Разъединяющий белок

Разобщающий белок ( UCP ) — это белок внутренней мембраны митохондрий, который является регулируемым протонным каналом или транспортером. Таким образом, разобщающий белок способен рассеивать протонный градиент , генерируемый НАДН -перекачкой протонов из митохондриального матрикса в митохондриальное межмембранное пространство. Энергия, теряемая при рассеивании протонного градиента через UCP, не используется для выполнения биохимической работы. Вместо этого выделяется тепло. Это то, что связывает UCP с термогенезом. Однако не все типы UCP связаны с термогенезом. Хотя UCP2 и UCP3 тесно связаны с UCP1, UCP2 и UCP3 не влияют на терморегуляторные способности позвоночных. ^[1] UCP расположены в той же мембране, что и АТФ-синтаза , которая также является протонным каналом. Таким образом, два белка работают параллельно: один генерирует тепло, а другой генерирует АТФ из АДФ и неорганического фосфата, что является последним этапом окислительного фосфорилирования . ^[2] Дыхание митохондрий связано с синтезом АТФ (фосфорилирование АДФ), но регулируется UCP. ^[3]^[4] UCP принадлежат к семейству митохондриальных носителей (SLC25). ^[5]^[6]

Разъединяющие белки играют роль в нормальной физиологии, например, при воздействии холода или спячке , поскольку энергия используется для выработки тепла (см. термогенез ) вместо производства АТФ . Некоторые виды растений используют тепло, выделяемое при разъединении белков, для особых целей. Восточная скунсовая капуста , например, поддерживает температуру своих колосьев на 20 °C выше, чем температура окружающей среды, распространяя запах и привлекая насекомых, которые оплодотворяют цветы. ^[7] Однако другие вещества, такие как 2,4-динитрофенол и карбонилцианид м-хлорфенилгидразон , также выполняют ту же разобщающую функцию. Салициловая кислота также является разобщающим агентом (в основном в растениях) и при чрезмерном приеме снижает выработку АТФ и повышает температуру тела. ^[8] Разобщающие белки усиливаются гормоном щитовидной железы , норадреналином , адреналином и лептином . ^[9]

История

Ученые наблюдали термогенную активность в бурой жировой ткани , что в конечном итоге привело к открытию UCP1, первоначально известного как «разобщающий белок». ^[3]^[4] В коричневой ткани обнаруживались повышенные уровни дыхания митохондрий и другое дыхание, не связанное с синтезом АТФ, что символизировало сильную термогенную активность. ^[3]^[4] UCP1 был обнаружен белком, ответственным за активацию пути протонов, который не был связан с фосфорилированием АДФ (обычно осуществляемым с помощью АТФ-синтазы ). ^[3]

У млекопитающих

У млекопитающих известно пять гомологов UCP. Хотя каждый из них выполняет уникальные функции, определенные функции выполняются несколькими гомологами. Гомологи следующие:

UCP1, также известный как термогенин или SLC25A7.
UCP2 , также известный как SLC25A8.
UCP3 , также известный как SLC25A9.
UCP4, также известный как SLC25A27.
UCP5, также известный как SLC25A14.

Поддержание температуры тела

Первый обнаруженный разобщающий белок, UCP1, был обнаружен в бурых жировых тканях спящих животных и мелких грызунов, которые обеспечивают этим животным недрожащее тепло. ^[3]^[4] Эти бурые жировые ткани необходимы для поддержания температуры тела мелких грызунов, а исследования на мышах с нокаутом (UCP1) показывают, что эти ткани не функционируют правильно без функционирующих разобщающих белков. ^[3]^[4] Фактически, эти исследования показали, что для этих нокаутных мышей акклиматизация к холоду невозможна, что указывает на то, что UCP1 является важным фактором выработки тепла в этих бурых жировых тканях. ^[10]^[11]

Известно, что в других частях тела разобщающая белковая активность влияет на температуру микросреды. ^[12]^[13] Считается, что это влияет на активность других белков в этих регионах, хотя еще требуется работа для определения истинных последствий температурных градиентов внутри клеток, вызванных разобщением. ^[12]

