Преимплантационная генетическая диагностика

1♂︎ —Сперма собирается у самца.
1♀︎ — Яйца собирают у самки с помощью тонкой иглы, проводимой либо через влагалище, либо через брюшную полость под контролем УЗИ [трансвагинальная или трансабдоминальная ультразвуковая аспирация].
2а — Сперматозоиды и яйцеклетки оплодотворяются.
2b — Полученные эмбрионы хранятся в безопасности и наблюдаются, чтобы увидеть, какой из них вырастет.
3а — эмбрионам дают возможность развиваться; тем, кто процветает, даются идентификаторы.
3b — Генетический тест проводится на каждом эмбрионе по данному признаку, и результаты сопоставляются с эмбрионами.
4 — Эмбрионы без желаемого признака идентифицируются и отбраковываются.
5 — Оставшимся эмбрионам дают вырасти до такой степени, что их можно будет имплантировать.
6а — Имплантированы эмбрионы с желаемым признаком.
6б — Эмбрионы приводят к здоровой беременности.
6в — Рождаются разнояйцевые близнецы с желаемым признаком, не выраженным у матери.

Преимплантационная генетическая диагностика ( ПГД или PIGD ) — это генетическое профилирование эмбрионов перед имплантацией (как форма профилирования эмбрионов ), а иногда даже яйцеклеток до оплодотворения . ПГД рассматривается аналогично пренатальной диагностике . Когда метод используется для скрининга конкретного генетического заболевания , его основным преимуществом является то, что он позволяет избежать селективного аборта , поскольку этот метод повышает вероятность того, что ребенок будет свободен от рассматриваемого заболевания. Таким образом, ПГД является дополнением к вспомогательным репродуктивным технологиям и требует экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) для получения ооцитов или эмбрионов для оценки. Эмбрионы обычно получают с помощью бластомера или бластоцисты биопсии . Последний метод оказался менее вредным для эмбриона, поэтому биопсию рекомендуется проводить примерно на 5 или 6 день развития.

Первую в мире ПГД провела компания Handyside. Контоджанни и Уинстон в больнице Хаммерсмит в Лондоне. «Женские эмбрионы были выборочно перенесены пяти парам с риском Х-сцепленного заболевания , в результате чего у двух близнецов и одной одноплодной беременности ».

Термин преимплантационный генетический скрининг (ПГС) относится к набору методов проверки того, имеют ли эмбрионы (полученные с помощью ЭКО/ИКСИ) аномальное хромосом количество . Другими словами, он проверяет, является ли эмбрион анеуплоидным или нет. ПГС также называют скринингом анеуплоидии . В 2016 году Международное общество преимплантационной генетической диагностики (PGDIS) переименовало PGS в преимплантационную генетическую диагностику анеуплоидии (PGD-A).

ПГД позволяет изучить ДНК яйцеклеток или эмбрионов, чтобы выбрать те, которые несут определенные мутации, вызывающие генетические заболевания. Это полезно, когда в семье ранее наблюдались хромосомные или генетические нарушения, а также в контексте программ экстракорпорального оплодотворения. Подобные тесты необходимы, поскольку наследственные заболевания связаны с 20% детской смертности в развитых странах. По оценкам, в целом на них приходится около 18% госпитализаций детей.

Процедуры также можно назвать «преимплантационным генетическим профилированием», чтобы адаптироваться к тому факту, что они иногда используются на ооцитах или эмбрионах перед имплантацией по другим причинам, помимо диагностики или скрининга.

Процедуры, выполняемые с половыми клетками перед оплодотворением, вместо этого можно назвать методами отбора ооцитов или отбора сперматозоидов , хотя методы и цели частично совпадают с ПГД.

История

В 1968 году Роберт Эдвардс и Ричард Гарднер сообщили об успешной идентификации пола бластоцист кроликов . Лишь в 1980-х годах ЭКО человека было полностью разработано, что совпало с прорывом в технологии высокочувствительной полимеразной цепной реакции (ПЦР). Первые успешные тесты Хэндисайда, Контоджанни и Уинстона произошли в октябре 1989 года, а первые роды состоялись в 1990 году. хотя предварительные эксперименты были опубликованы несколькими годами ранее. В этих первых случаях ПЦР использовалась для определения пола пациентов с Х-сцепленными заболеваниями. В отчете 2001 года о всемирном использовании ПГД с 1990 года сообщалось, что биопсия эмбриона или полярного тельца наблюдалось в более чем 3000 клинических циклах с частотой наступления беременности 24%, что было сопоставимо с практикой вспомогательных репродуктивных технологий, не включающей биопсию.

