЦР (также известная как полимеразная циклическая сборка или PCA ) — это синтез длинных структур ДНК путем выполнения ПЦР на пуле длинных олигонуклеотидов с короткими перекрывающимися сегментами для сборки двух или более частей ДНК в одну часть. Он включает в себя первоначальную ПЦР с перекрывающимися праймерами и вторую ПЦР с использованием продуктов в качестве матрицы, в результате которой получается окончательный полноразмерный продукт. Этот метод может заменить сборку на основе лигирования . [ 8 ]
При ПЦР колоний бактериальные колонии проверяются непосредственно с помощью ПЦР, например, на наличие правильных векторных конструкций ДНК. Колонии отбирают стерильной пипеткой и небольшое количество клеток переносят в смесь для ПЦР. Чтобы высвободить ДНК из клеток, ПЦР начинают либо с увеличенным временем при 95 °C (когда используется стандартная полимераза), либо с сокращенной стадии денатурации при 100 °C и специальной химерной ДНК-полимеразы. [ 9 ]
Цифровая полимеразная цепная реакция одновременно амплифицирует тысячи образцов, каждый в отдельной капле внутри эмульсии или в перегородке внутри микролунки.
Суицидная ПЦР обычно используется в палеогенетике или других исследованиях, где избежание ложноположительных результатов и обеспечение специфичности амплифицированного фрагмента является наивысшим приоритетом. Первоначально он был описан в исследовании по проверке присутствия микроба Yersinia pestis в образцах зубов, полученных из могил людей XIV века, предположительно умерших от чумы во время средневековой эпидемии Черной смерти . [ 10 ] Этот метод предписывает использование любой комбинации праймеров только один раз в ПЦР (отсюда и термин «самоубийство»), что никогда не должно использоваться в какой-либо реакции ПЦР с положительным контролем, и праймеры всегда должны быть нацелены на область генома, которая никогда ранее не амплифицировалась в ПЦР. лаборатории, используя этот или любой другой набор праймеров. Это гарантирует, что в лаборатории не будет примеси ДНК из предыдущих реакций ПЦР, что в противном случае могло бы привести к ложноположительным результатам.
ХОЛОДНАЯ ПЦР ( совместная амплификация при более низкой температуре денатурации -ПЦР) представляет собой модифицированный протокол, который обогащает варианты аллелей из смеси образцов ДНК дикого типа и содержащих мутации.
Предварительная обработка и расширение
[ редактировать ]Базовый процесс ПЦР иногда может предшествовать другому методу или следовать за ним.
ОТ-ПЦР (или транскрипцией с обратной ) ПЦР амплификации используется для обратной транскрипции и РНК до кДНК . ПЦР предшествует реакция с использованием обратной транскриптазы — фермента, превращающего РНК в кДНК. Две реакции можно объединить в пробирке, при этом начальный этап нагревания ПЦР используется для инактивации транскриптазы. [ 4 ] Tth-полимераза (описанная ниже) обладает активностью RT и может осуществлять всю реакцию. RT-PCR широко используется для определения профиля экспрессии , позволяющего обнаружить экспрессию гена. Его также можно использовать для получения последовательности транскрипта РНК, что может помочь в определении сайтов начала и окончания транскрипции (с помощью RACE-PCR ) и облегчить картирование местоположения экзонов и интронов в последовательности гена.
В двусторонней ПЦР используется один праймер, который связывается с мишенью микроРНК как с 3'-, так и с 5'-концами, известными как гемизонды. [ 11 ] Для того чтобы произошло связывание, оба конца должны быть дополняющими друг друга. Затем 3'-конец удлиняется обратной транскриптазой, образуя длинную кДНК. Затем кДНК амплифицируют с использованием двух праймеров для ПЦР, специфичных для мишени. Комбинация двух полузондов, оба нацеленных на короткую мишень микроРНК, делает двусторонний анализ чрезвычайно чувствительным и специфичным.
