Молекулярная визуализация

Молекулярная визуализация — это область медицинской визуализации , которая фокусируется на визуализации молекул, представляющих медицинский интерес, у живых пациентов. Это контрастирует с традиционными методами получения молекулярной информации из сохранившихся образцов тканей, такими как гистология . Интересующие молекулы могут быть либо теми, которые вырабатываются организмом естественным путем, либо синтетическими молекулами, произведенными в лаборатории и введенными врачом пациенту. Наиболее распространенным примером молекулярной визуализации, используемой сегодня в клинической практике, является инъекция контрастного вещества (например, микропузырька , иона металла или радиоактивного изотопа) в кровоток пациента и использование методов визуализации (например, ультразвука , МРТ , КТ , ПЭТ ). отслеживать его движение в организме. Молекулярная визуализация возникла в области радиологии из-за необходимости лучше понять фундаментальные молекулярные процессы внутри организмов неинвазивным способом.

Конечная цель молекулярной визуализации — возможность неинвазивного мониторинга всех биохимических процессов, происходящих внутри организма, в режиме реального времени. Текущие исследования в области молекулярной визуализации включают клеточную / молекулярную биологию , химию и медицинскую физику и сосредоточены на: 1) разработке методов визуализации для обнаружения ранее необнаружимых типов молекул, 2) расширении количества и типов доступных контрастных веществ и 3) разработка функциональных контрастных веществ, которые предоставляют информацию о различных видах деятельности, которые клетки и ткани выполняют как в здоровом состоянии, так и при заболеваниях.

Обзор

Молекулярная визуализация возникла в середине двадцатого века как дисциплина на стыке молекулярной биологии и визуализации in vivo . Это позволяет визуализировать клеточные функции и следить за молекулярными процессами в живых организмах, не нарушая их. Многочисленные возможности этой области применимы для диагностики таких заболеваний, как рак, а также неврологические и сердечно-сосудистые заболевания. Этот метод также способствует улучшению лечения этих расстройств за счет оптимизации доклинических и клинических испытаний новых лекарств. Ожидается, что они также окажут серьезное экономическое воздействие благодаря более ранней и точной диагностике.Молекулярная и функциональная визуализация приобрела новое направление после описания генома человека. Новые пути фундаментальных исследований, а также прикладных и промышленных исследований усложняют задачи ученых и повышают требования к ним. Поэтому необходима индивидуальная программа обучения.

Молекулярная визуализация отличается от традиционной визуализации тем, что зонды, известные как биомаркеры для визуализации конкретных целей или путей используются . Биомаркеры химически взаимодействуют с окружающей средой и, в свою очередь, изменяют изображение в соответствии с молекулярными изменениями, происходящими в интересующей области. Этот процесс заметно отличается от предыдущих методов визуализации, которые в первую очередь отображали различия в таких качествах, как плотность или содержание воды. Эта способность отображать тонкие молекулярные изменения открывает невероятное количество захватывающих возможностей для медицинского применения, включая раннее обнаружение и лечение заболеваний, а также базовые фармацевтические разработки. Кроме того, молекулярная визуализация позволяет проводить количественные тесты, придавая большую степень объективности изучению этих областей. Одной из новых технологий является молекулярная визуализация MALDI , основанная на масс-спектрометрии . ^{[ нужна ссылка ]}

Многие области исследований проводятся в области молекулярной визуализации. Многие исследования в настоящее время сосредоточены на выявлении так называемого предболезненного состояния или молекулярных состояний, которые возникают до того, как будут обнаружены типичные симптомы заболевания. Другими важными направлениями исследований являются визуализация экспрессии генов и разработка новых биомаркеров. Такие организации, как SNMMI Центр инноваций и трансляции молекулярных изображений (CMIIT), созданы для поддержки исследований в этой области. В Европе другие «сети передового опыта», такие как DiMI (Диагностика в области молекулярной визуализации) или EMIL (Европейские лаборатории молекулярной визуализации), работают над этой новой наукой, объединяя деятельность и исследования в этой области. Таким образом, создается Европейская магистерская программа «EMMI» для подготовки нового поколения профессионалов в области молекулярной визуализации.

