Jump to content

Грамм пятно

(Перенаправлено из окрашивания ГАРК )
Микрофотография грамположительного кокаса и грамотрицательного стержня.
Грамовое пятно смешанного стафилококка aureus ( S. aureus atcc 25923, грамположительный кокки, фиолетовый) и Escherichia coli ( E. coli atcc 11775, грамотрицательные бацилли

Грамовое пятно ( окрашивание грамма или метод грамма )-это метод окрашивания, используемый для классификации бактериальных видов по две большие группы: грамположительные бактерии и грамотрицательные бактерии . Он также может быть использован для диагностики грибковой инфекции . [ 1 ] Название происходит от датского бактериолога Ганса Кристиана Грэма , который разработал технику в 1884 году. [ 2 ]

Окрашивание грамма дифференцирует бактерии по химическим и физическим свойствам их клеточных стен . Грамположительные клетки имеют толстый слой пептидогликана в клеточной стенке, который сохраняет первичное окрашивание, кристаллическое фиолетовое . Грам-негативные клетки имеют более тонкий пептидогликан слой, который позволяет кристаллическому фиолетовому вымывать добавление этанола . Они окрашены в розовый или красный [ 3 ] Обычно сафранин или фуучин . Раствор йода Лугола всегда добавляется после добавления кристаллической фиолетовой, чтобы укрепить связи пятна с помощью клеточной мембраны .

Окрашивание грамма почти всегда является первым шагом в идентификации бактериальной группы. В то время как окрашивание грамма является ценным диагностическим инструментом как в клинических, так и в исследованиях, не все бактерии могут быть окончательно классифицированы по этой технике. Это порождает грамм-переменную и не-грамовую группировку.

Этот метод назван в честь его изобретателя, датского ученого Ганса Кристиана Грэма (1853–1938), который разработал эту технику, работая с Карлом Фридландером в морге городской больницы в Берлине в 1884 году. Грамм разработал свою технику не для целей. Отделение одного типа бактерии от другой, но чтобы сделать бактерии более заметными в окрашенных участках ткани легких. [ 4 ] Грамм заметил, что некоторые бактериальные клетки обладают заметной устойчивостью к обесцвечиванию. Основываясь на этих наблюдениях, Грам разработал начальную процедуру окрашивания грамма, первоначально используя анилин-гентскую фиолетовую Эрлиха, йод Лугола, абсолютный алкоголь для обесцвечивания и Бисмарк Браун для противостояния. [ 5 ] Он опубликовал свой метод в 1884 году и включил в свой короткий отчет о том, что тайф Бациллус не сохранил пятно. [ 6 ] Грамм изначально не проходил различие между грамотрицательными и грамположительными бактериями, используя его процедуру. [ 5 ]

Использование

[ редактировать ]
Грамм пятно от Candida albicans из вагинального мазона. Маленькие овальные хламидоспоры 2–4 мкм . имеют диаметр

Окрашивание грамма является бактериологической лабораторной техникой [ 7 ] Используется для дифференциации бактериальных видов на две большие группы ( грамположительные и грамотрицательные ) на основе физических свойств их клеточных стен . [ 8 ] [ страница необходима ] Окрашивание грамма также может быть использовано для диагностики грибковой инфекции . [ 1 ] Окрашивание грамма не используется для классификации Archaea , поскольку эти микроорганизмы дают широко различные ответы, которые не следуют за их филогенетическими группами . [ 9 ]

Некоторые организмы являются граммами-переменными (что означает, что они могут окрасить либо отрицательные, либо положительные); Некоторые не окрашены ни одной красителем, используемой в технике Грамма, и не видны. [ Цитация необходима ]

Медицинский

[ редактировать ]

Пятна Грамма выполняются на тела жидкости или биопсии при инфекцию подозрении на . Грамовые пятна дают результаты гораздо быстрее, чем культивирование , и особенно важны, когда инфекция будет иметь важное значение в лечении и прогнозе пациента; Примерами являются спинномозговая жидкость для менингита и синовиальной жидкости для септического артрита . [ 10 ] [ 11 ]

Механизм окрашивания

[ редактировать ]
Грамоположительный ( слева ) и розовый грамо-негативный (справа)

Грамположительные бактерии имеют толстую сетчатую клеточную стенку, изготовленную из пептидогликана (50–90% огибающей клеток), и в результате окрашены фиолетовым кристаллическим фиолетовым, тогда как грамотрицательные бактерии имеют более тонкий слой (10% клетки Оболочка), поэтому не сохраняйте фиолетовое пятно и являются контр-розовым саранином. Есть четыре основных шага граммового пятно:

  1. Применение первичного пятна ( кристаллического фиолетового ) на мазок бактериальной культуры. Тепловая фиксация убивает некоторые бактерии, но в основном используется для прикрепления бактерий к слайду, чтобы они не ополаскивали во время процедуры окрашивания.
  2. Добавление йода , которое связывается с кристаллической фиолетовой и ловит его в клетке
  3. Быстрое обесцвечивание с помощью этанола или ацетона
  4. Отстаивать с сафранином . [ 12 ] Карбол Фуксин иногда заменяется сафранином, поскольку он более интенсивно окрашивает анаэробные бактерии, но его реже используется в качестве контратака. [ 13 ]
Резюме грамма пятно
Применение Реагент Цвет ячейки
Грамположительный Грамотрицательный
Первичный краситель Кристаллическая фиолетовая фиолетовый фиолетовый
Ловчик йод фиолетовый фиолетовый
Обедолоритель алкоголь / ацетон фиолетовый бесцветный
Столовое пятно Сафранин / Карбол Фуксин фиолетовый розовый или красный

Кристаллическая фиолетовая (CV) диссоциирует в водных растворах в CV +
и хлорид ( кл
) ионы. Эти ионы проникают в клеточную стенку как грамположительных, так и грамотрицательных клеток. CV +
Ион взаимодействует с отрицательно заряженными компонентами бактериальных клеток и окрашивает клетки фиолетовых. [ 14 ]

Йодид ( я
или я
3
) Взаимодействовать с резюме +
и образует большие комплексы кристаллической фиолетости и йода (CV - I) во внутренних и внешних слоях клетки. Йод часто называют мондантом , но является отловкой агентом, который предотвращает удаление комплекса CV - I и, следовательно, окрашивает ячейку. [ 15 ]

Когда добавляется депроеклизатор, такой как спирт или ацетон, он взаимодействует с липидами клеточной мембраны. [ 16 ] Грамотрицательная клетка теряет свою внешнюю липополисахаридную мембраду, а внутренний слой пептидогликана остается открытым. Комплексы CV-I промываются из грамотрицательной клетки вместе с внешней мембраной. [ 17 ] Напротив, грамположительная клетка обезвоживается от лечения этанолом. Большие комплексы CV-I попадают в грамположительную клетку из-за многослойной природы его пептидогликана. [ 17 ] Этап обесцвечивания является критическим и должен быть рассчитано правильно; Кристаллическое фиолетовое пятно удаляется как из грамположительных, так и из отрицательных клеток, если деколорирующий агент остается слишком долго (вопрос секунды). [ 18 ]

После обесцвечивания грамположительная клетка остается фиолетовой, а грамотрицательная клетка теряет фиолетовый цвет. [ 18 ] Contrestain, который обычно положительно заряжается сафранином или основным фуксином, применяется последним, чтобы придать обесцвеченным грамотрицательным бактериям розовый или красный цвет. [ 3 ] [ 19 ] Как грамположительные бактерии, так и грамотрицательные бактерии поднимают контратаку. Противостояние, однако, невидится на грамположительных бактериях из-за более темного кристаллического фиолетового пятна. [ Цитация необходима ]

Грамположительные бактерии

[ редактировать ]
Грамммана- грамположительный стрептококки, окруженный гнойными клетками

Грамположительные бактерии обычно имеют одну мембрану ( монодерму ), окруженную толстым пептидогликаном. За этим правилом следует два Phyla: Bacillota (за исключением классов Mollicutes и Ontivicutes ) и Actinomycetota . [ 8 ] [ 20 ] Напротив, членами хлорфлексоты ( зеленая нельфурская бактерии) являются монодермиями, но обладают тонкими или отсутствующими (классовыми дегалококкоидами ) пептидогликаном и могут окрасить отрицательный, положительный или неопределенный; Члены деинококкоты окрашивают положительные, но являются годы с толстым пептидогликаном. [ 8 ] [ страница необходима ] [ 20 ]

Прочность клеточной стенки усиливается тейхойными кислотами, гликополимерными веществами, встроенными в пептидогликан. Тейхозные кислоты играют множественные роли, такие как генерирование чистого негативного заряда клетки, способствуя жесткости клеточной стенки и поддержанию формы, а также помощь в делении клеток и устойчивость к различным стрессовым факторам, включая тепло и соль. Несмотря на плотность слоя пептидогликана, он остается относительно пористым, что позволяет большинству веществ проникать. Для более крупных питательных веществ грамположительные бактерии используют экзоэнзименты, секретируемые внеклеточно для разрушения макромолекул вне клетки. [ 21 ]

