Аллостерический модулятор

В фармакологии и биохимии , аллостерические модуляторы представляют собой группу веществ, которые связываются с рецептором изменяя реакцию этого рецептора на стимулы. Некоторые из них, например бензодиазепины или алкоголь , действуют как психоактивные препараты. ^{[ 1 ]} Сайт, с которым связывается аллостерический модулятор (т.е. аллостерический сайт ), не является тем же, с которым связывался бы эндогенный агонист рецептора (т.е. ортостерический сайт ). Модуляторы и агонисты могут быть названы лигандами рецепторов . ^{[ 2 ]}

Аллостерические модуляторы могут быть одного из трех типов: положительные, отрицательные или нейтральные. Положительные типы усиливают реакцию рецептора за счет увеличения вероятности того, что агонист свяжется с рецептором (т.е. сродства ), увеличения его способности активировать рецептор (т.е. эффективности ) или того и другого. Отрицательные типы снижают аффинность и/или эффективность агониста. Нейтральные типы не влияют на активность агонистов, но могут препятствовать связыванию других модуляторов с аллостерическим сайтом. Некоторые модуляторы также действуют как аллостерические агонисты и сами по себе оказывают агонистический эффект. ^{[ 2 ]}

Термин «аллостерический» происходит от греческого языка. Аллос означает «другой», а стерео — «твердый» или «форма». Это можно перевести как «другая форма», что указывает на конформационные изменения внутри рецепторов, вызванные модуляторами, посредством которых модуляторы влияют на функцию рецептора. ^{[ 3 ]}

Введение

Аллостерические модуляторы могут изменять сродство и эффективность других веществ, действующих на рецептор. Модулятор также может повышать сродство и снижать эффективность или наоборот. ^{[ 4 ]} Сродство – это способность вещества связываться с рецептором . Эффективность — это способность вещества активировать рецептор, выраженная в процентах от способности вещества активировать рецептор по сравнению с эндогенным агонистом рецептора . Если эффективность равна нулю, вещество считается антагонистом . ^{[ 1 ]}

Сайт, с которым связываются эндогенные агонисты, называется ортостерическим сайтом . Модуляторы не привязываются к этому сайту. Они связываются с любыми другими подходящими сайтами, которые называются аллостерическими сайтами . ^{[ 2 ]} При связывании модуляторы обычно изменяют трехмерную структуру (т.е. конформацию ) рецептора. Это часто приводит к изменению ортостерического сайта, что может изменить эффект связывания агониста. ^{[ 4 ]} Аллостерические модуляторы также могут стабилизировать одну из нормальных конфигураций рецептора. ^{[ 5 ]}

На практике модуляция может быть сложной. Модулятор может функционировать как частичный агонист , то есть ему не нужен агонист, который он модулирует, для достижения агонистических эффектов. ^{[ 6 ]} Кроме того, модуляция может не в равной степени влиять на сродство или эффективность различных агонистов. Если группа разных агонистов, которые должны оказывать одинаковое действие, связываются с одним и тем же рецептором, некоторые модуляторы могут модулировать агонисты по-разному. ^{[ 4 ]}

Классы

Модулятор может иметь 3 эффекта внутри рецептора. Одним из них является его способность или неспособность активировать рецептор (2 возможности). Два других — это аффинность и эффективность агониста. Их можно увеличить, понизить или оставить без изменений (3 и 3 возможности). Это дает 17 возможных комбинаций модулятора. ^{[ 4 ]} Их 18 (=2*3*3), если также включен нейтральный тип модулятора.

По всем практическим соображениям эти комбинации можно обобщить только до 5 классов. ^{[ 4 ]} и 1 нейтральный:

