Праймер (молекулярная биология)
Праймер , — это короткая одноцепочечная нуклеиновая кислота используемая всеми живыми организмами для инициации синтеза ДНК . праймер Синтетический также может называться «олиго » , сокращенно от «олигонуклеотид». Ферменты ДНК-полимеразы (отвечающие за репликацию ДНК) способны добавлять нуклеотиды только к 3'-концу существующей нуклеиновой кислоты, поэтому требуется, чтобы праймер был связан с матрицей, прежде чем ДНК-полимераза сможет начать комплементарную цепь. [1] ДНК-полимераза добавляет нуклеотиды после связывания с праймером РНК и синтезирует всю цепь. Позже нити РНК необходимо аккуратно удалить и заменить их нуклеотидами ДНК, образующими область разрыва, известную как разрыв, который заполняется с помощью фермента, называемого лигазой. [2] Для процесса удаления РНК-праймера требуется несколько ферментов, таких как Fen1, Lig1 и другие, которые работают в координации с ДНК-полимеразой, чтобы обеспечить удаление нуклеотидов РНК и добавление нуклеотидов ДНК. В живых организмах используются исключительно праймеры для РНК, тогда как в лабораторных методах биохимии и молекулярной биологии , требующих синтеза ДНК in vitro (таких как секвенирование ДНК и полимеразная цепная реакция ), обычно используются праймеры для ДНК, поскольку они более устойчивы к температуре. Праймеры могут быть разработаны в лаборатории для конкретных реакций, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР). При разработке праймеров для ПЦР необходимо учитывать определенные параметры, такие как температура плавления праймеров и температура отжига самой реакции. Более того, ДНК-связывающая последовательность праймера in vitro должна быть специально выбрана, что делается с использованием метода, называемого инструментом поиска базового локального выравнивания (BLAST), который сканирует ДНК и находит специфические и уникальные области для связывания праймера.
РНК-праймеры in vivo
[ редактировать ]Праймеры РНК используются живыми организмами инициации синтеза для цепи ДНК . Класс ферментов, называемых примазами, добавляет комплементарный праймер РНК к матрице чтения de novo как на ведущей , так и на отстающей цепи . Начиная со свободного 3'-ОН праймера, известного как конец праймера, ДНК-полимераза может удлинить вновь синтезированную цепь. Ведущая цепь при репликации ДНК синтезируется одним непрерывным куском, перемещающимся вместе с репликационной вилкой , и для начала синтеза требуется только начальный праймер РНК. В отстающей цепи ДНК-матрица движется в направлении 5’→3’ . Поскольку ДНК-полимераза не может добавлять основания в направлении 3'→5', комплементарные цепи матрицы, ДНК синтезируется «обратно» в виде коротких фрагментов, удаляющихся от репликационной вилки, известных как фрагменты Оказаки . В отличие от ведущей цепи, этот метод приводит к многократному запуску и остановке синтеза ДНК, что требует наличия нескольких праймеров для РНК. Вдоль матрицы ДНК примаза вкрапляет РНК- праймеры , которые ДНК-полимераза использует для синтеза ДНК, в направлении 5'→3'. [1]
Другим примером праймеров, используемых для синтеза ДНК, является обратная транскрипция . Обратная транскриптаза — это фермент, который использует матричную цепь РНК для синтеза комплементарной цепи ДНК. ДНК-полимеразный компонент обратной транскриптазы требует наличия существующего 3'-конца для начала синтеза. [1]
Удаление праймера
[ редактировать ]После вставки фрагментов Оказаки праймеры РНК удаляются (механизм удаления у прокариот и эукариот различается ) и заменяются новыми дезоксирибонуклеотидами , которые заполняют пробелы там, где присутствовал праймер РНК. Затем ДНК-лигаза соединяет фрагментированные цепи вместе, завершая синтез отстающей цепи. [1]
У прокариот ДНК-полимераза I синтезирует фрагмент Оказаки до тех пор, пока он не достигнет предыдущего праймера РНК. Затем фермент одновременно действует как 5'→3'-экзонуклеаза , удаляя рибонуклеотиды праймера спереди и добавляя дезоксирибонуклеотиды сзади. Как полимеризация, так и удаление праймера РНК происходят в направлении 5'→3' , и полимераза I может выполнять эти действия одновременно; это известно как «Перевод Ника». [3] Трансляция Ника относится к синхронизированной активности полимеразы I при удалении праймера РНК и добавлении дезоксирибонуклеотидов . Позже между нитями образуется разрыв, называемый разрывом, который закрывается с помощью ДНК-лигазы .