В ПЦР, опосредованной лигированием, используются небольшие ДНК-олигонуклеотидные «линкеры» (или адаптеры), которые сначала лигируются с фрагментами целевой ДНК. Праймеры для ПЦР, которые гибридизуются с последовательностями линкера, затем используются для амплификации целевых фрагментов. Этот метод применяется для секвенирования ДНК, прогулки по геному и отслеживания ДНК . [ 12 ] Родственный метод — амплифицированный полиморфизм длины фрагментов , который генерирует диагностические фрагменты генома.
ПЦР, специфичная для метилирования ( MSP ), используется для выявления закономерностей метилирования ДНК на цитозин-гуаниновых (CpG) островах в геномной ДНК. [ 13 ] Целевую ДНК сначала обрабатывают бисульфитом натрия , который превращает неметилированные основания цитозина в урацил , который комплементарен аденозину в праймерах для ПЦР. Затем проводят две амплификации ДНК, обработанной бисульфитом: один праймер устанавливает отжиг ДНК с цитозином (соответствует метилированному цитозину), а другой устанавливает отжиг ДНК с урацилом (соответствует неметилированному цитозину). MSP, используемый в количественной ПЦР, предоставляет количественную информацию о состоянии метилирования данного CpG-островка. [ 14 ]
Другие модификации
[ редактировать ]Регулировка компонентов в ПЦР обычно используется для достижения оптимальной производительности.
Двухвалентный ион магния (Mg ++ ) необходим для активности полимеразы ПЦР. Более низкие концентрации Mg ++ повысит точность репликации, а более высокие концентрации приведут к большему количеству мутаций. [ 15 ]
Денатуранты (такие как ДМСО ) могут повысить специфичность амплификации за счет дестабилизации связывания неспецифического праймера. Другие химические вещества, такие как глицерин , являются стабилизаторами активности полимеразы во время амплификации. Моющие средства (такие как Triton X-100 ) могут предотвратить прилипание полимеразы к себе или к стенкам реакционной пробирки.
ДНК-полимеразы иногда включают несовпадающие основания в удлиняющуюся цепь. В высокоточной ПЦР используются ферменты с 3'-5'- экзонуклеазной активностью, что снижает вероятность неправильного включения. Примеры ферментов с корректирующей активностью включают Pfu ; корректировки Mg ++ а концентрации dNTP могут помочь максимизировать количество продуктов, которые точно соответствуют исходной целевой ДНК. [ нужна ссылка ]
Модификации праймера
[ редактировать ]Корректировка синтетических олигонуклеотидов, используемых в качестве праймеров в ПЦР, является богатым источником модификаций:
Обычно праймеры для ПЦР выбираются из инвариантной части генома и могут использоваться для амплификации полиморфной области между ними. В аллель-специфической ПЦР происходит обратное. По крайней мере, один из праймеров выбирают из полиморфной области, мутации которой расположены на (или вблизи) ее 3'-конце. В строгих условиях несовпадающий праймер не будет инициировать репликацию, тогда как совпадающий праймер будет инициировать репликацию. Таким образом, появление продукта амплификации указывает на генотип. (Для получения дополнительной информации см. Генотипирование SNP .)
InterSequence-Specific PCR (или ISSR-PCR ) — это метод снятия отпечатков пальцев ДНК , в котором используются праймеры, выбранные из сегментов, повторяющихся по всему геному, для создания уникального отпечатка пальца амплифицированных длин продуктов. [ 16 ] Использование праймеров из часто повторяющегося сегмента называется Alu-PCR и может помочь амплифицировать последовательности, расположенные рядом (или между) этими повторами.