В последнее время термин «молекулярная визуализация» стал применяться к различным методам микроскопии и наноскопии, включая микроскопию живых клеток, флуоресцентную микроскопию с полным внутренним отражением (TIRF), наноскопию с истощением выбросов ST (STED) и атомно-силовую микроскопию (AFM), как показано здесь. молекул являются показаниями.

Методы визуализации

Существует множество различных методов, которые можно использовать для неинвазивной молекулярной визуализации. У каждого из них есть свои сильные и слабые стороны, и некоторые из них более искусны в визуализации нескольких целей, чем другие.

Магнитно-резонансная томография

Преимущество МРТ заключается в том, что она имеет очень высокое пространственное разрешение и очень хорошо подходит для морфологической и функциональной визуализации. Однако у МРТ есть несколько недостатков. Во-первых, МРТ имеет чувствительность около 10 ⁻³ моль/л до 10 ⁻⁵ моль/л, что по сравнению с другими типами визуализации может быть весьма ограниченным. Эта проблема возникает из-за того, что разница между атомами в состоянии высокой энергии и состоянии низкой энергии очень мала. Например, при 1,5 Тесла , типичной напряженности поля для клинической МРТ, разница между состояниями с высокой и низкой энергией составляет примерно 9 молекул на 2 миллиона. ^{[ нужна ссылка ]} Улучшения для повышения чувствительности МР включают увеличение напряженности магнитного поля и гиперполяризацию посредством оптической накачки, динамическую ядерную поляризацию или поляризацию, индуцированную параводородом . Существуют также разнообразные схемы усиления сигнала, основанные на химическом обмене, повышающие чувствительность. ^[1]

Для достижения молекулярной визуализации биомаркеров заболеваний с помощью МРТ необходимы таргетные контрастные вещества для МРТ с высокой специфичностью и высокой релаксацией (чувствительностью). На сегодняшний день многие исследования посвящены разработке таргетных контрастных веществ для МРТ для достижения молекулярной визуализации с помощью МРТ. Обычно для достижения нацеливания применяются пептиды, антитела или небольшие лиганды и небольшие белковые домены, такие как аффитела HER-2. Для повышения чувствительности контрастных агентов эти нацеливающие фрагменты обычно связывают с контрастными агентами для МРТ с высокой полезной нагрузкой или контрастными агентами для МРТ с высокой релаксирующей способностью. ^[2] В частности, недавняя разработка частиц оксида железа микронного размера (MPIO) позволила достичь беспрецедентного уровня чувствительности для обнаружения белков, экспрессируемых артериями и венами. ^[3]

Оптическая визуализация

Существует несколько подходов, используемых для оптической визуализации. Различные методы зависят от флуоресценции , биолюминесценции , поглощения или отражения в качестве источника контраста. ^[4]

Наиболее ценным свойством оптической визуализации является то, что она и ультразвук не вызывают серьезных проблем с безопасностью, как другие методы медицинской визуализации. ^{[ нужна ссылка ]}

Недостатком оптической визуализации является недостаточная глубина проникновения, особенно при работе в видимом диапазоне волн. Глубина проникновения связана с поглощением и рассеянием света, которое в первую очередь зависит от длины волны источника возбуждения. Свет поглощается эндогенными хромофорами, обнаруженными в живых тканях (например, гемоглобином, меланином и липидами). В общем, поглощение и рассеяние света уменьшаются с увеличением длины волны. Ниже ~700 нм (например, видимые длины волн) эти эффекты приводят к небольшой глубине проникновения, составляющей всего несколько миллиметров. Таким образом, в видимой области спектра возможна лишь поверхностная оценка особенностей тканей. При длине волны выше 900 нм поглощение воды может влиять на соотношение сигнал/фон. Поскольку коэффициент поглощения ткани в ближней инфракрасной (БИК) области (700–900 нм) значительно ниже, свет может проникать глубже, на глубину нескольких сантиметров. ^[5]

Визуализация в ближнем инфракрасном диапазоне

Флуоресцентные зонды и метки являются важным инструментом для оптической визуализации. Некоторые исследователи применили NIR-визуализацию на крысиной модели острого инфаркта миокарда (ОИМ), используя пептидный зонд, который может связываться с апоптотическими и некротическими клетками. ^[6] Для визуализации in vivo использовался ряд флуорофоров ближнего инфракрасного диапазона (NIR), в том числе красители и конъюгаты Kodak X-SIGHT, Pz 247, DyLight 750 и 800 Fluors, Cy 5.5 и 7 Fluors, Alexa Fluor 680 и 750 красителей, IRDye. Флюоры 680 и 800CW. Квантовые точки с их фотостабильностью и ярким излучением вызвали большой интерес; однако их размер препятствует эффективному выведению из кровеносной и почечной систем, проявляя при этом долговременную токсичность. ^{[ нужна ссылка ]}.