У эукариот удаление праймеров РНК в отстающей цепи необходимо для завершения репликации. Таким образом, по мере синтеза отстающей цепи ДНК-полимеразой δ в 5'→3' направлении фрагменты Оказаки образуются , представляющие собой прерывистые цепи ДНК. Затем, когда ДНК-полимераза достигает 5'-конца праймера РНК из предыдущего фрагмента Оказаки, она смещает 5'-конец праймера в одноцепочечный лоскут РНК, который удаляется путем расщепления нуклеазой. Расщепление лоскутов РНК включает три метода удаления праймера. [4] Первая возможность удаления праймера - это создание короткого лоскута, который непосредственно удаляется эндонуклеазой 1, специфичной для структуры лоскута (FEN-1), которая расщепляет нависающий 5' лоскут. Этот метод известен как путь удаления праймера РНК с помощью короткого лоскута. [5] Второй способ расщепления праймера РНК — это разрушение цепи РНК с помощью РНКазы , у эукариот она известна как РНКаза H2. Этот фермент разрушает большую часть отожженного праймера РНК, за исключением нуклеотидов, близких к 5'-концу праймера. Таким образом, оставшиеся нуклеотиды отображаются в лоскуте, который отщепляется с помощью FEN-1. Последний возможный метод удаления праймера РНК известен как путь длинного лоскута. [5] На этом пути задействовано несколько ферментов, которые удлиняют праймер РНК, а затем отщепляют его. Лоскуты удлинены 5'-3'- хеликазой , известной как Pif1 . После добавления нуклеотидов к лоскуту с помощью Pif1 длинный лоскут стабилизируется репликационным белком А (RPA). ДНК, связанная с RPA, ингибирует активность или рекрутирование FEN1, в результате чего для расщепления лоскута должна быть задействована другая нуклеаза. [4] Эта вторая нуклеаза представляет собой нуклеазу ДНК2 , обладающую геликазно-нуклеазной активностью, которая расщепляет длинный лоскут праймера РНК, который затем оставляет после себя пару нуклеотидов, расщепляемых FEN1. В конце, когда все праймеры РНК удалены, между фрагментами Оказаки образуются разрывы , которые заполняются дезоксирибонуклеотидами с помощью фермента, известного как лигаза1 , посредством процесса, называемого лигированием .
Использование синтетических грунтовок
[ редактировать ]
Синтетические праймеры, иногда называемые олигонуклеотидами, представляют собой химически синтезированные олигонуклеотиды , обычно состоящие из ДНК, которые можно настроить для отжига с определенным участком ДНК-матрицы. В растворе праймер спонтанно гибридизуется с матрицей посредством спаривания оснований Уотсона-Крика, а затем удлиняется ДНК-полимеразой. Возможность создавать и настраивать синтетические праймеры оказалась бесценным инструментом, необходимым для различных молекулярно-биологических подходов, включающих анализ ДНК. И метод терминации цепи Сэнгера , и метод секвенирования ДНК « Next-Gen » требуют праймеров для инициации реакции. [1]
Дизайн праймера для ПЦР
[ редактировать ]Полимеразная цепная реакция (ПЦР) использует пару индивидуальных праймеров для направления удлинения ДНК друг к другу на противоположных концах амплифицированной последовательности. Эти праймеры обычно имеют длину от 18 до 24 оснований и должны кодировать только определенные участки выше и ниже амплифицированной последовательности. Праймер, который может связываться с несколькими участками ДНК, амплифицирует их все, устраняя необходимость ПЦР. [1]
При разработке пары праймеров для ПЦР необходимо учитывать несколько критериев. реакции Пары праймеров должны иметь одинаковые температуры плавления, поскольку отжиг во время ПЦР происходит для обеих цепей одновременно, и эта общая температура плавления не должна быть слишком выше или ниже температуры отжига . Праймер с T m (температурой плавления), намного превышающей температуру реакции отжига, может вызвать неправильную гибридизацию и распространиться в неправильном месте последовательности ДНК. A T m, значительно ниже температуры отжига, может вообще не отжечься и не растянуться.
Кроме того, необходимо выбирать последовательности праймеров для уникального отбора участка ДНК, избегая возможности гибридизации с соседней аналогичной последовательностью. Обычно используемым методом выбора сайта праймера является поиск BLAST , при котором можно увидеть все возможные области, с которыми может связываться праймер. Для поиска BLAST можно использовать как нуклеотидную последовательность, так и сам праймер. Бесплатный инструмент NCBI Primer-BLAST объединяет разработку праймеров и поиск BLAST в одном приложении. [6] как и коммерческие программные продукты, такие как ePrime и Beacon Designer . Компьютерное моделирование теоретических результатов ПЦР ( электронная ПЦР ) может быть выполнено для помощи в разработке праймера путем указания температур плавления и отжига и т. Д. [7]
По состоянию на 2014 год бесплатно доступно множество онлайн-инструментов для разработки праймеров, некоторые из которых ориентированы на конкретные применения ПЦР. Праймеры с высокой специфичностью для подмножества шаблонов ДНК при наличии множества подобных вариантов можно создать с помощью некоторого программного обеспечения (например, DECIPHER [8] ) или разрабатываться самостоятельно для конкретной группы животных. [9]
Выбор конкретной области ДНК для связывания праймера требует некоторых дополнительных соображений. Следует избегать областей с высоким содержанием мононуклеотидных и динуклеотидных повторов, поскольку может произойти образование петель, что будет способствовать несгибридизации. Праймеры не должны легко отжигаться с другими праймерами в смеси; это явление может привести к образованию продуктов «праймерных димеров», загрязняющих конечный раствор. Праймеры также не должны сильно отжигаться сами по себе, поскольку внутренние шпильки и петли могут препятствовать отжигу с матричной ДНК.