Структура человеческого разобщающего белка 1 UCP1 была расшифрована с помощью криогенной электронной микроскопии. ^[14] Структура имеет типичную складку члена семейства SLC25. ^[5]^[6] UCP1 фиксируется в открытом цитоплазматическом состоянии гуанозинтрифосфатом в зависимости от pH. ^[14]

Роль в концентрации АТФ

Влияние UCP2 и UCP3 на концентрацию АТФ варьируется в зависимости от типа клеток. ^[12] Например, в бета-клетках поджелудочной железы наблюдается снижение концентрации АТФ при повышении активности UCP2. ^[12] Это связано с дегенерацией клеток, снижением секреции инсулина и диабетом II типа. ^[12]^[15] И наоборот, UCP2 в клетках гиппокампа и UCP3 в мышечных клетках стимулируют выработку митохондрий . ^[12]^[16] Большее количество митохондрий увеличивает общую концентрацию АДФ и АТФ, фактически приводя к чистому увеличению концентрации АТФ, когда эти разобщающие белки соединяются (т.е. механизм, позволяющий утечку протонов, ингибируется). ^[12]^[16]

Поддержание концентрации активных форм кислорода

Полный список функций UCP2 и UCP3 неизвестен. ^[17] Однако исследования показывают, что эти белки участвуют в петле отрицательной обратной связи, ограничивающей концентрацию активных форм кислорода (АФК). ^[18] Текущий научный консенсус утверждает, что UCP2 и UCP3 осуществляют транспортировку протонов только при активации . наличии видов ^[19] Среди этих активаторов есть жирные кислоты, АФК и некоторые побочные продукты АФК, которые также являются реактивными. ^[18]^[19] Следовательно, более высокие уровни АФК прямо или косвенно вызывают повышение активности UCP2 и UCP3. ^[18] Это, в свою очередь, увеличивает утечку протонов из митохондрий, снижая протондвижущую силу через митохондриальные мембраны, активируя цепь переноса электронов. ^[17]^[18]^[19] Ограничение движущей силы протонов посредством этого процесса приводит к возникновению петли отрицательной обратной связи, которая ограничивает производство АФК. ^[18] В частности, UCP2 снижает трансмембранный потенциал митохондрий, тем самым снижая выработку АФК. Таким образом, раковые клетки могут увеличивать выработку UCP2 в митохондриях. ^[20] Эта теория подтверждается независимыми исследованиями, которые показывают увеличение продукции АФК у мышей, нокаутных как по UCP2, так и по UCP3. ^[19]

Этот процесс важен для здоровья человека, поскольку считается, что высокие концентрации АФК участвуют в развитии дегенеративных заболеваний. ^[19]

Функции в нейронах

Обнаружив связанную мРНК , было показано, что UCP2, UCP4 и UCP5 находятся в нейронах по всей центральной нервной системе человека. ^[22] Эти белки играют ключевую роль в функционировании нейронов. ^[12] Хотя многие результаты исследования остаются противоречивыми, некоторые выводы получили широкое признание. ^[12]

Например, UCP изменяют концентрацию свободного кальция в нейроне. ^[12] Митохондрии являются основным местом хранения кальция в нейронах, и емкость хранения увеличивается с увеличением потенциала через митохондриальные мембраны. ^[12]^[23] Следовательно, когда разобщающие белки снижают потенциал на этих мембранах, ионы кальция высвобождаются в окружающую среду нейрона. ^[12] Из-за высоких концентраций митохондрий вблизи окончаний аксонов это означает, что UCP играют роль в регулировании концентрации кальция в этой области. ^[12] Учитывая, что ионы кальция играют большую роль в нейротрансмиссии, ученые прогнозируют, что эти UCP напрямую влияют на нейротрансмиссию. ^[12]

Как обсуждалось выше, нейроны гиппокампа испытывают повышенную концентрацию АТФ в присутствии этих разобщающих белков. ^[12]^[16] Это заставляет ученых предположить, что UCP улучшают синаптическую пластичность и передачу. ^[12]