Исторически , грамположительные формы составляли Phylum фирмут , название, которое теперь используется для самой большой группы. Он включает в себя множество известных родов, таких как Lactobacillus, Bacillus , Listeria , Staphylococcus , Streptococcus , Enterococcus и Clostridium . [ 22 ] Он также был расширен, чтобы включить Mollicutes, бактерии, такие как микоплазма и термоплазма, в которой отсутствуют клеточные стенки и поэтому не могут быть окрашены граммом, но из таких форм. [ 23 ]

Некоторые бактерии имеют клеточные стенки, которые особенно искусны при сохранении пятен. Они будут выглядеть положительными для граммового пятна, хотя они не тесно связаны с другими грамположительными бактериями. Они называются кислотными бактериями и могут быть дифференцированы от других грамположительных бактерий с помощью специальных процедур окрашивания . [ 24 ]

Грамотрицательные бактерии

[ редактировать ]
Грамотрицательная neisseria gonorrhoeae и pus -клетки

Грамотрицательные бактерии обычно обладают тонким слоем пептидогликана между двумя мембранами ( Diderm ). [ 25 ] Липополисахарид (LPS) является наиболее распространенным антигеном на клеточной поверхности большинства грамотрицательных бактерий, способствуя 80% внешней мембраны E.coli и сальмонеллы . [ 26 ] Эти молекулы LPS, состоящие из O-антигена или о-полисахарида, основного полисахарида и липида A, служат нескольким функциям, включая способность к отрицательному заряду клетки и защиту от определенных химических веществ. Роль LPS имеет решающее значение для взаимодействий с хозяином-патогеном, причем O-антиген вызывает иммунный ответ и липид, действуя как эндотоксин. [ 21 ]

Кроме того, внешняя мембрана действует как селективный барьер, регулируемый поринами, трансмембранные белки образуют поры, которые позволяют проходить специфические молекулы. Пространство между клеточной мембраной и внешней мембраной, известной как периплазма, содержит периплазматические ферменты для обработки питательных веществ. Значительный структурный компонент, связывающий слой пептидогликана и внешнюю мембрану, представляет собой липопротеин Брауна, который обеспечивает дополнительную стабильность и прочность бактериальной клеточной стенке. [ 21 ]

Большинство бактериальных фил являются грамотрицательными, включая цианобактерии , бактерии зеленого серы и большинство псевдомонадоты (исключения являются некоторыми членами Rickettsiales насекомых и эндосимбионтами ). [ 8 ] [ страница необходима ] [ 20 ]

Грамм-переменные и грамо-нерегистрированные бактерии

[ редактировать ]

Некоторые бактерии, после окрашивания грамм-пятном, дают грамм-переменную схему: наблюдается смесь розовых и фиолетовых клеток. [ 17 ] [ 27 ] В культурах Bacillus, Butyrivibrio и Clostridium снижение толщины пептидогликана во время роста совпадает с увеличением количества клеток, которые окрашивают грамотрицательные. [ 27 ] Кроме того, во всех бактериях, окрашенных с использованием граммового пятна, возраст культуры может влиять на результаты пятна. [ 27 ]

Грам-нерегистрированные бактерии не реагируют предсказуемо на окрашивание грамма и, следовательно, не могут быть определены как грамположительные или грамотрицательные. Примеры включают в себя множество видов микобактерии , в том числе микобактерий Bovis , Mycobacterium leprae и Mycobacterium Tuberculosis , два из которых являются причинными агентами проказы и туберкулеза, соответственно. [ 28 ] [ 29 ] Бактерии рода микоплазмы не имеют клеточной стенки вокруг их клеточных мембран , [ 10 ] Это означает, что они не окрашивают методом Грэма и устойчивы к антибиотикам, которые нацелены на синтез клеточной стенки. [ 30 ] [ 31 ]

Орфографическая нота

[ редактировать ]