Несколько исследований продемонстрировали использование меченных инфракрасными красителями зондов для оптической визуализации.

При сравнении гамма-сцинтиграфии и NIR-визуализации циклопентапептид, меченный двойной меткой ¹¹¹
In и NIR. использовали флуорофор по αvβ3- интегрину, Для визуализации ксенотрансплантатов меланомы, положительных ^[7]
Меченый в ближнем инфракрасном диапазоне RGD, нацеленный на αvβ3- интегрин, использовался в многочисленных исследованиях для борьбы с различными видами рака. ^[8]
NIR-флуорофор был конъюгирован с эпидермальным фактором роста (EGF) для визуализации прогрессирования опухоли. ^[9]
БИК-флуорофор сравнили с Cy5.5, что позволило предположить, что более длинноволновые красители могут создавать более эффективные нацеливающие агенты для оптической визуализации. ^[10]
Памидронат был помечен флуорофором NIR и использовался в качестве средства визуализации костей для обнаружения остеобластической активности у живого животного. ^[11]
GPI, меченный флуорофором NIR, мощный ингибитор PSMA ( специфического мембранного антигена простаты ). ^[12]
Использование человеческого сывороточного альбумина, меченного флуорофором NIR, в качестве агента отслеживания для картирования сторожевых лимфатических узлов. ^[13]
2-Дезокси-D-глюкоза, меченная БИК-флуорофором. ^[14]

Важно отметить, что добавление NIR-зонда к любому вектору может изменить биосовместимость и биораспределение вектора. Поэтому нельзя однозначно предполагать, что сопряженный вектор будет вести себя аналогично нативной форме.

Однофотонная эмиссионная компьютерная томография

мыши ОФЭКТ-изображение (костный индикатор) MIP

Развитие компьютерной томографии в 1970-х годах позволило составить карту распределения радиоизотопов в органе или ткани и привело к появлению метода, который сейчас называется однофотонной эмиссионной компьютерной томографией (ОФЭКТ).

Визуализирующий агент, используемый в ОФЭКТ, излучает гамма-лучи, в отличие от излучателей позитронов (таких как ¹⁸
F ), используемый в ПЭТ. Существует целый ряд радиофармпрепаратов (таких как ^{99 м}
Тс , ¹¹¹
В , ¹²³
я , ²⁰¹
Tl ), которые можно использовать в зависимости от конкретного приложения.

Ксенон ( ¹³³
Газ Xe ) является одним из таких радиофармпрепаратов. Было показано, что он полезен для диагностических ингаляционных исследований для оценки функции легких; для визуализации легких; и может также использоваться для оценки rCBF. Обнаружение этого газа происходит с помощью гамма-камеры — сцинтилляционного детектора, состоящего из коллиматора, кристалла NaI и набора фотоумножителей.

Вращая гамма-камеру вокруг пациента, можно получить трехмерное изображение распределения радиоактивного индикатора с помощью обратной проекции с фильтром или других томографических методов.Радиоизотопы, используемые в ОФЭКТ, имеют относительно длительный период полураспада (от нескольких часов до нескольких дней), что делает их простыми в производстве и относительно дешевыми. В этом заключается главное преимущество ОФЭКТ как метода молекулярной визуализации, поскольку он значительно дешевле, чем ПЭТ или фМРТ. Однако ему не хватает хорошего пространственного (т. е. того, где именно находится частица) или временного (т. е. произошел ли сигнал контрастного вещества в эту или ту миллисекунду) разрешения. Кроме того, из-за радиоактивности контрастного вещества существуют аспекты безопасности, связанные с введением радиоизотопов субъекту, особенно при серийных исследованиях.

Позитронно-эмиссионная томография

Визуализация воспаления суставов у мышей с артритом с помощью позитронно-эмиссионной томографии.