См. также

Развязывающий агент

Ссылки

^ Годри М.Дж., Ястрох М. (март 2019 г.). «Молекулярная эволюция разобщающих белков и последствия для функции мозга». Письма по неврологии . 696 : 140–145. дои : 10.1016/j.neulet.2018.12.027 . ПМИД 30582970 . S2CID 56595077 .
^ Недергаард Дж., Рикье Д., Козак Л.П. (октябрь 2005 г.). «Разобщение белков: современное состояние и терапевтические перспективы» . Отчеты ЭМБО . 6 (10): 917–21. дои : 10.1038/sj.embor.7400532 . ПМК 1369193 . ПМИД 16179945 .
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж Руссе С., Алвес-Герра MC, Мозо Дж., Миру Б., Кассар-Дульсье А.М., Буйо Ф., Рикье Д. (февраль 2004 г.). «Биология митохондриальных разобщающих белков» . Диабет . 53 (приложение 1): С130-5. doi : 10.2337/diabetes.53.2007.S130 . ПМИД 14749278 .
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д ^и Николлс, генеральный директор (2021). «Утечка митохондриальных протонов и разобщение белков» . Биохим Биофиз Акта Биоэнерг . 1862 (7): 148428. doi : 10.1016/j.bbabio.2021.148428 . ПМИД 33798544 . S2CID 232774851 .
^ Перейти обратно: ^а ^б Рупрехт, Джей-Джей; Кунджи, ERS (2020). «Семейство митохондриальных носителей SLC25: структура и механизм» . Тенденции биохимии. Наука . 45 (3): 244–258. дои : 10.1016/j.tibs.2019.11.001 . ПМЦ 7611774 . ПМИД 31787485 .
^ Перейти обратно: ^а ^б Кунджи, ERS; Кинг, М.С.; Рупрехт, Джей-Джей; Тангаратнараджа, К. (2020). «Семейство носителей SLC25: важные транспортные белки в митохондриальной физиологии и патологии» . Физиология (Бетесда) . 35 (5): 302–327. дои : 10.1152/физиол.00009.2020 . ПМЦ 7611780 . ПМИД 32783608 .
^ Гарретт Р.Х., Гришэм К.М. (2013). Биохимия (пятое издание, международное изд.). Китай: Мэри Финч. п. 668. ИСБН 978-1-133-10879-5 .
^ «Калифорнийская система контроля отравлений: салицилаты» . Архивировано из оригинала 2 августа 2014 г.
^ Гонг Д.В., Хе Ю., Карас М., Рейтман М. (сентябрь 1997 г.). «Разобщающий белок-3 является медиатором термогенеза, регулируемого гормоном щитовидной железы, бета3-адренергическими агонистами и лептином» . Журнал биологической химии . 272 (39): 24129–32. дои : 10.1074/jbc.272.39.24129 . ПМИД 9305858 .
^ Хаген Т., Видаль-Пуч А. (февраль 2002 г.). «Митохондриальные разобщающие белки в физиологии и заболеваниях человека». Минерва Медика . 93 (1): 41–57. ПМИД 11850613 .
^ Фельдманн Х.М., Голозубова В., Кэннон Б., Недергаард Дж. (февраль 2009 г.). «Аблация UCP1 вызывает ожирение и устраняет вызванный диетой термогенез у мышей, освобожденных от теплового стресса, живущих в термонейтральности» . Клеточный метаболизм . 9 (2): 203–9. дои : 10.1016/j.cmet.2008.12.014 . ПМИД 19187776 .
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час ^я ^дж ^к ^л ^м ^н ^тот ^п Эндрюс З.Б., Диано С., Хорват Т.Л. (ноябрь 2005 г.). «Митохондриальные разобщающие белки в ЦНС: в поддержку функционирования и выживания». Обзоры природы. Нейронаука . 6 (11): 829–40. дои : 10.1038/nrn1767 . ПМИД 16224498 . S2CID 14840725 .