положительные аллостерические модуляторы ( ПАМ ) повышают аффинность и/или эффективность агониста. ^{[ 4 ]} Клиническими примерами являются бензодиазепины, такие как диазепам , алпразолам и хлордиазепоксид , которые модулируют ГАМК _А -рецепторы , и цинакальцет , который модулирует кальций-чувствительные рецепторы . ^{[ 7 ]}
- PAM-агонисты действуют как PAM, но также как агонисты с агонистами, которые они модулируют, и без них. ^{[ 4 ]}
- PAM-антагонисты действуют аналогично PAM, но также действуют как антагонисты и снижают эффективность агонистов, которые они модулируют. ^{[ 4 ]}
отрицательные аллостерические модуляторы ( NAM ) снижают аффинность и/или эффективность агониста. ^{[ 4 ]} Маравирок – это лекарство, модулирующее CCR5 . Фенобам , разеглюрант и дипраглурант являются экспериментальными GRM5 . модуляторами ^{[ 7 ]}
- NAM-агонисты действуют как NAM, но также и как агонисты с агонистами, которые они модулируют, и без них. ^{[ 4 ]}
нейтральные аллостерические модуляторы не влияют на активность агонистов, но связываются с рецептором и предотвращают связывание PAM и других модуляторов с тем же рецептором, тем самым ингибируя их модуляцию. ^{[ 4 ]} Нейтральные модуляторы также называются молчащими аллостерическими модуляторами ( SAM ). ^{[ 6 ]} или нейтральные аллостерические лиганды ( NAL ). Примером является 5-метил-6-(фенилэтинил)пиридин ( 5MPEP ), исследовательский химикат , который связывается с GRM5. ^{[ 8 ]}

Механизмы

Благодаря разнообразию мест на рецепторах, которые могут служить сайтами аллостерической модуляции, а также отсутствию окружающих их регуляторных сайтов, аллостерические модуляторы могут действовать по самым разным механизмам. ^{[ нужна ссылка ]}

Модулирующая привязка

Некоторые аллостерические модуляторы вызывают конформационные изменения в их рецепторе-мишени, что увеличивает аффинность связывания и/или эффективность агониста рецептора. ^{[ 2 ]} Примеры таких модуляторов включают бензодиазепины и барбитураты , которые являются ГАМК _А. положительными аллостерическими модуляторами рецептора Бензодиазепины, такие как диазепам, ГАМК _А рецептора связываются между субъединицами α и γ ионных каналов и увеличивают частоту открытия каналов, но не продолжительность каждого открытия. Барбитураты, такие как фенобарбитал, связывают β-домены и увеличивают продолжительность каждого открытия, но не частоту. ^{[ 9 ]}

Модулирующая развязка

Некоторые модуляторы действуют, чтобы стабилизировать конформационные изменения, связанные с состоянием, связанным с агонистом. Это увеличивает вероятность того, что рецептор окажется в активной конформации, но не препятствует переходу рецептора обратно в неактивное состояние. При большей вероятности оставаться в активном состоянии рецептор будет дольше связывать агонист. Рецепторы AMPA , модулированные анирацетамом и CX614, будут деактивироваться медленнее и облегчать общий транспорт катионов. Вероятно, это достигается за счет связывания анирацетама или CX614 с задней частью «раковины моллюска», которая содержит сайт связывания глутамата , стабилизируя закрытую конформацию, связанную с активацией рецептора AMPA. ^{[ 5 ]}^{[ 9 ]}

Предотвращение десенсибилизации

Общий сигнал можно усилить, предотвратив десенсибилизацию рецептора. Десенсибилизация предотвращает активацию рецептора, несмотря на присутствие агониста. Это часто вызвано повторным или интенсивным воздействием агониста. Устранение или уменьшение этого явления увеличивает общую активацию рецептора. Рецепторы AMPA подвержены десенсибилизации из-за нарушения интерфейса димера лигандсвязывающего домена. циклотиазид стабилизирует этот интерфейс и замедляет десенсибилизацию и поэтому считается положительным аллостерическим модулятором. Было показано, что ^{[ 5 ]}

Стабилизация активной/неактивной конформации

Модуляторы могут напрямую регулировать рецепторы, а не влиять на связывание агониста. Подобно стабилизации связанной конформации рецептора, модулятор, действующий в этом механизме, стабилизирует конформацию, связанную с активным или неактивным состоянием. Это увеличивает вероятность того, что рецептор перейдет в стабилизированное состояние и соответствующим образом модулирует активность рецептора. Рецепторы, чувствительные к кальцию, можно модулировать таким образом, регулируя уровень pH . Более низкий pH увеличивает стабильность неактивного состояния и тем самым снижает чувствительность рецептора. Предполагается, что изменения зарядов, связанные с корректировкой pH, вызывают конформационные изменения рецептора, способствующие инактивации. ^{[ 10 ]}