ПЭТ, МРТ и наложенные изображения человеческого мозга.

Позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) — это метод визуализации ядерной медицины , который создает трехмерное изображение или картину функциональных процессов в организме. Теория, лежащая в основе ПЭТ, достаточно проста. Сначала молекула помечается изотопом, излучающим позитрон. Эти позитроны аннигилируют с соседними электронами, испуская два фотона с энергией 511 кэВ, направленные на 180 градусов друг от друга в противоположных направлениях. Эти фотоны затем обнаруживаются сканером, который может оценить плотность аннигиляции позитронов в определенной области. Когда произошло достаточное количество взаимодействий и аннигиляций, плотность исходной молекулы можно измерить в этой области. Типичные изотопы включают ¹¹
С , ¹³
Н , ¹⁵
Ой , ¹⁸
Ф , ⁶⁴
с , ⁶²
с , ¹²⁴
я , ⁷⁶
Бр , ⁸²
Рб , ⁸⁹
Зр и ⁶⁸
Га , с ¹⁸
F является наиболее используемым в клинической практике. Одним из основных недостатков ПЭТ является то, что большинство зондов необходимо изготавливать с помощью циклотрона. Период полураспада большинства этих зондов также измеряется часами, что вынуждает циклотрон находиться на месте. Эти факторы могут сделать ПЭТ непомерно дорогим. Однако ПЭТ-визуализация имеет много преимуществ. Прежде всего, это его чувствительность: типичный ПЭТ-сканер может обнаружить от 10 ⁻¹¹ моль/л до 10 ⁻¹² концентрации моль/л.