^ Хорват Т.Л., Уорден CH, Хайос М., Ломбарди А., Гоглиа Ф., Диано С. (декабрь 1999 г.). «Белок 2, разобщающий мозг: несвязанные митохондрии нейронов предсказывают термические синапсы в гомеостатических центрах» . Журнал неврологии . 19 (23): 10417–27. doi : 10.1523/JNEUROSCI.19-23-10417.1999 . ПМК 6782406 . ПМИД 10575039 .
^ Перейти обратно: ^а ^б Джонс, ЮАР; Гогой, П.; Рупрехт, Джей-Джей; Кинг, М.С.; Ли, Ю.; Зогг, Т.; Пардон, Э.; Чанд, Д.; Сталь, С.; Коперман, DM; Котрим, Калифорния; Стейерт, Дж.; Крайтон, П.Г.; Моисеенкова-Белл, В.; Кунджи, ERS (2023). «Структурные основы ингибирования пуриновыми нуклеотидами человеческого разобщающего белка 1» . Научный адв . 9 (22): eadh4251. Бибкод : 2023SciA....9H4251J . дои : 10.1126/sciadv.adh4251 . ПМЦ 10413660 . ПМИД 37256948 .
^ Чжан С.И., Баффи Г., Перрет П., Краусс С., Перони О., Груич Д. и др. (июнь 2001 г.). «Развязка белка-2 негативно регулирует секрецию инсулина и является основной связью между ожирением, дисфункцией бета-клеток и диабетом 2 типа» . Клетка . 105 (6): 745–55. дои : 10.1016/s0092-8674(01)00378-6 . ПМИД 11440717 .
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с Диано С., Мэтьюз Р.Т., Патрило П., Ян Л., Бил М.Ф., Барнстейбл С.Дж., Хорват Т.Л. (ноябрь 2003 г.). «Развязка белка 2 предотвращает гибель нейронов, в том числе во время судорог: механизм предварительного кондиционирования» . Эндокринология . 144 (11): 5014–21. дои : 10.1210/en.2003-0667 . ПМИД 12960023 .
^ Перейти обратно: ^а ^б Ястрох М., Дивакаруни А.С., Мукерджи С., Треберг Дж.Р., Брэнд, доктор медицинских наук (14 июня 2010 г.). «Утечки митохондриальных протонов и электронов» . Очерки по биохимии . 47 : 53–67. дои : 10.1042/bse0470053 . ПМК 3122475 . ПМИД 20533900 .
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д ^и Майу Р.Дж., Харпер М.Э. (сентябрь 2011 г.). «Развязка белков и контроль производства митохондриальными активных форм кислорода». Свободно-радикальная биология и медицина . 51 (6): 1106–15. doi : 10.1016/j.freeradbiomed.2011.06.022 . ПМИД 21762777 .
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д ^и Брэнд, доктор медицинских наук, Эстевес Т.С. (август 2005 г.). «Физиологические функции митохондриальных разобщающих белков UCP2 и UCP3» . Клеточный метаболизм . 2 (2): 85–93. дои : 10.1016/j.cmet.2005.06.002 . ПМИД 16098826 .
^ Сридхар А., Чжао Ю (май 2017 г.). «Развязка белка 2 и метаболические заболевания» . Митохондрия . 34 : 135–140. дои : 10.1016/j.mito.2017.03.005 . ПМЦ 5477468 . ПМИД 28351676 .
^ Крайтон, П.Г.; Ли, Ю.; Кунджи, ERS (2017). «Молекулярные особенности разобщающего белка 1 подтверждают традиционный механизм, подобный митохондриальному переносчику» . Биохимия . 134 : 35–50. дои : 10.1016/j.biochi.2016.12.016 . ПМК 5395090 . ПМИД 28057583 .
^ Ричард Д., Клавель С., Хуан К., Санчис Д., Рикье Д. (ноябрь 2001 г.). «Развязка белка 2 в мозге: распределение и функция». Труды Биохимического общества . 29 (Часть 6): 812–7. дои : 10.1042/bst0290812 . ПМИД 11709080 .
^ Николлс Д.Г. , Уорд М.В. (апрель 2000 г.). «Мембранный потенциал митохондрий и эксайтотоксичность глутамата нейронов: смертность и милливольты». Тенденции в нейронауках . 23 (4): 166–74. дои : 10.1016/s0166-2236(99)01534-9 . ПМИД 10717676 . S2CID 11564585 .