Взаимодействие с агонистами

Модуляторы, которые повышают только аффинность частичных и полных агонистов, позволяют быстрее достичь максимума эффективности при более низких концентрациях агониста, т.е. наклон и плато кривой зависимости доза-эффект смещаются в сторону более низких концентраций. ^{[ 4 ]}

Модуляторы, повышающие эффективность, увеличивают максимальную эффективность частичных агонистов. Полные агонисты уже полностью активируют рецепторы, поэтому модуляторы не влияют на их максимальную эффективность, но несколько смещают кривые ответа в сторону более низких концентраций агонистов. ^{[ 4 ]}

% ответа рецептора как функция логарифмической концентрации агониста [Ago]
PAM сдвигают начальную кривую ответа агониста (сплошная кривая) в сторону более низких концентраций агониста за счет увеличения аффинности и/или увеличения максимального ответа за счет повышения эффективности. Пунктирные кривые — это два примера из многих возможных кривых после добавления PAM. Стрелки показывают примерное направление смещения кривых. ^{[ 4 ]}
PAM-агонисты действуют аналогично PAM, но сами являются агонистами. Таким образом, они вызывают ответ даже при минимальных концентрациях агонистов, которые они модулируют. ^{[ 4 ]}
Антагонисты PAM повышают сродство к агонистам и смещают их кривые в сторону более низких концентраций, но, работая как антагонисты, они также снижают максимальные ответы. ^{[ 4 ]}
NAM Кривые смещаются в сторону более высоких концентраций за счет снижения сродства и/или более низких максимальных ответов за счет снижения эффективности. По сравнению с PAM, эффекты NAM обратны. ^{[ 4 ]}
NAM-агонисты действуют так же, как NAM, но сами являются агонистами. Таким образом, они вызывают ответ даже при минимальных концентрациях агонистов, которые они модулируют. ^{[ 4 ]}

Медицинское значение

Преимущества

Родственные рецепторы имеют ортостерические сайты, которые очень похожи по структуре, поскольку мутации внутри этого сайта могут особенно снизить функцию рецептора. Это может быть вредно для организмов, поэтому эволюция не всегда благоприятствует таким изменениям. Аллостерические сайты менее важны для функции рецепторов, поэтому они часто имеют большие различия между родственными рецепторами. Вот почему по сравнению с ортостерическими препаратами аллостерические препараты могут быть очень специфичными , то есть воздействовать только на очень ограниченный набор типов рецепторов. Однако такая изменчивость аллостерических сайтов происходит и между видами, поэтому эффекты аллостерических препаратов сильно различаются между видами. ^{[ 11 ]}

Модуляторы не могут полностью включать или выключать рецепторы, поскольку действие модулятора зависит от эндогенных лигандов, таких как нейротрансмиттеры , производство которых в организме ограничено и контролируется. Это может снизить риск передозировки по сравнению с ортостерическими препаратами аналогичного действия. Это также может позволить разработать стратегию, при которой дозы, достаточно большие для насыщения рецепторов, можно безопасно принимать и продлевать действие препарата. ^{[ 4 ]} Это также позволяет рецепторам активироваться в заданное время (т.е. в ответ на стимул) вместо постоянной активации агонистом, независимо от времени или цели. ^{[ 12 ]}

Модуляторы влияют на существующие реакции внутри тканей и могут обеспечить специфическое нацеливание лекарств на ткани. В этом отличие от ортостерических препаратов, которые имеют тенденцию оказывать менее целенаправленное воздействие на все рецепторы организма, с которыми они могут связываться. ^{[ 4 ]}

Также было показано, что некоторым модуляторам не хватает десенсибилизирующего эффекта, который оказывают некоторые агонисты. Никотиновые рецепторы ацетилхолина , например, быстро снижают чувствительность в присутствии агонистов, но сохраняют нормальную функцию в присутствии ПАМ. ^{[ 13 ]}

Приложения

Аллостерическая модуляция оказалась полезной при многих состояниях, которые ранее было трудно контролировать с помощью других фармацевтических препаратов. К ним относятся:

уменьшение негативных симптомов (дефицита), связанных с шизофренией , с помощью экспериментальных mGluR5, положительных модуляторов таких как 4-нитро- N- (1,3-дифенил-1 H -пиразол-5-ил)бензамид ( VU-29 ). ^{[ 14 ]}
снижение беспокойства за счет положительной модуляции рецепторов ГАМК. ^{[ 9 ]}
снижение интенсивности нарушений сна за счет положительной регуляции ГАМК-рецепторов. ^{[ 9 ]}
уменьшение депрессивных симптомов большого депрессивного расстройства и шизофрении путем положительной модуляции рецепторов дофамина. Примеры включают DETQ , DPTQ и LY3154207 которые являются экспериментальными D1 _{положительными модуляторами рецептора} , . ^{[ 15 ]}

См. также

Ссылки

^ Jump up to: ^а ^б Позвонил Х.П., Риттер Дж.М., Флауэр Р.Дж., Хендерсон Дж. (2016). Фармакология Ранга и Дейла (8-е изд.). Эльзевир. стр. 6–20. ISBN 978-0-7020-5362-7 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д Нойбиг Р.Р., Спеддинг М., Кенакин Т., Христопулос А. (декабрь 2003 г.). «Комитет Международного союза фармакологии по номенклатуре рецепторов и классификации лекарств. XXXVIII. Обновленная информация о терминах и символах в количественной фармакологии». Фармакологические обзоры . 55 (4): 597–606. дои : 10.1124/пр.55.4.4 . ПМИД 14657418 .
^ Нельсон Д.Л., Кокс М.М. (2008). Ленингерские принципы биохимии (5-е изд.). У. Х. Фриман. стр. 162 . ISBN 978-0-7167-7108-1 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час ^я ^дж ^к ^л ^м ^н ^тот ^п ^д ^р ^с ^т Кенакин Т.П. (2017). Фармакология в открытии и разработке лекарств: понимание реакции на лекарства (2-е изд.). Академическая пресса. стр. 102–119. дои : 10.1016/B978-0-12-803752-2.00005-3 . ISBN 978-0-12-803752-2 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с Джин Р., Кларк С., Уикс А.М., Дадман Дж.Т., Гуо Э., Партин К.М. (сентябрь 2005 г.). «Механизм действия положительных аллостерических модуляторов на АМРА-рецепторы» . Журнал неврологии . 25 (39): 9027–9036. doi : 10.1523/JNEUROSCI.2567-05.2005 . ПМК 6725607 . ПМИД 16192394 .
^ Jump up to: ^а ^б Стивенс Б., Гендель ТМ (2013). «Олигомеризация и аллостерия хемокиновых рецепторов» . Прогресс молекулярной биологии и трансляционной науки . 115 . Академическая пресса: 375–420. дои : 10.1016/B978-0-12-394587-7.00009-9 . ISBN 978-0-12-394587-7 . ПМК 4072031 . ПМИД 23415099 .
^ Jump up to: ^а ^б Меланкон Б.Дж., Хопкинс С.Р., Вуд М.Р., Эммитт К.А., Нисвендер С.М., Христопулос А. и др. (февраль 2012 г.). «Аллостерическая модуляция семи трансмембранных рецепторов: теория, практика и возможности для открытия лекарств для центральной нервной системы» . Журнал медицинской химии . 55 (4): 1445–1464. дои : 10.1021/jm201139r . ПМЦ 3349997 . ПМИД 22148748 .
^ Хеллиер С.Д., Олболд С., Ван Т., Чен А.Н., Мэй Л.Т., Лич К. и др. (май 2018 г.). « Селективные» модуляторы рецепторов, связанных с белком CG, представляют собой нейтральные или смещенные _{mGlu 5} аллостерические лиганды » . Молекулярная фармакология . 93 (5): 504–514. дои : 10.1124/моль.117.111518 . ПМИД 29514854 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д Арей Б.Дж. и др. (2014). Предвзятая передача сигналов в физиологии, фармакологии и терапии . Эльзевир. стр. 187–189. дои : 10.1016/B978-0-12-411460-9.00006-9 . ISBN 9780124114609 .
^ Билезикян Дж.П. и др. (2019). Принципы биологии кости (4-е изд.). Эльзевир. п. 542. дои : 10.1016/B978-0-12-814841-9.00023-3 . ISBN 9780128148419 .
^ Лу С, Хэ Х, Ни Д, Чжан Дж (июль 2019 г.). «Открытие аллостерического модулятора: от интуиции к структурному проектированию». Журнал медицинской химии . 62 (14): 6405–6421. doi : 10.1021/acs.jmedchem.8b01749 . ПМИД 30817889 . S2CID 73515780 .
^ Ли Ю, Сунь Л, Ян Т, Цзяо В, Тан Дж, Хуан Икс и др. (январь 2019 г.). «Разработка и синтез новых положительных аллостерических модуляторов α7-никотиновых ацетилхолиновых рецепторов, способных восполнить дефицит слухового шлюзования у мышей». Журнал медицинской химии . 62 (1): 159–173. doi : 10.1021/acs.jmedchem.7b01492 . ПМИД 29587480 .
^ Уильямс Д.К., Ван Дж., Папке Р.Л. (октябрь 2011 г.). «Положительные аллостерические модуляторы как подход к терапии, нацеленной на никотиновые рецепторы ацетилхолина: преимущества и ограничения» . Биохимическая фармакология . Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы как терапевтические мишени: новые рубежи фундаментальных исследований и клинической науки (спутник собрания Общества нейронаук 2011 г.). 82 (8): 915–930. дои : 10.1016/j.bcp.2011.05.001 . ПМК 3162128 . ПМИД 21575610 .
^ Аяла Дж.Э., Чен Ю., Банко Дж.Л., Шеффлер Д.Д., Уильямс Р., Телк А.Н. и др. (август 2009 г.). «Положительные аллостерические модуляторы mGluR5 облегчают как LTP, так и LTD гиппокампа, а также улучшают пространственное обучение» . Нейропсихофармакология . 34 (9): 2057–2071. дои : 10.1038/нпп.2009.30 . ПМЦ 2884290 . ПМИД 19295507 .
^ Свенссон К.А., Хао Дж., Брунс РФ (2019). «Положительные аллостерические модуляторы дофаминового рецептора D1: новый механизм лечения нервно-психических расстройств». Нейропсихотерапия . Достижения фармакологии. Том. 86. стр. 273–305. дои : 10.1016/bs.apha.2019.06.001 . ISBN 9780128166680 . ISSN 1557-8925 . ПМИД 31378255 .