См. также

Ссылки

^ Галлахер, Ф.А. (2010). «Введение в функциональную и молекулярную визуализацию с помощью МРТ». Клиническая радиология . 65 (7): 557–566. дои : 10.1016/j.crad.2010.04.006 . ISSN 0009-9260 . ПМИД 20541655 .
^ Шэнхуэй, Сюэ; Цзинцзюань Цяо; Фань Пу; Мэтью Кэмерон; Дженни Дж. Янг (17 января 2013 г.). «Разработка нового класса белковых контрастных агентов для магнитно-резонансной томографии для молекулярной визуализации биомаркеров рака» . Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol . 5 (2): 163–79. дои : 10.1002/wnan.1205 . ПМК 4011496 . ПМИД 23335551 .
^ Гоберти М., Монтань А., Кено А., Вивьен Д. (2014). «Молекулярная магнитно-резонансная томография мозгоиммунных взаимодействий» . Переднеклеточные нейроны . 8 : 389. дои : 10.3389/fncel.2014.00389 . ПМК 4245913 . ПМИД 25505871 .
^ Вайсследер Р., Махмуд У (май 2001 г.). «Молекулярная визуализация». Радиология . 219 (2): 316–33. doi : 10.1148/radiology.219.2.r01ma19316 . ПМИД 11323453 .
^ Ковар Дж.Л., Симпсон М.А., Шутц-Гешвендер А., Олив Д.М. (август 2007 г.). «Системный подход к разработке флуоресцентных контрастных веществ для оптической визуализации моделей рака у мышей» . Анальный. Биохим . 367 (1): 1–12. дои : 10.1016/j.ab.2007.04.011 . ПМИД 17521598 . в формате PDF. Архивировано 11 февраля 2009 г. в Wayback Machine.
^ Ачарья, Б; Ван, К; Ким, И.С.; Канг, В; Луна, С; Ли, Б.Х. (2013). «Визуализация гибели клеток миокарда in vivo с использованием пептидного зонда и оценка долгосрочной функции сердца». Журнал контролируемого выпуска . 172 (1): 367–73. дои : 10.1016/j.jconrel.2013.08.294 . ПМИД 24021357 .
^ Хьюстон Дж.П., Ке С., Ван В., Ли С., Севик-Мурака Э.М. (2005). «Анализ качества in vivo флуоресценции в ближнем инфракрасном диапазоне и обычных гамма-изображений, полученных с использованием зонда, нацеленного на опухоль с двойной меткой» . J Биомед Опц . 10 (5): 054010. Бибкод : 2005JBO....10e4010H . дои : 10.1117/1.2114748 . ПМИД 16292970 .
^ Чен К., Се Дж, Чен Икс (2009). «Конъюгаты RGD-сывороточного альбумина человека как эффективные зонды, нацеленные на опухоли» . Мол изображения . 8 (2): 65–73. дои : 10.2310/7290.2009.00011 . ПМК 6366843 . ПМИД 19397852 . Архивировано из оригинала 26 марта 2014 г.
^ Ковар Дж.Л., Джонсон М.А., Волчек В.М., Чен Дж., Симпсон М.А. (октябрь 2006 г.). «Экспрессия гиалуронидазы индуцирует метастазирование опухоли простаты на модели ортотопических мышей» . Являюсь. Дж. Патол . 169 (4): 1415–26. дои : 10.2353/ajpath.2006.060324 . ПМК 1698854 . ПМИД 17003496 .
^ Адамс К.Э., Ке С., Квон С. и др. (2007). «Сравнение видимых и ближних инфракрасных флуоресцентных красителей для молекулярной визуализации рака» . J Биомед Опц . 12 (2): 024017. Бибкод : 2007JBO....12b4017A . дои : 10.1117/1.2717137 . ПМИД 17477732 . S2CID 39806507 .
^ Захир А., Ленкински Р.Э., Махмуд А., Джонс А.Г., Кантли Л.К., Франджиони СП (декабрь 2001 г.). «In vivo флуоресцентная визуализация остеобластической активности в ближнем инфракрасном диапазоне». Нат. Биотехнология . 19 (12): 1148–54. дои : 10.1038/nbt1201-1148 . ПМИД 11731784 . S2CID 485155 .
^ Хамблет В., Лапидус Р., Уильямс Л.Р. и др. (2005). «Высокоаффинные низкомолекулярные флуоресцентные контрастные вещества ближнего инфракрасного диапазона для визуализации in vivo специфического мембранного антигена простаты» . Мол изображения . 4 (4): 448–62. дои : 10.2310/7290.2005.05163 . ПМИД 16285907 .
^ Ониши С., Ломнес С.Дж., Лоуренс Р.Г., Гогбашян А., Мариани Г., Франджиони Дж.В. (2005). «Органические альтернативы квантовым точкам для интраоперационного картирования сторожевых лимфатических узлов в ближнем инфракрасном диапазоне» . Мол изображения . 4 (3): 172–81. дои : 10.1162/15353500200505127 . ПМИД 16194449 .
^ Ковар Дж.Л., Волчек В., Севик-Мурака Э., Симпсон М.А., Олив Д.М. (январь 2009 г.). «Характеристика и эффективность агента оптической визуализации на основе 2-дезоксиглюкозы ближнего инфракрасного диапазона для моделей рака у мышей» . Анальный. Биохим . 384 (2): 254–62. дои : 10.1016/j.ab.2008.09.050 . ПМК 2720560 . ПМИД 18938129 . в формате PDF. Архивировано 13 июля 2011 г. в Wayback Machine.

[Gallagher2010-1] Галлахер, Ф.А. (2010). «Введение в функциональную и молекулярную визуализацию с помощью МРТ». Клиническая радиология . 65 (7): 557–566. дои : 10.1016/j.crad.2010.04.006 . ISSN 0009-9260 . ПМИД 20541655 .

[2] Шэнхуэй, Сюэ; Цзинцзюань Цяо; Фань Пу; Мэтью Кэмерон; Дженни Дж. Янг (17 января 2013 г.). «Разработка нового класса белковых контрастных агентов для магнитно-резонансной томографии для молекулярной визуализации биомаркеров рака» . Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol . 5 (2): 163–79. дои : 10.1002/wnan.1205 . ПМК 4011496 . ПМИД 23335551 .

[pmid25505871-3] Гоберти М., Монтань А., Кено А., Вивьен Д. (2014). «Молекулярная магнитно-резонансная томография мозгоиммунных взаимодействий» . Переднеклеточные нейроны . 8 : 389. дои : 10.3389/fncel.2014.00389 . ПМК 4245913 . ПМИД 25505871 .

[4] Вайсследер Р., Махмуд У (май 2001 г.). «Молекулярная визуализация». Радиология . 219 (2): 316–33. doi : 10.1148/radiology.219.2.r01ma19316 . ПМИД 11323453 .