Праймеры также могут быть «вырожденными» — способными инициировать репликацию из большого количества целевых мест. Полногеномная амплификация (или WGA ) — это группа процедур, которые позволяют проводить амплификацию во многих местах неизвестного генома и которые могут быть доступны только в небольших количествах. В других методах используются вырожденные праймеры , которые синтезируются с использованием нескольких нуклеотидов в определенных положениях (полимераза «выбирает» правильно подобранные праймеры). Кроме того, праймеры можно синтезировать с аналогом нуклеозида инозином , который гибридизуется с тремя из четырех нормальных оснований. Подобный метод может заставить ПЦР выполнить сайт-направленный мутагенез . (также см. Полимеразную цепную реакцию с перекрывающимся расширением )
Обычно праймеры, используемые в ПЦР, полностью дополняют мишень. Однако полимераза толерантна к неправильным совпадениям за пределами 3'-конца. Хвостовые праймеры включают некомплементарные последовательности на своих 5'-концах. Распространенной процедурой является использование линкер-праймеров , которые в конечном итоге размещают сайты рестрикции на концах продуктов ПЦР, облегчая их последующую вставку в векторы клонирования.
Расширением метода «ПЦР колоний» (см. выше) является использование векторных праймеров . Фрагменты целевой ДНК (или кДНК) сначала встраиваются в вектор клонирования , и для областей вектора, фланкирующих сайт вставки, разрабатывается один набор праймеров. Амплификация происходит для любой ДНК, которая была вставлена. [ 4 ]
ПЦР можно легко модифицировать для получения меченого продукта для последующего использования в качестве зонда гибридизации . В ПЦР можно использовать один или оба праймера с уже прикрепленной радиоактивной или флуоресцентной меткой, либо метки можно добавлять после амплификации. Эти методы мечения можно комбинировать с «асимметричной ПЦР» (см. выше) для получения эффективных зондов гибридизации.
РНКаза H-зависимая ПЦР (рчПЦР) может уменьшить образование праймеров-димеров и увеличить количество анализов в мультиплексной ПЦР. В методе используются праймеры с расщепляемым блоком на 3'-конце, который удаляется под действием термостабильного фермента РНКазы HII. [ 17 ]
ДНК-полимеразы
[ редактировать ]В ПЦР используется несколько ДНК-полимераз.
Фрагмент Кленова , полученный из исходной ДНК-полимеразы I из E. coli , был первым ферментом, использованным в ПЦР. Из-за отсутствия стабильности при высокой температуре его необходимо пополнять во время каждого цикла, поэтому он обычно не используется в ПЦР.
ДНК-полимераза бактериофага Т4 (семейство А) также первоначально использовалась в ПЦР. Он имеет более высокую точность репликации, чем фрагмент Кленова, но также разрушается при нагревании. ДНК-полимераза Т7 (семейство B) имеет схожие свойства и назначение. Он был применен для сайт-направленного мутагенеза. [ 18 ] и секвенирование по Сэнгеру . [ 19 ]
Taq -полимераза, ДНК-полимераза I из Thermus aquaticus , была первой термостабильной полимеразой, используемой в ПЦР, и до сих пор используется наиболее часто. Фермент может быть выделен из его природного источника или из его клонированного гена, экспрессируемого в E.coli . [ 4 ] Усеченный из-за отсутствия 5'-3'-экзонуклеазной активности фрагмент размером 61 кДа известен как фрагмент Стоффеля и экспрессируется в E. coli . [ 20 ] Отсутствие экзонуклеазной активности может позволить ему амплифицировать более длинные мишени, чем нативный фермент. Он был коммерциализирован как AmpliTaq и Klentaq . [ 21 ] Также был произведен вариант, предназначенный для ПЦР с горячим стартом, под названием «полимераза Faststart». Он требует сильной тепловой активации, что позволяет избежать неспецифической амплификации из-за активности полимеразы при низкой температуре. множество других вариантов . Было создано [ 22 ]
Другие полимеразы Thermus , такие как Tth- полимераза I ( P52028 ) из Thermus thermophilus , нашли некоторое применение. Tth обладает обратной транскриптазной активностью в присутствии Mn. 2+ ионы, позволяющие проводить ПЦР-амплификацию от РНК-мишеней. [ 23 ]
Архейский Pyrococcus род . оказался богатым источником термостабильных полимераз с корректорской активностью ДНК-полимераза Pfu , выделенная из P. Furiosus, демонстрирует 5-кратное снижение частоты ошибок репликации по сравнению с Taq. [ 24 ] Поскольку ошибки увеличиваются по мере развития ПЦР, Pfu является предпочтительной полимеразой, когда продукты необходимо индивидуально клонировать для секвенирования или экспрессии. Другие менее используемые полимеразы этого рода включают Pwo ( P61876 ) из Pyrococcus woesei , Pfx из неназванного вида, полимеразу «Deep Vent» ( Q51334 ) из штамма GB-D. [ 25 ]
Vent или Полимераза Tli представляет собой чрезвычайно термостабильную ДНК-полимеразу, выделенную из Thermococcus Litoralis . Полимераза из Thermococcus fumicolans ( Tfu ) также поступила в продажу. [ 25 ]
Модификации механизма
[ редактировать ]Иногда даже базовый механизм ПЦР можно модифицировать.
