Праймер (молекулярная биология)

Праймер , -это короткая одноцепочечная нуклеиновая кислота используемая всеми живыми организмами в инициации синтеза ДНК . праймер Синтетический также может быть назван олиго , сокращенным для олигонуклеотида. Ферменты ДНК-полимеразы (ответственные за репликацию ДНК) способны только добавлять нуклеотиды в 3'-конец существующей нуклеиновой кислоты, что требует, чтобы праймер был связан с матрицей до того, как ДНК-полимераза сможет начать комплементарную цепь. ^{[ 1 ]} ДНК -полимераза добавляет нуклеотиды после связывания с РНК -праймером и синтезирует всю цепь. Позже, нити РНК должны быть точно удалены и заменить их на ДНК -нуклеотиды, образующие область зазора, известную как ник, который заполняется использованием фермента, называемого лигазой. ^{[ 2 ]} Процесс удаления праймера РНК требует нескольких ферментов, таких как FEN1, LIG1 и другие, которые работают в координации с ДНК -полимеразой, чтобы обеспечить удаление ННК -нуклеотидов и добавление ДНК -нуклеотидов. Живые организмы используют исключительно РНК -праймеры, в то время как лабораторные методы в биохимии и молекулярной биологии , которые требуют синтеза ДНК in vitro (такие как секвенирование ДНК и полимеразная цепная реакция ), обычно используют ДНК -праймеры, поскольку они более стабильны температурой. Праймеры могут быть спроектированы в лаборатории для специфических реакций, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР). При проектировании праймеров ПЦР существуют конкретные меры, которые необходимо принять во внимание, например, температура плавления праймеров и температура отжига самой реакции. Кроме того, должна быть специально выбрана последовательность связывания ДНК in vitro, которая выполняется с использованием метода, называемого основным локальным инструментом поиска выравнивания (BLAST), который сканирует ДНК и находит специфические и уникальные области для привязки праймера.

РНК -праймеры in vivo

РНК -праймеры используются живыми организмами инициации синтеза в цепи ДНК . Класс ферментов, называемых примазами, добавляет комплементарный РНК -праймер в шаблон чтения de novo как на ведущих , так и на отстающих целях . Начиная с свободного 3'-OH праймера, известного как праймер-концерн, ДНК-полимераза может расширить недавно синтезированную цепь. Ведущая цепь в репликации ДНК синтезируется в одной непрерывной части, движущейся с вилкой репликации , требуя только начального праймера РНК для начала синтеза. В отставающей цепей матричная ДНК работает в 5 ′ → 3 'направление . Поскольку ДНК -полимераза не может добавлять основы в 3 '→ 5' направление, комплементарную к цепи шаблона, ДНК синтезируется «назад» в коротких фрагментах, отоходящих от вилки репликации, известной как фрагменты Оказаки . В отличие от ведущей цепи, этот метод приводит к повторному запуску и остановке синтеза ДНК, требуя множества праймеров РНК. Вдоль матрицы ДНК примаза впрыскивает РНК -праймеры, которые ДНК -полимераза использует для синтеза ДНК из 5 '→ 3' направления. ^{[ 1 ]}

Другим примером праймеров, используемых для обеспечения синтеза ДНК, является обратная транскрипция . Обратная транскриптаза - это фермент, который использует шаблонную нить РНК для синтеза комплементарной цепи ДНК. Компонент ДНК -полимеразы обратной транскриптазы требует, чтобы существующий 3 'конец начал синтез. ^{[ 1 ]}

Удаление грунтовки

После введения фрагментов Оказаки , РНК -праймеры удаляются (механизм удаления различается между прокариотами и эукариотами ) и заменяется новыми дезоксирибонуклеотидами , которые заполняют пробелы, где присутствовал праймер РНК. Затем ДНК -лигаза соединяет фрагментированные нити вместе, завершая синтез отстающих цепей. ^{[ 1 ]}

В прокариотах ДНК -полимераза I синтезирует фрагмент Оказаки, пока не достигнет предыдущего РНК -праймера. Затем фермент одновременно действует как 5 ′ → 3 'экзонуклеаза , удаляя праймер рибонуклеотиды спереди и добавляя дезоксирибонуклеотиды позади. Как активность полимеризации, так и удаления РНК -праймера встречаются в направлении 5 '→ 3' , а полимераза я могу выполнять эти действия одновременно; Это известно как «перевод Ника». ^{[ 3 ]} Трансляция Nick относится к синхронизированной активности полимеразы I при удалении РНК -праймера и добавлении дезоксирибонуклеотидов . Позже образуется зазор между прядями, называемым ником, который запечатан с использованием ДНК -лигазы .