Термин окрашивание грамма происходит от фамилии Ганса Кристиана Грэм ; Поэтому эпоним ( грамм ) заглавный, но не общее существительное (пятно), как обычно для научных терминов. [ 32 ] Первоначальные буквы грамположительного и грамотрицательного , которые являются одноименными прилагательными , могут быть либо капиталом G , либо строчной работой G , в зависимости от того, какое руководство по стилю (если таковое имеется) регулирует написанный документ. Стиль строк используется Центрами США по контролю и профилактике заболеваний , а также с режимами стиля, такими как стиль AMA . [ 33 ] Словари могут использовать нижний регистр, [ 34 ] [ 35 ] прописное, [ 36 ] [ 37 ] [ 38 ] [ 39 ] или оба. [ 40 ] [ 41 ] или негативное использование в верхнем регистре Положительное или грамотрицательное использование также распространено во многих научных журнальных статьях и публикациях. [ 41 ] [ 42 ] [ 43 ] Когда статьи отправляются в журналы, каждый журнал может или не может применять стиль дома к версии Postprint . Версии препринта содержат какой -либо стиль, который автор пользуется. Даже режимы стиля, которые используют нижние регистра для прилагательных грамположительных и грамотрицательных, по-прежнему обычно используют капитал для граммового пятна . [ Цитация необходима ]