[1] Годри М.Дж., Ястрох М. (март 2019 г.). «Молекулярная эволюция разобщающих белков и последствия для функции мозга». Письма по неврологии . 696 : 140–145. дои : 10.1016/j.neulet.2018.12.027 . ПМИД 30582970 . S2CID 56595077 .

[pmid16179945-2] Недергаард Дж., Рикье Д., Козак Л.П. (октябрь 2005 г.). «Разобщение белков: современное состояние и терапевтические перспективы» . Отчеты ЭМБО . 6 (10): 917–21. дои : 10.1038/sj.embor.7400532 . ПМК 1369193 . ПМИД 16179945 .

[Rousset_2004-3] Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж Руссе С., Алвес-Герра MC, Мозо Дж., Миру Б., Кассар-Дульсье А.М., Буйо Ф., Рикье Д. (февраль 2004 г.). «Биология митохондриальных разобщающих белков» . Диабет . 53 (приложение 1): С130-5. doi : 10.2337/diabetes.53.2007.S130 . ПМИД 14749278 .

[:0-4] Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д ^и Николлс, генеральный директор (2021). «Утечка митохондриальных протонов и разобщение белков» . Биохим Биофиз Акта Биоэнерг . 1862 (7): 148428. doi : 10.1016/j.bbabio.2021.148428 . ПМИД 33798544 . S2CID 232774851 .

[:1-5] Перейти обратно: ^а ^б Рупрехт, Джей-Джей; Кунджи, ERS (2020). «Семейство митохондриальных носителей SLC25: структура и механизм» . Тенденции биохимии. Наука . 45 (3): 244–258. дои : 10.1016/j.tibs.2019.11.001 . ПМЦ 7611774 . ПМИД 31787485 .

[:2-6] Перейти обратно: ^а ^б Кунджи, ERS; Кинг, М.С.; Рупрехт, Джей-Джей; Тангаратнараджа, К. (2020). «Семейство носителей SLC25: важные транспортные белки в митохондриальной физиологии и патологии» . Физиология (Бетесда) . 35 (5): 302–327. дои : 10.1152/физиол.00009.2020 . ПМЦ 7611780 . ПМИД 32783608 .

[7] Гарретт Р.Х., Гришэм К.М. (2013). Биохимия (пятое издание, международное изд.). Китай: Мэри Финч. п. 668. ИСБН 978-1-133-10879-5 .

[8] «Калифорнийская система контроля отравлений: салицилаты» . Архивировано из оригинала 2 августа 2014 г.

[9] Гонг Д.В., Хе Ю., Карас М., Рейтман М. (сентябрь 1997 г.). «Разобщающий белок-3 является медиатором термогенеза, регулируемого гормоном щитовидной железы, бета3-адренергическими агонистами и лептином» . Журнал биологической химии . 272 (39): 24129–32. дои : 10.1074/jbc.272.39.24129 . ПМИД 9305858 .

[10] Хаген Т., Видаль-Пуч А. (февраль 2002 г.). «Митохондриальные разобщающие белки в физиологии и заболеваниях человека». Минерва Медика . 93 (1): 41–57. ПМИД 11850613 .

[11] Фельдманн Х.М., Голозубова В., Кэннон Б., Недергаард Дж. (февраль 2009 г.). «Аблация UCP1 вызывает ожирение и устраняет вызванный диетой термогенез у мышей, освобожденных от теплового стресса, живущих в термонейтральности» . Клеточный метаболизм . 9 (2): 203–9. дои : 10.1016/j.cmet.2008.12.014 . ПМИД 19187776 .

[Andrews_2005-12] Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час ^я ^дж ^к ^л ^м ^н ^тот ^п Эндрюс З.Б., Диано С., Хорват Т.Л. (ноябрь 2005 г.). «Митохондриальные разобщающие белки в ЦНС: в поддержку функционирования и выживания». Обзоры природы. Нейронаука . 6 (11): 829–40. дои : 10.1038/nrn1767 . ПМИД 16224498 . S2CID 14840725 .

[13] Хорват Т.Л., Уорден CH, Хайос М., Ломбарди А., Гоглиа Ф., Диано С. (декабрь 1999 г.). «Белок 2, разобщающий мозг: несвязанные митохондрии нейронов предсказывают термические синапсы в гомеостатических центрах» . Журнал неврологии . 19 (23): 10417–27. doi : 10.1523/JNEUROSCI.19-23-10417.1999 . ПМК 6782406 . ПМИД 10575039 .