У эукариот удаление РНК -праймеров в отставающей цепи необходимо для завершения репликации. Таким образом, поскольку отставательная цепь синтезируется ДНК -полимеразой Δ в 5 ′ → 3 ' направление, фрагменты Оказаки образуются , которые являются прерывистыми цепями ДНК. Затем, когда ДНК-полимераза достигает 5-дюймового конца РНК-праймера из предыдущего фрагмента Оказаки, она вытесняет 5'-конец праймера в одноцепочечный РНК-лоскут, который удаляется путем расщепления нуклеазы. Расщепление РНК -лоскутов включает в себя три метода удаления праймера. ^{[ 4 ]} Первая возможность удаления праймера заключается в создании короткого лоскута, который непосредственно удаляется с помощью специфичной для структуры лоскута эндонуклеазы 1 (FEN-1), который расщепляет 5-'нависающий лоскут. Этот метод известен как короткий путь лоскута удаления праймера РНК. ^{[ 5 ]} Второй способ расщепления РНК -праймера - это разложение РНК -цепи, используя РНКазу , у эукариот она известна как РНКаза H2. Этот фермент разрушает большую часть отожженной РНК -праймера, за исключением нуклеотидов, близких к 5 -дюймовому конец праймера. Таким образом, оставшиеся нуклеотиды отображаются в лоскут, который расщепляется с использованием FEN-1. Последний возможный метод удаления РНК -праймера известен как длинный путь лоскута. ^{[ 5 ]} На этом пути несколько ферментов рекрутируются для удлинения РНК -праймера, а затем расщеплять его. Закрылки удлинены от 5 'до 3' геликазы , известной как PIF1 . После добавления нуклеотидов в лоскут PIF1 длинный лоскут стабилизируется белком репликации (RPA). ДНК, связанная с RPA, ингибирует активность или рекрутирование FEN1, в результате чего должен быть набран другой нуклеаз для расщепления лоскута. ^{[ 4 ]} Эта вторая нуклеаза представляет собой нуклеазу ДНК2 , которая обладает активностью геликаз-нуклеазы, которая расщепляет длинный лоскут РНК-праймера, который затем оставляет пару нуклеотидов, которые расщепляются FEN1. В конце, когда все РНК-праймеры были удалены, образуются понижения между фрагментами Оказаки , которые заполнены дезоксирибонуклеотидами , использующими фермент, известный как лигаза1 , посредством процесса, называемого лигированием .

Использование синтетических праймеров

Синтетические праймеры, иногда известные как олиго, являются химически синтезированными олигонуклеотидами , обычно из ДНК, которые можно настроить для отжига до определенного сайта на ДНК матрицы. В растворе праймер спонтанно гибридизуется с шаблоном через спаривание оснований Уотсон-Крика, прежде чем расширять ДНК-полимеразу. Возможность создания и настройки синтетических праймеров оказалась бесценным инструментом, необходимым для различных молекулярных биологических подходов, включающих анализ ДНК. Как метод завершения цепи Sanger , так и метод секвенирования ДНК « следующего поколения » требуют праймеров для инициирования реакции. ^{[ 1 ]}

ПЦР -праймер дизайн

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) использует пару пользовательских праймеров для направления удлинения ДНК друг к другу на противоположных концах последовательности, амплифицируемой. Эти праймеры, как правило, имеют длину от 18 до 24 оснований и должны кодировать только для конкретных подъездных и нижних участков последовательности, амплифицированных. Праймер, который может связываться с несколькими областями вдоль ДНК, будет усилить их все, устраняя цель ПЦР. ^{[ 1 ]}

Несколько критериев должны быть приняты во внимание при разработке пары праймеров для ПЦР. реакции Пары праймеров должны иметь одинаковую температуру плавления, так как отжиг во время ПЦР возникает одновременно для обеих цепей, и эта общая температура плавления не должна быть ни слишком намного выше, либо ниже температуры отжига . Праймер с T _M (температура плавления), слишком намного выше, чем температура отжига реакции, может мишибридизировать и распространяться в неправильном месте вдоль последовательности ДНК. A T _M значительно ниже, чем температура отжига может вообще не отжигать и распространяться.