[Rang_2016-1] Jump up to: ^а ^б Позвонил Х.П., Риттер Дж.М., Флауэр Р.Дж., Хендерсон Дж. (2016). Фармакология Ранга и Дейла (8-е изд.). Эльзевир. стр. 6–20. ISBN 978-0-7020-5362-7 .

[Neubig_2003-2] Jump up to: ^а ^б ^с ^д Нойбиг Р.Р., Спеддинг М., Кенакин Т., Христопулос А. (декабрь 2003 г.). «Комитет Международного союза фармакологии по номенклатуре рецепторов и классификации лекарств. XXXVIII. Обновленная информация о терминах и символах в количественной фармакологии». Фармакологические обзоры . 55 (4): 597–606. дои : 10.1124/пр.55.4.4 . ПМИД 14657418 .

[3] Нельсон Д.Л., Кокс М.М. (2008). Ленингерские принципы биохимии (5-е изд.). У. Х. Фриман. стр. 162 . ISBN 978-0-7167-7108-1 .

[Kenakin_2017-4] Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час ^я ^дж ^к ^л ^м ^н ^тот ^п ^д ^р ^с ^т Кенакин Т.П. (2017). Фармакология в открытии и разработке лекарств: понимание реакции на лекарства (2-е изд.). Академическая пресса. стр. 102–119. дои : 10.1016/B978-0-12-803752-2.00005-3 . ISBN 978-0-12-803752-2 .

[Jin_2005-5] Jump up to: ^а ^б ^с Джин Р., Кларк С., Уикс А.М., Дадман Дж.Т., Гуо Э., Партин К.М. (сентябрь 2005 г.). «Механизм действия положительных аллостерических модуляторов на АМРА-рецепторы» . Журнал неврологии . 25 (39): 9027–9036. doi : 10.1523/JNEUROSCI.2567-05.2005 . ПМК 6725607 . ПМИД 16192394 .