Первые клинические случаи

Елена Контоджанни готовилась к докторской диссертации в больнице Хаммерсмит по методу ПЦР одиночных клеток для определения пола, который она делала путем амплификации повторяющегося участка Y-хромосомы. Именно этот подход она использовала в первых в мире случаях ПГД.

Эмбрионы женского пола были выборочно перенесены пяти парам с риском Х-сцепленного заболевания, в результате чего у двух близнецов и одной беременности наступила одноплодная беременность. Поскольку область Y-хромосомы, которую амплифицировал Контоджианни, содержала много повторов, это было более эффективно, чем попытка амплифицировать уникальную область. Полоса на геле для ПЦР указывала на то, что эмбрион был мужского пола, а отсутствие полосы указывало на то, что эмбрион был женским. Однако неудача амплификации или безъядерный бластомер также приводили к отсутствию полосы на ПЦР-геле. Чтобы снизить риск ошибочного диагноза, Контоджианни продолжил коамплификацию последовательностей X и Y (Kontogianni et al., 1991). В то время ничего не было известно о выпадении аллелей, контаминации кумулюсных клеток или неудаче амплификации одиночных клеток. В 1980-е годы человеческие эмбрионы ЭКО переносились исключительно на второй день развития, поскольку используемая культуральная среда была неспособна обеспечить надежное выращивание эмбрионов после этой стадии. Поскольку биопсия должна была быть проведена на третий день, все первые диагнозы были поставлены за один день, а перенос эмбрионов был произведен поздно на третий день. Сравнение переносов на второй и третий день показало, что это не окажет отрицательного влияния на показатели наступления беременности. Опасения по поводу остановки эмбрионов были настолько велики, что некоторые переносы происходили в ранние часы четвертого дня, чтобы эмбрионы были удалены из культуры как можно скорее. В Хаммерсмите было много вечеров, когда перевод осуществлялся в час ночи четвертого дня, а исследователи возвращались в лабораторию в 7 утра, чтобы начать следующий случай. Уинстон помог родить большинство первых детей с ПГД.

ПГД стала все более популярной в 1990-х годах, когда ее использовали для определения ряда тяжелых генетических нарушений, таких как серповидно-клеточная анемия , болезнь Тея-Сакса , мышечная дистрофия Дюшенна и бета-талассемия .

Общество

Как и все медицинские вмешательства, связанные с репродукцией человека, ПГД вызывает сильные, часто противоречивые мнения о социальной приемлемости, особенно из-за ее евгенического значения. В некоторых странах, например в Германии, ПГД разрешена только для профилактики мертворождения и генетических заболеваний, в других странах ПГД разрешена законом, но ее действие контролируется государством.

Показания и применение

ПГД используется в первую очередь для профилактики генетических заболеваний путем отбора только тех эмбрионов, у которых нет известных генетических нарушений. ПГД также может использоваться для увеличения шансов на успешную беременность, для подбора брата или сестры по типу HLA , чтобы стать донором, для уменьшения предрасположенности к раку и для выбора пола .

ПГД часто используется для выявления аутосомно-доминантных, аутосомно-рецессивных и Х-сцепленных аномалий. Однако его использование при скрининге митохондриальных нарушений встречается реже, в первую очередь из-за непредсказуемых характеристик митохондриальной гетероплазмии. В случаях митохондриальной гетероплазмии некоторые митохондрии внутри клетки несут мутацию, а другие нет. Соотношение мутантных митохондрий играет решающую роль в определении как выраженности заболевания (его влияния на потомство), так и тяжести заболевания.