Смотрите также

[ редактировать ]
  1. ^ Jump up to: а беременный «Грамм пятно: медицинский тест MedlinePlus» . medlineplus.gov .
  2. ^ Колко Р. (2005). "Грамовая окрашивание". Текущие протоколы в микробиологии . Приложение 3 (1): Приложение 3C. doi : 10.1002/9780471729259.mca03cs00 . ISBN  978-0471729259 Полем PMID   18770544 . S2CID   32452815 .
  3. ^ Jump up to: а беременный Беверидж, TJ; Дэвис, JA (ноябрь 1983 г.). «Клеточные реакции Bacillus subtilis и Escherichia coli на окрашивание грамма» . Журнал бактериологии . 156 (2): 846–58. doi : 10.1128/jb.156.2.846-858.1983 . PMC   217903 . PMID   6195148 .
  4. ^ Австриец Р. (1960). «Грамм пятно и этиология лобарской пневмонии, историческая нота» . Бактериологические обзоры . 24 (3): 261–265. doi : 10.1128/mmbr.24.3.261-265.1960 . PMC   441053 . PMID   13685217 .
  5. ^ Jump up to: а беременный Варфоломей, Джеймс В.; Миттвер, Тод (март 1952 г.). «Грамм пятно» . Бактериологические обзоры . 16 (1): 1–29. doi : 10.1128/br.16.1.1-29.1952 . ISSN   0005-3678 . PMC   180726 . PMID   14925025 .
  6. ^ Грэм, Ганс Кристиан (1884). «С помощью изолированной окраски шизомицетов при резке и сухой препаратах». Прогресс медицины (на немецком языке). 2 : 185–189. Полем
    Английский перевод в: Брок, Т.Д. (1999). Вехи в микробиологии 1546–1940 (2 -е изд.). ASM Press. С. 215–218. ISBN  978-1-55581-142-6 .
    Перевод также по адресу: Брок, ТД "Пионеры в области медицинской лабораторной науки: Кристиан Грэм 1884" . Hoslink.com . Получено 27 июля 2010 года .
  7. ^ Райан, KJ; Рэй, CG, ред. (2004). Шеррис Медицинская микробиология (4 -е изд.). МакГроу Хилл. с. 232f. ISBN  978-0838585290 .
  8. ^ Jump up to: а беременный в дюймовый Мэдиган, MT; Martinko, J.; Паркер, Дж. (2004). Брок биология микроорганизмов (10 -е изд.). Липпинкотт Уильямс и Уилкинс. ISBN  978-0-13-066271-2 .
  9. ^ Beveridge, TJ (2001). «Использование граммового пятна в микробиологии». Биотехнический и гистохимия . 76 (3): 111–118. doi : 10.1080/714028139 . PMID   11475313 .
  10. ^ Jump up to: а беременный Райан К.Дж., Рэй К.Г. (редакторы) (2004). Шеррис Медицинская микробиология (4 -е изд.). МакГроу Хилл. С. 409–12. ISBN  978-0-8385-8529-0 . {{cite book}}: |author= имеет общее имя ( справка )
  11. ^ Søgaard, M.; Nørgaard, M.; Schønheyder, H. (2007). «Первое уведомление о положительных культурах крови: высокая точность отчета о грамм -пятнах» . Журнал клинической микробиологии . 45 (4): 1113–1117. doi : 10.1128/jcm.02523-06 . PMC   1865800 . PMID   17301283 .
  12. ^ Блэк, Жаклин Г. (1993). Микробиология: принципы и исследования . Прентис Холл. п. 65
  13. ^ «Медицинская химическая корпорация» . Med-chem.com . Получено 9 марта 2016 года .
  14. ^ Лебофф, Майкл (2014). Теория и применение лаборатории микробиологии (3 -е изд.). Энглвуд, Колорадо: издательская компания Morton. п. 105. ISBN  978-1617312809 .
  15. ^ «Теория пятен - что не является монтированием» . PANTINSFILE.INFO . Архивировано с оригинала 9 марта 2016 года . Получено 9 марта 2016 года .
  16. ^ "Грамм пятно" . Микробугз . Остинский общественный колледж. Архивировано с оригинала 2017-05-26 . Получено 2017-05-26 .
  17. ^ Jump up to: а беременный в Тим, Сэндл (21 октября 2015 г.). Фармацевтическая микробиология: основы для обеспечения качества и контроля качества . Elsevier Science. ISBN  9780081000229 Полем OCLC   923807961 .
  18. ^ Jump up to: а беременный Харди, Джей; Мария, Санта. «Счастливое пятно Грэма» (PDF) . Диагностика Харди . Архивировано (PDF) из оригинала 2017-03-24.
  19. ^ Дэвис, JA; Андерсон, ГК; Беверидж, TJ; Кларк, HC (ноябрь 1983 г.). «Химический механизм окрашивания грамма и синтез нового электронного маркера для электронной микроскопии, который заменяет йод Мордант пятна» . Журнал бактериологии . 156 (2): 837–845. doi : 10.1128/jb.156.2.837-845.1983 . PMC   217902 . PMID   6195147 .
  20. ^ Jump up to: а беременный в Бреннер, Дон Дж.; Криг, Ноэль Р.; Стейли, Джеймс Т. (26 июля 2005 г.) [1984]. Гаррити, Джордж М. (ред.). Вводные очерки . Руководство по систематической бактериологии Берджи. Тол. 2а (2 -е изд.). Нью -Йорк: Спрингер. п. 304. ISBN  978-0-387-24143-2 Полем Британская библиотека нет. GBA561951.
  21. ^ Jump up to: а беременный в Bruslind, Linda (2019-08-01). Общая микробиология . Орегонский государственный университет.
  22. ^ Гальперин, Майкл Ю. (27 декабря 2013 г.). «Разнообразие генома плавковых фирм, образующих спор» . Микробиологический спектр . 1 (2): TBS-0015-2012-. doi : 10.1128/microbiolpectrum.tbs-0015-2012 . ISSN   2165-0497 . PMC   4306282 . PMID   26184964 .
  23. ^ Хашем, Хэмс Х. "Практическая медицинская микробиология" . Университет Аль-Кадисия . [ Постоянная мертвая ссылка ]
  24. ^ «Кислотное быстрое пятно» . www2.highlands.edu . Грузия Хайлендский колледж. Архивировано с оригинала 10 июня 2017 года . Получено 10 июня 2017 года .