Кроме того, необходимо выбрать последовательности праймеров, чтобы уникально выбрать для области ДНК, избегая возможности гибридизации до аналогичной последовательности поблизости. Обычно используемым методом для выбора сайта праймера является поиск взрыва , в котором могут быть замечены все возможные области, с которыми может быть замечено привязка. Как нуклеотидная последовательность, так и сама праймер можно найти в взрыве. Бесплатный инструмент NCBI Tool-Brast интегрирует дизайн праймеров и поиск в одном приложении, ^{[ 6 ]} Как и коммерческие программные продукты, такие как Eprime и Beacon Designer . Компьютерное моделирование теоретических результатов ПЦР ( электронная ПЦР ) может быть выполнено, чтобы помочь в проектировании праймера, давая температуру плавления и отжига и т. Д. ^{[ 7 ]}

По состоянию на 2014 год многие онлайн -инструменты свободно доступны для дизайна праймеров, некоторые из которых сосредоточены на конкретных приложениях ПЦР. Праймеры с высокой специфичностью для подмножества шаблонов ДНК в присутствии многих аналогичных вариантов могут быть разработаны с использованием некоторых программ ^{[ 8 ]}) или развиваться независимо для конкретной группы животных. ^{[ 9 ]}

Выбор конкретной области ДНК для связывания праймера требует некоторых дополнительных соображений. Области с высоким содержанием мононуклеотидных и динуклеотидных повторов следует избегать, так как может возникнуть образование петли и способствовать мишибридизации. Праймеры не должны легко отдавать с другими праймерами в смеси; Это явление может привести к производству продуктов «Dimer Dimer», загрязняющих конечное решение. Праймеры также не должны сильно отжигать себя, поскольку внутренние шпильки и петли могут препятствовать отжигу с помощью матричной ДНК.

При проектировании праймеров дополнительные нуклеотидные основания могут быть добавлены к задней части каждого праймера, что приводит к индивидуальной последовательности CAP на каждом конце амплифицированной области. Одно из приложений для этой практики предназначено для использования в клонировании TA , специальной методике субклонирования, аналогичной ПЦР, где эффективность может быть повышена путем добавления хвостов Ag к 5 'и 3' концам. ^{[ 10 ]}

Вырожденные праймеры

Некоторые ситуации могут потребовать использования вырожденных праймеров. Это смеси праймеров, которые похожи, но не идентичны. Они могут быть удобными при усилении одного и того же гена из разных организмов , поскольку последовательности, вероятно, похожи, но не идентичны. Этот метод полезен, потому что генетический код сам дегенерирует , что означает, что несколько разных кодонов могут код для одной и той же аминокислоты . Это позволяет различным организмам иметь значительно другую генетическую последовательность, которая кодирует для очень сходного белка. По этой причине вырожденные праймеры также используются, когда дизайн праймера основана на белковой последовательности , поскольку специфическая последовательность кодонов неизвестна. Следовательно, последовательность праймеров, соответствующая аминокислотному изолецину , может быть «ATH», где A обозначает аденин , T для тимина и H для аденина , тимина или цитозина в соответствии с генетическим кодом для каждого кодона , используя символы IUPAC для для вырожденные базы . Вырожденные праймеры могут не идеально гибридизоваться с целевой последовательности, что может значительно снизить специфичность усиления ПЦР.

Вырожденные праймеры широко используются и чрезвычайно полезны в области микробной экологии . Они допускают усиление генов из необработанных микроорганизмов или позволяют восстановить гены из организмов, где геномная информация недоступна. Обычно вырожденные праймеры разрабатываются путем выравнивания секвенирования генов, обнаруженных в GenBank . Различия между последовательностями учитываются с использованием дегенерации IUPAC для отдельных оснований. ПРИМ ПРИМЕРЫ затем синтезируются как смесь праймеров, соответствующих всем перестановкам последовательности кодона.