[Stephens_2013-6] Jump up to: ^а ^б Стивенс Б., Гендель ТМ (2013). «Олигомеризация и аллостерия хемокиновых рецепторов» . Прогресс молекулярной биологии и трансляционной науки . 115 . Академическая пресса: 375–420. дои : 10.1016/B978-0-12-394587-7.00009-9 . ISBN 978-0-12-394587-7 . ПМК 4072031 . ПМИД 23415099 .

[Melancon_2012-7] Jump up to: ^а ^б Меланкон Б.Дж., Хопкинс С.Р., Вуд М.Р., Эммитт К.А., Нисвендер С.М., Христопулос А. и др. (февраль 2012 г.). «Аллостерическая модуляция семи трансмембранных рецепторов: теория, практика и возможности для открытия лекарств для центральной нервной системы» . Журнал медицинской химии . 55 (4): 1445–1464. дои : 10.1021/jm201139r . ПМЦ 3349997 . ПМИД 22148748 .

[8] Хеллиер С.Д., Олболд С., Ван Т., Чен А.Н., Мэй Л.Т., Лич К. и др. (май 2018 г.). « Селективные» модуляторы рецепторов, связанных с белком CG, представляют собой нейтральные или смещенные _{mGlu 5} аллостерические лиганды » . Молекулярная фармакология . 93 (5): 504–514. дои : 10.1124/моль.117.111518 . ПМИД 29514854 .

[Arey_2014-9] Jump up to: ^а ^б ^с ^д Арей Б.Дж. и др. (2014). Предвзятая передача сигналов в физиологии, фармакологии и терапии . Эльзевир. стр. 187–189. дои : 10.1016/B978-0-12-411460-9.00006-9 . ISBN 9780124114609 .

[10] Билезикян Дж.П. и др. (2019). Принципы биологии кости (4-е изд.). Эльзевир. п. 542. дои : 10.1016/B978-0-12-814841-9.00023-3 . ISBN 9780128148419 .

[11] Лу С, Хэ Х, Ни Д, Чжан Дж (июль 2019 г.). «Открытие аллостерического модулятора: от интуиции к структурному проектированию». Журнал медицинской химии . 62 (14): 6405–6421. doi : 10.1021/acs.jmedchem.8b01749 . ПМИД 30817889 . S2CID 73515780 .

[12] Ли Ю, Сунь Л, Ян Т, Цзяо В, Тан Дж, Хуан Икс и др. (январь 2019 г.). «Разработка и синтез новых положительных аллостерических модуляторов α7-никотиновых ацетилхолиновых рецепторов, способных восполнить дефицит слухового шлюзования у мышей». Журнал медицинской химии . 62 (1): 159–173. doi : 10.1021/acs.jmedchem.7b01492 . ПМИД 29587480 .

[13] Уильямс Д.К., Ван Дж., Папке Р.Л. (октябрь 2011 г.). «Положительные аллостерические модуляторы как подход к терапии, нацеленной на никотиновые рецепторы ацетилхолина: преимущества и ограничения» . Биохимическая фармакология . Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы как терапевтические мишени: новые рубежи фундаментальных исследований и клинической науки (спутник собрания Общества нейронаук 2011 г.). 82 (8): 915–930. дои : 10.1016/j.bcp.2011.05.001 . ПМК 3162128 . ПМИД 21575610 .

[14] Аяла Дж.Э., Чен Ю., Банко Дж.Л., Шеффлер Д.Д., Уильямс Р., Телк А.Н. и др. (август 2009 г.). «Положительные аллостерические модуляторы mGluR5 облегчают как LTP, так и LTD гиппокампа, а также улучшают пространственное обучение» . Нейропсихофармакология . 34 (9): 2057–2071. дои : 10.1038/нпп.2009.30 . ПМЦ 2884290 . ПМИД 19295507 .

[15] Свенссон К.А., Хао Дж., Брунс РФ (2019). «Положительные аллостерические модуляторы дофаминового рецептора D1: новый механизм лечения нервно-психических расстройств». Нейропсихотерапия . Достижения фармакологии. Том. 86. стр. 273–305. дои : 10.1016/bs.apha.2019.06.001 . ISBN 9780128166680 . ISSN 1557-8925 . ПМИД 31378255 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]

[ 11 ]

[ 12 ]

[ 13 ]

[ 14 ]

[ 15 ]