  25. ^ Мегриан Д., Таиб Н., Виттвиновский Дж., Грибальдо С. (2020). «Одна или две мембраны? Firticutes Dower Dower оспаривает грамположительный/грамотрицательный разрыв» . Молекулярная микробиология . 113 (3): 659–671. doi : 10.1111/mmi.14469 . PMID   31975449 . S2CID   210882600 .
  26. ^ Avila-Calderón Ed, Ruiz-Palma MD, Crongras-Rodríguez A (2021). «Внешние мембранные везикулы грамотрицательных бактерий: перспективы биогенеза» . Границы в микробиологии . 12 : 557902. DOI : 10.3389/fmicb.2021.557902 . PMC   7969528 . PMID   33746909 .
  27. ^ Jump up to: а беременный в Беверидж, Терри Дж. (Март 1990 г.). «Механизм изменчивости грамма в избранных бактериях» . Журнал бактериологии . 172 (3): 1609–1620. doi : 10.1128/jb.172.3.1609-1620.1990 . PMC   208639 . PMID   1689718 .
  28. ^ Блэк, Жаклин (2012). Микробиология: принципы и исследования (8 -е изд.). Джон Уайли и сыновья. п. 68. ISBN  978-0-470-54109-8 .
  29. ^ Рейнольдс, Дж.; Мойес, РБ; BRAUCHELL, DP (2009). «Приложение 3». Дифференциальное окрашивание бактерий: кислотное быстрое пятно . Тол. Приложение 3. С. Х. Дои : 10.1002/9780471729259.mca03HS15 . ISBN  978-0471729259 Полем PMID   19885935 . S2CID   45685776 . {{cite book}}: |journal= игнорируется ( помощь )
  30. ^ Lee EH, Winter HL, Van Dijl JM, Metzemaekers JD, Arends JP (декабрь 2012 г.). «Диагностика и антимикробная терапия микоплазмы Hominis менингита у взрослых». Международный журнал медицинской микробиологии . 302 (7–8): 289–92. doi : 10.1016/j.ijmm.2012.09.003 . PMID   23085510 .
  31. ^ Gautier-Bouchardon AV (июль 2018 г.). «Устойчивость к антимикробным препаратам в Mycoplasma spp». Микробиологический спектр . 6 (4): 425–446. doi : 10.1128/microbiolspec.arba-0030-2018 . ISBN  9781555819798 Полем PMID   30003864 . S2CID   51616821 .
  32. ^ Уоддингем, Энн (28 августа 2014 г.). Правила Нового Харта: Руководство по Оксфордскому стилю . Издательство Оксфордского университета. п. 105. ISBN  978-0199570027 .
  33. ^ «Предпочтительное использование» . Новое руководство по стилю инфекционных заболеваний . Центры для контроля и профилактики заболеваний .
  34. ^ «Иллюстрированный медицинский словарь Дорланда» (32 -е изд.). Elsevier . Получено 5 июня 2020 года . Используйте поисковые термины, такие как gram-negative.
  35. ^ «Грам-позитив» , Merriam-Webster , Encyclopædia Britannica, Inc.
  36. ^ «Грамположительный» . Collinsdictionary.com . HarperCollins.
  37. ^ "Грамм пятно" . Lexico.com . Издательство Оксфордского университета. Архивировано из оригинала 5 июня 2020 года.
  38. ^ «Грамположительный» . Medicinenet .
  39. ^ "Грамга с негативным/положительным" . BusinessDictionary.com . Архивировано с оригинала 2016-10-20 . Получено 2016-10-20 .
  40. ^ «Грам-поф · I · Tive или Gram-Pos · I · tive» . Американский словарь наследия . Хоутон Миффлин.
  41. ^ Jump up to: а беременный «Грамположительный» . Dictionary.com .
  42. ^ Браун, Лиза; Вольф, Джули М.; Prados-Rosales, Рафаэль; Casadevall, Arturo (2015). «Через стену: внеклеточные пузырьки в грамположительных бактериях, микобактериях и грибах» . Nature Reviews Microbiology . 13 (10): 620–630. doi : 10.1038/nrmicro3480 . PMC   4860279 . PMID   26324094 .
  43. ^ Мюллер, Кристен Л. (12 июня 2015 г.). «Обнаружение грамотрицательных бактерий». Наука . 348 (6240): 1218. doi : 10.1126/science.348.6240.1218-O .
[ редактировать ]
Arc.Ask3.Ru: конец переведенного документа.
Arc.Ask3.Ru
Номер скриншота №: 4367d8cb78f38fd9162afed1b85de4bc__1719769620
URL1:https://arc.ask3.ru/arc/aa/43/bc/4367d8cb78f38fd9162afed1b85de4bc.html
Заголовок, (Title) документа по адресу, URL1:
Gram stain - Wikipedia
Данный printscreen веб страницы (снимок веб страницы, скриншот веб страницы), визуально-программная копия документа расположенного по адресу URL1 и сохраненная в файл, имеет: квалифицированную, усовершенствованную (подтверждены: метки времени, валидность сертификата), открепленную ЭЦП (приложена к данному файлу), что может быть использовано для подтверждения содержания и факта существования документа в этот момент времени. Права на данный скриншот принадлежат администрации Ask3.ru, использование в качестве доказательства только с письменного разрешения правообладателя скриншота. Администрация Ask3.ru не несет ответственности за информацию размещенную на данном скриншоте. Права на прочие зарегистрированные элементы любого права, изображенные на снимках принадлежат их владельцам. Качество перевода предоставляется как есть. Любые претензии, иски не могут быть предъявлены. Если вы не согласны с любым пунктом перечисленным выше, вы не можете использовать данный сайт и информация размещенную на нем (сайте/странице), немедленно покиньте данный сайт. В случае нарушения любого пункта перечисленного выше, штраф 55! (Пятьдесят пять факториал, Денежную единицу (имеющую самостоятельную стоимость) можете выбрать самостоятельно, выплаичвается товарами в течение 7 дней с момента нарушения.)