Моногенные расстройства

ПГД доступна для большого количества моногенных заболеваний , то есть заболеваний, обусловленных только одним геном ( аутосомно-рецессивный , аутосомно-доминантный или Х-сцепленный ) или хромосомных структурных аберраций (таких как сбалансированная транслокация ). ПГД помогает этим парам идентифицировать эмбрионы, несущие генетическое заболевание или хромосомную аномалию, таким образом избегая больного потомства. Наиболее часто диагностируемыми аутосомно-рецессивными заболеваниями являются муковисцидоз , бета- талассемия , серповидно-клеточная анемия и спинальная мышечная атрофия 1-го типа. Наиболее распространенными доминантными заболеваниями являются миотоническая дистрофия , болезнь Хантингтона и болезнь Шарко-Мари-Тута ; а в случае Х-сцепленных заболеваний большая часть циклов проводится при синдроме ломкой Х-хромосомы , гемофилии А и мышечной дистрофии Дюшенна . Хотя это происходит довольно редко, некоторые центры сообщают о проведении ПГД при митохондриальных нарушениях или двух показаниях одновременно.

ПГД в настоящее время также проводится при заболевании, называемом наследственными множественными экзостозами (MHE/MO/HME).

Кроме того, существуют бесплодные пары с наследственными заболеваниями, которые выбирают ПГД, поскольку ее можно легко сочетать с лечением ЭКО.

Шансы на беременность

Основная статья: Качество эмбрионов

Преимплантационное генетическое профилирование (PGP) было предложено в качестве метода определения качества эмбрионов при экстракорпоральном оплодотворении , чтобы выбрать эмбрион, который имеет наибольшие шансы на успешную беременность. Однако, поскольку результаты PGP основаны на оценке одной клетки, PGP имеет присущие ограничения, поскольку тестируемая клетка может не быть репрезентативной для эмбриона из-за мозаицизма . Более того, исследование показало, что диагнозы биопсии одних и тех же эмбрионов в двух разных лабораториях совпадали только в 50% случаев.

Систематический обзор и метаанализ существующих рандомизированных контролируемых исследований пришли к выводу, что нет никаких доказательств положительного эффекта PGP, измеряемого по частоте живорождения . Напротив, для женщин старшего материнского возраста ПГП значительно снижает уровень живорождения. Технические недостатки, такие как инвазивность биопсии и хромосомный мозаицизм, являются основными факторами, лежащими в основе неэффективности ПГП. Во всем мире сообщалось о нормальных живорождениях здорового потомства после переноса эмбрионов, признанных PGP анеуплоидными.

Альтернативные методы определения качества эмбрионов для прогнозирования частоты наступления беременности включают микроскопию, а также определение профиля экспрессии РНК и белков .

HLA-соответствие

Основная статья: Брат-спаситель

Типирование человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) эмбрионов, чтобы HLA ребенка соответствовал больному брату или сестре, что позволяет использовать его для донорства стволовых клеток пуповинной крови . В этом смысле ребенок является « родным братом-спасителем » для ребенка-реципиента. Тем временем типирование HLA стало важным показанием ПГД в тех странах, где это разрешено законом. Сопоставление HLA можно сочетать с диагностикой моногенных заболеваний, таких как анемия Фанкони или бета-талассемия, в тех случаях, когда этим заболеванием страдает больной брат или сестра, или в исключительных случаях оно может выполняться отдельно для таких случаев, как дети с лейкемией . Основным этическим аргументом против является возможная эксплуатация ребенка, хотя некоторые авторы утверждают, что кантианский императив не нарушается, поскольку будущий ребенок-донор будет не только донором, но и любимым человеком в семье.

Предрасположенность к раку

Более поздним применением ПГД является диагностика заболеваний с поздним началом и синдромов (раковой) предрасположенности. Поскольку пострадавшие люди остаются здоровыми до начала заболевания, часто на четвертом десятилетии жизни, ведутся споры о целесообразности ПГД в этих случаях. Соображения включают высокую вероятность развития расстройств и возможность их лечения. Например, при синдромах предрасположенности, таких как мутации BRCA , которые предрасполагают человека к раку молочной железы, результаты неясны. Хотя ПГД часто рассматривается как ранняя форма пренатальной диагностики, характер запросов на ПГД часто отличается от запросов на пренатальную диагностику, когда мать уже беременна. Некоторые из широко распространенных показаний к ПГД неприемлемы для пренатальной диагностики.