При разработке праймеров к задним концам каждого праймера можно добавлять дополнительные нуклеотидные основания, в результате чего на каждом конце амплифицированной области создается индивидуальная кэп-последовательность. Одним из применений этой практики является использование при клонировании ТА , специальной методике субклонирования, аналогичной ПЦР, эффективность которой можно повысить за счет добавления хвостов AG к 5'- и 3'-концам. [10]
Вырожденные праймеры
[ редактировать ]В некоторых ситуациях может потребоваться использование вырожденных праймеров. Это смеси праймеров, схожих, но не идентичных. Это может быть удобно при амплификации одного и того же гена из разных организмов , поскольку последовательности, вероятно, похожи, но не идентичны. Этот метод полезен, поскольку сам генетический код является вырожденным , то есть несколько разных кодонов могут кодировать одну и ту же аминокислоту . Это позволяет разным организмам иметь существенно различающуюся генетическую последовательность, кодирующую очень похожий белок. По этой причине вырожденные праймеры также используются, когда конструкция праймеров основана на последовательности белка , поскольку конкретная последовательность кодонов неизвестна. Следовательно, последовательность праймера, соответствующая аминокислоте изолейцин , может быть «ATH», где A означает аденин , T — тимин , а H — аденин , тимин или цитозин , в соответствии с генетическим кодом каждого кодона , используя символы IUPAC для обозначения вырожденные основания . Вырожденные праймеры могут не идеально гибридизоваться с целевой последовательностью, что может значительно снизить специфичность ПЦР-амплификации.
Вырожденные праймеры широко используются и чрезвычайно полезны в области микробной экологии . Они позволяют амплифицировать гены до сих пор некультивируемых микроорганизмов или позволяют извлекать гены из организмов, для которых геномная информация недоступна. Обычно вырожденные праймеры создаются путем выравнивания последовательности генов, найденной в GenBank . Различия между последовательностями учитываются с помощью вырождения IUPAC для отдельных оснований. Затем синтезируют праймеры для ПЦР в виде смеси праймеров, соответствующих всем перестановкам последовательности кодонов.
См. также
[ редактировать ]- Синтез олигонуклеотидов - методы производства праймеров.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б с д и ж Кокс, Майкл М. (2015). Молекулярная биология: принципы и практика . Нью-Йорк: WH Freeman and Company. стр. 221–238, 369–376, 592–593. ISBN 9781464126147 .
- ^ Хеннеке, Гислен (26 сентября 2012 г.). «Восстановление in vitro удаления праймера РНК у архей показывает существование двух путей» . Биохимический журнал . 447 (2): 271–280. дои : 10.1042/BJ20120959 . ISSN 0264-6021 . ПМИД 22849643 .
- ^ Дудна; Кокс; О'Доннелл, Дженнифер; Майкл М.; Михаил (21 декабря 2016 г.). Молекулярная биология: принципы и практика . У. Х. Фриман. ISBN 9781319116378 .
{{cite book}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ) - ^ Jump up to: а б Улер, Джей П.; Фалькенберг, Мария (01 октября 2015 г.). «Удаление праймера во время репликации митохондриальной ДНК млекопитающих» . Восстановление ДНК . 34 : 28–38. дои : 10.1016/j.dnarep.2015.07.003 . ISSN 1568-7864 . ПМИД 26303841 .
- ^ Jump up to: а б Балакришнан, Лата; Бамбара, Роберт А. (01 февраля 2013 г.). «Фрагментный метаболизм Оказаки» . Перспективы Колд-Спринг-Харбор в биологии . 5 (2): а010173. doi : 10.1101/cshperspect.a010173 . ISSN 1943-0264 . ПМЦ 3552508 . ПМИД 23378587 .
- ^ «ПРАЙМЕР-БЛАСТ» .
- ^ «Электронный ПЦР» . NCBI — Национальный центр биотехнологической информации . Проверено 13 марта 2012 г.
- ^ «О ДЕШИФЕРЕ» . Wellcome Trust Sanger Institute . Проверено 12 февраля 2014 г.
- ^ Карабанов, Д.П.; Беккер, Э.И.; Павлов Д.Д.; Боровикова Е.А.; Кодухова Ю.В.; Котов А.А. (1 февраля 2022 г.). "Новые наборы праймеров для ДНК-идентификации неместных видов рыб Волго-Камского бассейна (Европейская часть России)" . Вода . 14 (3): 437. дои : 10.3390/w14030437 . ISSN 2073-4441 .
- ^ Аденозин, добавленный на конце праймера 50, улучшил эффективность клонирования ТА продуктов полимеразной цепной реакции, Ри-Хе Пэн, Ай-Шэн Сюн, Цзинь-ге Лю, Фан Сюй, Цай Бинь, Хун Чжу, Цюань-Хун Яо