В отличие от обычной ПЦР, обратная ПЦР позволяет амплифицировать и секвенировать ДНК, окружающую известную последовательность. Он включает в себя первоначальное подвергание целевой ДНК серии ферментами рестрикции расщеплений , а затем циркуляризацию полученных фрагментов путем самолигирования . Праймеры предназначены для расширения наружу от известного сегмента, что приводит к усилению остальной части круга. Это особенно полезно при идентификации последовательностей по обе стороны от различных геномных вставок. [ 26 ]
Аналогичным образом, термическая асимметричная чересстрочная ПЦР (или TAIL-PCR ) используется для выделения неизвестных последовательностей, фланкирующих известную область генома. В рамках известной последовательности в TAIL-PCR используется вложенная пара праймеров с разными температурами отжига. «Вырожденный» праймер используется для амплификации в другом направлении от неизвестной последовательности. [ 27 ]
Методы изотермического усиления
[ редактировать ]Были разработаны некоторые протоколы амплификации ДНК, которые можно использовать вместо ПЦР. Они изотермические, что означает, что они работают при постоянной температуре. [ 28 ]
Геликазно-зависимая амплификация (HDA) аналогична традиционной ПЦР, но использует постоянную температуру, а не циклически проходит этапы денатурации и отжига/удлинения. ДНК-геликаза , фермент, раскручивающий ДНК, используется вместо термической денатурации. [ 29 ] Петлевая изотермическая амплификация — аналогичная идея, но осуществляется с помощью полимеразы, замещающей цепь. [ 30 ]
Реакция амплификации никующего фермента (NEAR) и ее амплификация со смещением двоюродной цепи (SDA) являются изотермическими, при этом ДНК реплицируется при постоянной температуре с использованием полимеразы и никующего фермента. [ 28 ]
Амплификация рекомбиназной полимеразы (RPA) [ 31 ] использует рекомбиназу для специфического спаривания праймеров с двухцепочечной ДНК на основе гомологии, направляя таким образом синтез ДНК из определенных последовательностей ДНК, присутствующих в образце. Наличие целевой последовательности инициирует амплификацию ДНК, и термическое или химическое плавление ДНК не требуется. Реакция протекает быстро и приводит к специфической амплификации ДНК от нескольких целевых копий до обнаруживаемых уровней, обычно в течение 5–10 минут. Вся реакционная система стабильна в высушенном виде и не требует охлаждения. RPA можно использовать для замены ПЦР в различных лабораторных приложениях, и пользователи могут разрабатывать свои собственные анализы. [ 32 ]
Другие типы изотермической амплификации включают амплификацию всего генома (WGA), амплификацию на основе последовательностей нуклеиновых кислот (NASBA) и опосредованную транскрипцией амплификацию (TMA). [ 28 ]
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Хайден М.Дж., Нгуен Т.М., Уотерман А., Чалмерс К.Дж. (2008). «Мультиплексная ПЦР: новый метод мультиплексного генотипирования SSR и SNP» . БМК Геномика . 9:80 . дои : 10.1186/1471-2164-9-80 . ПМЦ 2275739 . ПМИД 18282271 .