[5] Ковар Дж.Л., Симпсон М.А., Шутц-Гешвендер А., Олив Д.М. (август 2007 г.). «Системный подход к разработке флуоресцентных контрастных веществ для оптической визуализации моделей рака у мышей» . Анальный. Биохим . 367 (1): 1–12. дои : 10.1016/j.ab.2007.04.011 . ПМИД 17521598 . в формате PDF. Архивировано 11 февраля 2009 г. в Wayback Machine.

[6] Ачарья, Б; Ван, К; Ким, И.С.; Канг, В; Луна, С; Ли, Б.Х. (2013). «Визуализация гибели клеток миокарда in vivo с использованием пептидного зонда и оценка долгосрочной функции сердца». Журнал контролируемого выпуска . 172 (1): 367–73. дои : 10.1016/j.jconrel.2013.08.294 . ПМИД 24021357 .

[7] Хьюстон Дж.П., Ке С., Ван В., Ли С., Севик-Мурака Э.М. (2005). «Анализ качества in vivo флуоресценции в ближнем инфракрасном диапазоне и обычных гамма-изображений, полученных с использованием зонда, нацеленного на опухоль с двойной меткой» . J Биомед Опц . 10 (5): 054010. Бибкод : 2005JBO....10e4010H . дои : 10.1117/1.2114748 . ПМИД 16292970 .

[8] Чен К., Се Дж, Чен Икс (2009). «Конъюгаты RGD-сывороточного альбумина человека как эффективные зонды, нацеленные на опухоли» . Мол изображения . 8 (2): 65–73. дои : 10.2310/7290.2009.00011 . ПМК 6366843 . ПМИД 19397852 . Архивировано из оригинала 26 марта 2014 г.

[9] Ковар Дж.Л., Джонсон М.А., Волчек В.М., Чен Дж., Симпсон М.А. (октябрь 2006 г.). «Экспрессия гиалуронидазы индуцирует метастазирование опухоли простаты на модели ортотопических мышей» . Являюсь. Дж. Патол . 169 (4): 1415–26. дои : 10.2353/ajpath.2006.060324 . ПМК 1698854 . ПМИД 17003496 .

[10] Адамс К.Э., Ке С., Квон С. и др. (2007). «Сравнение видимых и ближних инфракрасных флуоресцентных красителей для молекулярной визуализации рака» . J Биомед Опц . 12 (2): 024017. Бибкод : 2007JBO....12b4017A . дои : 10.1117/1.2717137 . ПМИД 17477732 . S2CID 39806507 .

[11] Захир А., Ленкински Р.Э., Махмуд А., Джонс А.Г., Кантли Л.К., Франджиони СП (декабрь 2001 г.). «In vivo флуоресцентная визуализация остеобластической активности в ближнем инфракрасном диапазоне». Нат. Биотехнология . 19 (12): 1148–54. дои : 10.1038/nbt1201-1148 . ПМИД 11731784 . S2CID 485155 .

[12] Хамблет В., Лапидус Р., Уильямс Л.Р. и др. (2005). «Высокоаффинные низкомолекулярные флуоресцентные контрастные вещества ближнего инфракрасного диапазона для визуализации in vivo специфического мембранного антигена простаты» . Мол изображения . 4 (4): 448–62. дои : 10.2310/7290.2005.05163 . ПМИД 16285907 .

[13] Ониши С., Ломнес С.Дж., Лоуренс Р.Г., Гогбашян А., Мариани Г., Франджиони Дж.В. (2005). «Органические альтернативы квантовым точкам для интраоперационного картирования сторожевых лимфатических узлов в ближнем инфракрасном диапазоне» . Мол изображения . 4 (3): 172–81. дои : 10.1162/15353500200505127 . ПМИД 16194449 .

[14] Ковар Дж.Л., Волчек В., Севик-Мурака Э., Симпсон М.А., Олив Д.М. (январь 2009 г.). «Характеристика и эффективность агента оптической визуализации на основе 2-дезоксиглюкозы ближнего инфракрасного диапазона для моделей рака у мышей» . Анальный. Биохим . 384 (2): 254–62. дои : 10.1016/j.ab.2008.09.050 . ПМК 2720560 . ПМИД 18938129 . в формате PDF. Архивировано 13 июля 2011 г. в Wayback Machine.

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11]

[12]

[13]

[14]