Для состояний с поздним началом

Женщина, несущая ген, вызывающий болезнь Альцгеймера с ранним началом, использовала преимплантационную генетическую диагностику (ПГД), чтобы гарантировать, что ее ребенок не унаследует это заболевание. Этические вопросы возникают в отношении решения позволить человеку, знающему о своей предрасположенности к позднему заболеванию, иметь ребенка, свободного от этого гена, несмотря на риск того, что ребенок может преждевременно потерять родителя. Некоторые утверждают, что это решение является этическим, утверждая, что стремление к воспроизводству столь же законно для этих людей, как и для других, обращающихся за услугами по лечению бесплодия. Проводятся сравнения с другими медицинскими ситуациями, такими как вспомогательные репродуктивные технологии для людей с ВИЧ или другими серьезными заболеваниями. Хотя ребенок может столкнуться с риском ранней утраты, выдвигаемый аргумент заключается в том, что психологическая травма не делает жизнь ребенка лишенной явных преимуществ. Следовательно, помощь родителям в воспроизводстве в таких обстоятельствах не считается причинением ребенку чрезмерных или ненужных страданий.

Различение пола

Преимплантационная генетическая диагностика обеспечивает метод пренатального определения пола еще до имплантации, и поэтому ее можно назвать преимплантационной распознаванием пола . Потенциальные применения преимплантационного определения пола включают:

• Дополнение к специфическому генному тестированию на моногенные заболевания, которое может быть очень полезно при генетических заболеваниях, проявление которых связано с полом , таких как, например, Х-сцепленные заболевания .
• Умение подготовиться к любым гендерно-зависимым аспектам воспитания детей.
• Выбор пола . Опрос 2006 года обнаружили, что 42 процента клиник, предлагающих ПГД, предоставляют ее для выбора пола по немедицинским причинам. Почти половина этих клиник выполняет это только для «семейного баланса», когда пара с двумя или более детьми одного пола желает ребенка другого пола, но половина не ограничивает выбор пола только семейным балансом. В Индии эта практика использовалась для отбора только эмбрионов мужского пола, хотя эта практика является незаконной. Мнения о том, является ли выбор пола по немедицинским причинам этически приемлемым, сильно различаются, примером чего является тот факт, что рабочая группа ESHRE не смогла сформулировать единые рекомендации.

В случае семей, находящихся в группе риска по Х-сцепленным заболеваниям , пациентам проводится однократный ПГД-анализ гендерной идентификации. Выбор пола предлагает решение для людей с Х-сцепленными заболеваниями, которые находятся в процессе беременности. Отбор потомства женского эмбриона используется для предотвращения передачи Х-сцепленных менделевских рецессивных заболеваний. К таким Х-сцепленным менделевским заболеваниям относятся мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) и гемофилия А и В, которые редко наблюдаются у женщин, поскольку потомство вряд ли унаследует две копии рецессивного аллеля. Поскольку для передачи заболевания потомству женского пола необходимы две копии мутантного аллеля X, в худшем случае самки будут носителями заболевания, но не обязательно будут иметь доминантный ген заболевания. С другой стороны, мужчинам требуется только одна копия мутантного аллеля X, чтобы заболевание возникло в их фенотипе, и, следовательно, потомство мужского пола от матери-носителя имеет 50% вероятность заболеть заболеванием. Причины могут включать редкость этого заболевания или то, что пораженные мужчины находятся в неблагоприятном репродуктивном положении. Поэтому часто применяется медицинское использование ПГД для отбора потомства женского пола с целью предотвращения передачи Х-сцепленных менделевских рецессивных заболеваний. Преимплантационная генетическая диагностика, применяемая для выбора пола, может использоваться при неменделевских расстройствах, которые значительно чаще встречаются у представителей одного пола. Перед началом процесса ПГД проводятся три оценки для профилактики этих наследственных заболеваний. Чтобы обосновать использование ПГД, выбор пола основан на серьезности наследственного заболевания, соотношении рисков для обоих полов или вариантах лечения заболевания.

Незначительная инвалидность

ПГД иногда использовалась для отбора эмбриона на наличие определенного заболевания или инвалидности, например глухоты, чтобы ребенок разделял эту характеристику с родителями.

Немедицинские черты

Потенциально спорное использование ПГД может возникнуть в случае генетических тестов, нацеленных на немедицинские характеристики, такие как слух, сексуальная ориентация, рост, красота или интеллект. Некоторые тесты, например тесты на мутации GJB2, связанные с наследственной глухотой, могут привести к запросу на ПГД, чтобы избежать или отдать предпочтение этим признакам. Этические проблемы включают потенциальный вред пострадавшим сообществам, например, глухим. Аналогичные вопросы могут возникнуть и в случае генетического теста на сексуальную ориентацию, что вызовет обеспокоенность по поводу дискриминации. Некоторые настаивают на полном запрете отбора таких признаков, опасаясь более серьезных последствий, таких как генная инженерия потомства. Однако окончательные суждения по этим вопросам не могут быть сделаны до тех пор, пока такие испытания не станут ближе к практической реальности.