Смотрите также

Синтез олигонуклеотида - методы, с помощью которых обрабатываются праймеры

Ссылки

^ Jump up to: ^а ^{беременный} ^в ^{дюймовый} ^и ^фон Кокс, Майкл М. (2015). Молекулярная биология: принципы и практика . Нью -Йорк: WH Freeman and Company. С. 221–238, 369–376, 592–593. ISBN 9781464126147 .
^ Henneke, Ghislaine (2012-09-26). «Восстановление in vitro удаление праймеров РНК в археи выявляет существование двух путей» . Биохимический журнал . 447 (2): 271–280. doi : 10.1042/bj20120959 . ISSN 0264-6021 . PMID 22849643 .
^ Дудна; Кокс; О'Доннелл, Дженнифер; Майкл М.; Майкл (21 декабря 2016 г.). Молекулярная биология: принципы и практика . WH Freeman. ISBN 9781319116378 . {{cite book}}: Cs1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
^ Jump up to: ^а ^{беременный} Улер, Джей П.; Фалькенберг, Мария (2015-10-01). «Удаление грунтовки во время репликации митохондриальной ДНК млекопитающих» . Репарация ДНК . 34 : 28–38. doi : 10.1016/j.dnarep.2015.07.003 . ISSN 1568-7864 . PMID 26303841 .
^ Jump up to: ^а ^{беременный} Балакришнан, Лата; Бамбара, Роберт А. (2013-02-01). «Метаболизм фрагмента Оказаки» . Перспективы Cold Spring Harbor в биологии . 5 (2): A010173. doi : 10.1101/cshperspect.a010173 . ISSN 1943-0264 . PMC 3552508 . PMID 23378587 .
^ "Brimer-Blast" .
^ "Электронная ПЦР" . NCBI - Национальный центр биотехнологической информации . Получено 13 марта 2012 года .
^ «О расшифровке» . Wellcome Trust Sanger Institute . Получено 12 февраля 2014 года .
^ Бабанов, DP; Беккер, EI; Павлов, DD; Боровикова, EA; Кадудухова, YV; Коток, А.А. (1 февраля 2022 г.). «Новые наборы праймеров для идентификации ДНК некоренных видов рыб в бассейне Волга-Кама (Европейская Россия) » Вода 14 (3): 437. doi : 10.3390/ w140304 ISSN 2073-4
^ Аденозин добавлен на праймер 50 Конец повышения эффективности клонирования TA клонирования TA-клонирования продуктов полимеразной цепной реакции, Ri-He Peng, Ai-Sheng Xiong, Jin-ge Liu, Fang Xu, Cai bin, Hong Zhu, Quan-Hong Yao

Внешние ссылки

[:0-1] Jump up to: ^а ^{беременный} ^в ^{дюймовый} ^и ^фон Кокс, Майкл М. (2015). Молекулярная биология: принципы и практика . Нью -Йорк: WH Freeman and Company. С. 221–238, 369–376, 592–593. ISBN 9781464126147 .

[2] Henneke, Ghislaine (2012-09-26). «Восстановление in vitro удаление праймеров РНК в археи выявляет существование двух путей» . Биохимический журнал . 447 (2): 271–280. doi : 10.1042/bj20120959 . ISSN 0264-6021 . PMID 22849643 .

[3] Дудна; Кокс; О'Доннелл, Дженнифер; Майкл М.; Майкл (21 декабря 2016 г.). Молекулярная биология: принципы и практика . WH Freeman. ISBN 9781319116378 . {{cite book}}: Cs1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )

[:1-4] Jump up to: ^а ^{беременный} Улер, Джей П.; Фалькенберг, Мария (2015-10-01). «Удаление грунтовки во время репликации митохондриальной ДНК млекопитающих» . Репарация ДНК . 34 : 28–38. doi : 10.1016/j.dnarep.2015.07.003 . ISSN 1568-7864 . PMID 26303841 .

[:2-5] Jump up to: ^а ^{беременный} Балакришнан, Лата; Бамбара, Роберт А. (2013-02-01). «Метаболизм фрагмента Оказаки» . Перспективы Cold Spring Harbor в биологии . 5 (2): A010173. doi : 10.1101/cshperspect.a010173 . ISSN 1943-0264 . PMC 3552508 . PMID 23378587 .

[6] "Brimer-Blast" .

[ePCR2-7] "Электронная ПЦР" . NCBI - Национальный центр биотехнологической информации . Получено 13 марта 2012 года .

[About-8] «О расшифровке» . Wellcome Trust Sanger Institute . Получено 12 февраля 2014 года .

[9] Бабанов, DP; Беккер, EI; Павлов, DD; Боровикова, EA; Кадудухова, YV; Коток, А.А. (1 февраля 2022 г.). «Новые наборы праймеров для идентификации ДНК некоренных видов рыб в бассейне Волга-Кама (Европейская Россия) » Вода 14 (3): 437. doi : 10.3390/ w140304 ISSN 2073-4

[10] Аденозин добавлен на праймер 50 Конец повышения эффективности клонирования TA клонирования TA-клонирования продуктов полимеразной цепной реакции, Ri-He Peng, Ai-Sheng Xiong, Jin-ge Liu, Fang Xu, Cai bin, Hong Zhu, Quan-Hong Yao

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]