- ^ Иннис М.А., Мьямбо К.Б., Гельфанд Д.Х., Броу М.А. (декабрь 1988 г.). «Секвенирование ДНК с помощью ДНК-полимеразы Thermus aquaticus и прямое секвенирование ДНК, амплифицированной полимеразной цепной реакцией» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 85 (24): 9436–40. Бибкод : 1988PNAS...85.9436I . дои : 10.1073/pnas.85.24.9436 . ПМК 282767 . ПМИД 3200828 .
- ^ Пирс К.Е., Ван LJ (2007). «Линейная послеэкспоненциальная полимеразная цепная реакция и родственные технологии». Одноклеточная диагностика . Методы молекулярной медицины. Том. 132. С. 65–85. дои : 10.1007/978-1-59745-298-4_7 . ISBN 978-1-58829-578-1 . ПМИД 17876077 .
{{cite book}}:|journal=игнорируется ( помогите ) - ^ Jump up to: а б с д Сайки Р.К., Гельфанд Д.Х., Стоффель С. и др. (январь 1988 г.). «Праймер-направленная ферментативная амплификация ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы» . Наука . 239 (4839): 487–91. Бибкод : 1988Sci...239..487S . дои : 10.1126/science.239.4839.487 . ПМИД 2448875 .
- ^ Ченг С., Фоклер С., Барнс В.М., Хигучи Р. (июнь 1994 г.). «Эффективная амплификация длинных мишеней из клонированных вставок и геномной ДНК человека» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 91 (12): 5695–9. Бибкод : 1994PNAS...91.5695C . дои : 10.1073/pnas.91.12.5695 . ПМК 44063 . ПМИД 8202550 .
- ^ Чоу К., Рассел М., Берч Д.Э., Рэймонд Дж., Блох В. (апрель 1992 г.). «Предотвращение неправильного прайминга перед ПЦР и димеризации праймеров улучшает амплификацию с низким числом копий» . Нуклеиновые кислоты Рез . 20 (7): 1717–23. дои : 10.1093/нар/20.7.1717 . ПМК 312262 . ПМИД 1579465 .
- ^ Дон Р.Х., Кокс П.Т., Уэйнрайт Б.Дж., Бейкер К., Мэттик Дж.С. (июль 1991 г.). « ПЦР «приземления» для предотвращения ложного прайминга во время амплификации гена» . Нуклеиновые кислоты Рез . 19 (14): 4008. doi : 10.1093/nar/19.14.4008 . ПМК 328507 . ПМИД 1861999 .
- ^ Стеммер В.П., Крамери А., Ха К.Д., Бреннан Т.М., Хейнекер Х.Л. (1995). «Одноэтапная сборка гена и всей плазмиды из большого количества олигодезоксирибонуклеотидов». Джин . 164 (1): 49–53. дои : 10.1016/0378-1119(95)00511-4 . ПМИД 7590320 .
- ^ Павлов А.Р., Павлова Н.В., Козявкин С.А., Слесарев А.И. (2006). «Термостабильные ДНК-полимеразы для широкого спектра применений: сравнение надежного гибрида TopoTaq с другими ферментами». В Келечаве Дж. (ред.). Секвенирование ДНК II: оптимизация подготовки и очистки . Джонс и Бартлетт. стр. 241–257. ISBN 978-0-7637-3383-4 .
- ^ Рауль, Д; Дж. Абудхарам; Э Крубези; Дж. Ларруи; Б Людес; М. Дранкур (07.11.2000). «Молекулярная идентификация с помощью «самоубийственной ПЦР» Yersinia pestis как возбудителя средневековой черной смерти» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 97 (23): 12800–12803. Бибкод : 2000PNAS...9712800R . дои : 10.1073/pnas.220225197 . ISSN 0027-8424 . ЧВК 18844 . ПМИД 11058154 .