[:3-14] Перейти обратно: ^а ^б Джонс, ЮАР; Гогой, П.; Рупрехт, Джей-Джей; Кинг, М.С.; Ли, Ю.; Зогг, Т.; Пардон, Э.; Чанд, Д.; Сталь, С.; Коперман, DM; Котрим, Калифорния; Стейерт, Дж.; Крайтон, П.Г.; Моисеенкова-Белл, В.; Кунджи, ERS (2023). «Структурные основы ингибирования пуриновыми нуклеотидами человеческого разобщающего белка 1» . Научный адв . 9 (22): eadh4251. Бибкод : 2023SciA....9H4251J . дои : 10.1126/sciadv.adh4251 . ПМЦ 10413660 . ПМИД 37256948 .

[15] Чжан С.И., Баффи Г., Перрет П., Краусс С., Перони О., Груич Д. и др. (июнь 2001 г.). «Развязка белка-2 негативно регулирует секрецию инсулина и является основной связью между ожирением, дисфункцией бета-клеток и диабетом 2 типа» . Клетка . 105 (6): 745–55. дои : 10.1016/s0092-8674(01)00378-6 . ПМИД 11440717 .

[Diano_2003-16] Перейти обратно: ^а ^б ^с Диано С., Мэтьюз Р.Т., Патрило П., Ян Л., Бил М.Ф., Барнстейбл С.Дж., Хорват Т.Л. (ноябрь 2003 г.). «Развязка белка 2 предотвращает гибель нейронов, в том числе во время судорог: механизм предварительного кондиционирования» . Эндокринология . 144 (11): 5014–21. дои : 10.1210/en.2003-0667 . ПМИД 12960023 .

[Jastroch_2010-17] Перейти обратно: ^а ^б Ястрох М., Дивакаруни А.С., Мукерджи С., Треберг Дж.Р., Брэнд, доктор медицинских наук (14 июня 2010 г.). «Утечки митохондриальных протонов и электронов» . Очерки по биохимии . 47 : 53–67. дои : 10.1042/bse0470053 . ПМК 3122475 . ПМИД 20533900 .

[Mailloux_2011-18] Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д ^и Майу Р.Дж., Харпер М.Э. (сентябрь 2011 г.). «Развязка белков и контроль производства митохондриальными активных форм кислорода». Свободно-радикальная биология и медицина . 51 (6): 1106–15. doi : 10.1016/j.freeradbiomed.2011.06.022 . ПМИД 21762777 .

[Brand_2005-19] Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д ^и Брэнд, доктор медицинских наук, Эстевес Т.С. (август 2005 г.). «Физиологические функции митохондриальных разобщающих белков UCP2 и UCP3» . Клеточный метаболизм . 2 (2): 85–93. дои : 10.1016/j.cmet.2005.06.002 . ПМИД 16098826 .

[20] Сридхар А., Чжао Ю (май 2017 г.). «Развязка белка 2 и метаболические заболевания» . Митохондрия . 34 : 135–140. дои : 10.1016/j.mito.2017.03.005 . ПМЦ 5477468 . ПМИД 28351676 .

[21] Крайтон, П.Г.; Ли, Ю.; Кунджи, ERS (2017). «Молекулярные особенности разобщающего белка 1 подтверждают традиционный механизм, подобный митохондриальному переносчику» . Биохимия . 134 : 35–50. дои : 10.1016/j.biochi.2016.12.016 . ПМК 5395090 . ПМИД 28057583 .

[22] Ричард Д., Клавель С., Хуан К., Санчис Д., Рикье Д. (ноябрь 2001 г.). «Развязка белка 2 в мозге: распределение и функция». Труды Биохимического общества . 29 (Часть 6): 812–7. дои : 10.1042/bst0290812 . ПМИД 11709080 .

[23] Николлс Д.Г. , Уорд М.В. (апрель 2000 г.). «Мембранный потенциал митохондрий и эксайтотоксичность глутамата нейронов: смертность и милливольты». Тенденции в нейронауках . 23 (4): 166–74. дои : 10.1016/s0166-2236(99)01534-9 . ПМИД 10717676 . S2CID 11564585 .

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11]

[12]

[13]

[14]

[15]

[16]

[17]

[18]

[19]

[20]

[21]

[22]

[23]