- ^ Андрович, Питер; Валиграх, Лукас; Эллинг, Джули; Шобак, Роберт; Кубиста, Микаэль (2017). «Двусторонняя RT-qPCR: новый метод высокоточного количественного определения микроРНК» . Исследования нуклеиновых кислот . 45 (15): е144. дои : 10.1093/нар/gkx588 . ISSN 0305-1048 . ПМЦ 5587787 . ПМИД 28911110 .
- ^ Мюллер PR, Уолд Б. (ноябрь 1989 г.). «Отпечаток специфического для мышц усилителя in vivo с помощью ПЦР, опосредованной лигированием». Наука . 246 (4931): 780–6. Бибкод : 1989Sci...246..780M . дои : 10.1126/science.2814500 . ПМИД 2814500 .
- ^ Герман Ю.Г. , Графф Дж.Р., Мёханен С., Нелькин Б.Д., Байлин С.Б. (сентябрь 1996 г.). «ПЦР, специфичная для метилирования: новый ПЦР-анализ статуса метилирования островков CpG» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 93 (18): 9821–6. Бибкод : 1996PNAS...93.9821H . дои : 10.1073/pnas.93.18.9821 . ПМЦ 38513 . ПМИД 8790415 .
- ^ Эрнандес, Х; Це, МОЙ; Панг, Южная Каролина; Арболеда, Х; Фореро, Д.А. (октябрь 2013 г.). «Оптимизация методологии анализа метилирования ДНК на основе ПЦР» . БиоТехники . 55 (4): 181–197. дои : 10.2144/000114087 . ПМИД 24107250 .
- ^ Маркулатос, П; Сиафакас, Н; Монкани, М. (2002). «Мультиплексная полимеразная цепная реакция: практический подход» . Журнал клинического лабораторного анализа . 16 (1): 47–51. дои : 10.1002/jcla.2058 . ПМК 6808141 . ПМИД 11835531 .
- ^ Э. Зиткевич; А. Рафальски и Д. Лабуда (1994). «Отпечатки пальцев генома путем амплификации полимеразной цепной реакции, заякоренной в простых повторах последовательностей (SSR)». Геномика . 20 (2): 176–83. дои : 10.1006/geno.1994.1151 . ПМИД 8020964 . S2CID 41802285 .
- ^ Добоси-младший, Роуз С.Д., Бельц К.Р., Рупп С.М., Пауэрс К.М., Белке М.А., Уолдер Дж.А. (август 2011 г.). «РНКаза H-зависимая ПЦР (рчПЦР): улучшенная специфичность и обнаружение полиморфизма отдельных нуклеотидов с использованием блокированных расщепляемых праймеров» . БМК Биотехнология . 11:80 . дои : 10.1186/1472-6750-11-80 . ПМЦ 3224242 . ПМИД 21831278 .
- ^ Венкитараман А.Р. (апрель 1989 г.). «Использование модифицированной ДНК-полимеразы Т7 (секвеназы версии 2.0) для сайт-направленного мутагенеза олигонуклеотидов» . Исследования нуклеиновых кислот . 17 (8): 3314. doi : 10.1093/nar/17.8.3314 . ПМК 317753 . ПМИД 2726477 .
- ^ «Термосеквеназа ДНК-полимераза» .
- ^ Юрист, ФК; Стоффель, С.; Сайки, РК; Чанг, Ю.Ю.; Ландре, Пенсильвания; Абрамсон, РД; Гельфанд, Д.Х. (1 мая 1993 г.). «Высокоуровневая экспрессия, очистка и ферментативная характеристика полноразмерной ДНК-полимеразы Thermus aquaticus и укороченной формы с дефицитом экзонуклеазной активности от 5' до 3'» . Методы и приложения ПЦР . 2 (4): 275–287. дои : 10.1101/гр.2.4.275 . ISSN 1054-9803 . ПМИД 8324500 .
- ^ «Прикладные биосистемы – поддержка» . www6.appliedbiosystems.com .
- ^ Вилбрандт, Б; Собек, Х; Фрей, Б; Шомбург, Д. (сентябрь 2000 г.). «Обмен доменами: химеры ДНК-полимеразы Thermus aquaticus, ДНК-полимеразы I Escherichia coli и ДНК-полимеразы Thermotoga neapolitana» . Белковая инженерия . 13 (9): 645–54. дои : 10.1093/протеин/13.9.645 . ПМИД 11054459 .
- ^ https://www.promega.in/products/pcr/rt-pcr/tth-dna-polymerase/ [ мертвая ссылка ]
- ^ Клайн Дж., Браман Дж.К., Хогрефе Х.Х. (сентябрь 1996 г.). «ПЦР-точность ДНК-полимеразы БОЕ и других термостабильных ДНК-полимераз» . Нуклеиновые кислоты Рез . 24 (18): 3546–51. дои : 10.1093/нар/24.18.3546 . ПМК 146123 . ПМИД 8836181 .
- ^ Jump up to: а б ван Пелт-Веркуил Э., ван Белкум А., Хейс Дж. П. (2008). «Taq и другие термостабильные ДНК-полимеразы». Принципы и технические аспекты ПЦР-амплификации . стр. 103–18. дои : 10.1007/978-1-4020-6241-4_7 . ISBN 978-1-4020-6240-7 .
- ^ Охман Х., Гербер А.С., Хартл Д.Л. (1 ноября 1988 г.). «Генетическое применение обратной полимеразной цепной реакции» . Генетика . 120 (3): 621–3. дои : 10.1093/генетика/120.3.621 . ПМЦ 1203539 . ПМИД 2852134 .
- ^ Лю Ю.Г., Уиттиер РФ (февраль 1995 г.). «Термическая асимметричная чересстрочная ПЦР: автоматическая амплификация и секвенирование концевых фрагментов вставки из клонов P1 и YAC для ходьбы по хромосоме». Геномика . 25 (3): 674–81. дои : 10.1016/0888-7543(95)80010-J . ПМИД 7759102 .
- ^ Jump up to: а б с «Изотермическая амплификация — обзор применения» . Биолаборатории Новой Англии, Inc. 2020 . Проверено 13 августа 2020 г. .
- ^ Винсент М., Сюй Ю, Конг Х (август 2004 г.). «Геликазозависимая изотермическая амплификация ДНК» . Представитель ЭМБО . 5 (8): 795–800. дои : 10.1038/sj.embor.7400200 . ПМЦ 1249482 . ПМИД 15247927 .
- ^ Нотоми Т., Окаяма Х., Масубучи Х., Ёнекава Т., Ватанабе К., Амино Н., Хасэ Т. (2000). «Петлевая изотермическая амплификация ДНК» . Нуклеиновые кислоты Рез . 28 (12): 63д–63. дои : 10.1093/нар/28.12.e63 . ПМЦ 102748 . ПМИД 10871386 .
- ^ Пипенбург О, Уильямс Ч., Стемпл Д.Л., Армс Н.А. (2006). «Обнаружение ДНК с использованием рекомбинационных белков» . ПЛОС Биол . 4 (7): е204. дои : 10.1371/journal.pbio.0040204 . ПМЦ 1475771 . ПМИД 16756388 .
- ^ Лутц С., Вебер П., Фокке М., Фалтин Б., Хоффманн Дж., Мюллер С., Марк Д., Рот Г., Мандей П., Армс Н., Пипенбург О., Ценгерле Р., фон Штеттен Ф. (апрель 2010 г.). «Микрофлюидная лаборатория на фольге для анализа нуклеиновых кислот на основе изотермической амплификации рекомбиназной полимеразы (RPA)». Лабораторный чип . 10 (7): 887–93. дои : 10.1039/b921140c . ПМИД 20300675 .