Классификация

Мы различаем три типа преимплантационного генетического тестирования (ПГТ) в зависимости от оцениваемых дефектов:

• ПГТ-А : также называется преимплантационным генетическим скринингом (ПГС). Улучшает показатели наступления беременности, позволяя удалять анеуплоидные эмбрионы и отбирать эуплоидные эмбрионы для переноса. Эуплоидные эмбрионы с большей вероятностью имплантируются и развиваются в здоровую беременность. NGS и FISH являются наиболее часто используемыми методами диагностики моносомий, трисомий и полиплоидий. Основными кандидатами на PGT-A могут быть следующие:

1. Женщины пожилого материнского возраста
2. Пары с привычным невынашиванием беременности в анамнезе
3. Пары с повторной неудачей ЭКО
4. Партнер-мужчина с тяжелым мужским бесплодием.

• ПГТ-М : в этом случае моногенные заболевания оцениваются у эмбриона. Моногенные нарушения обусловлены мутациями одного гена (аутосомно-рецессивный, аутосомно-доминантный, Х-сцепленный ). Ранее ПЦР для ПГТ-М использовали . Однако в последнее время PGT-M использует технологию массива и NGS.
• ПГТ-СР : учитываются все структурные отклонения в хромосоме ( транслокации , инверсии , дупликации , инсерции , делеции ). Использовались различные методы: ПЦР, FISH и NGS.

Технические аспекты

ПГД — это форма генетической диагностики, проводимая до имплантации. Это означает, что ооциты пациентки следует оплодотворить in vitro , а эмбрионы хранить в культуре до установления диагноза. Также необходимо провести биопсию этих эмбрионов с целью получения материала для постановки диагноза. Сама диагностика может проводиться с помощью нескольких методик в зависимости от характера изучаемого состояния. Как правило, методы на основе ПЦР используются для моногенных заболеваний, а FISH – для хромосомных аномалий, а также для определения пола в тех случаях, когда протокол ПЦР для Х-сцепленного заболевания недоступен. Эти методы необходимо адаптировать для применения на бластомерах и тщательно протестировать на одноклеточных моделях перед клиническим использованием. Наконец, после замены эмбрионов излишки непораженных эмбрионов хорошего качества можно криоконсервировать, чтобы разморозить и перенести обратно в следующем цикле.

Получение эмбрионов

В настоящее время все эмбрионы ПГД получают с помощью вспомогательных репродуктивных технологий использовать естественные циклы и оплодотворение in vivo , хотя в прошлом пытались с последующим промыванием матки, и в настоящее время от них практически отказались. Для получения большой группы ооцитов пациенткам проводят контролируемую стимуляцию яичников (КОГ). КОГ проводится либо по протоколу агонистов с использованием аналогов гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ) для десенсибилизации гипофиза в сочетании с человеческими менопаузными гонадотропинами (чМГ) или рекомбинантным фолликулостимулирующим гормоном (ФСГ), либо по протоколу антагонистов с использованием рекомбинантного ФСГ в сочетании с антагонист ГнРГ в соответствии с клинической оценкой профиля пациента (возраст, индекс массы тела (ИМТ), эндокринные параметры). ХГЧ вводят при наличии не менее трех фолликулов размером более 17 мм. средний диаметр определяется при трансвагинальном УЗИ. Трансвагинальное извлечение яйцеклеток под контролем УЗИ назначается через 36 часов после введения ХГЧ. Добавка лютеиновой фазы состоит из ежедневного интравагинального введения 600 мкг природного микронизированного прогестерона.

Ооциты тщательно отделяют от кумулюсных клеток, поскольку эти клетки могут быть источником загрязнения во время ПГД, если используется технология на основе ПЦР. В большинстве зарегистрированных циклов интрацитоплазматическая инъекция спермы вместо ЭКО используется (ИКСИ). Основные причины заключаются в предотвращении загрязнения остатками сперматозоидов, прилипших к зоне пеллюцида, и во избежание неожиданного неудачного оплодотворения. Процедура ИКСИ проводится на зрелых ооцитах метафазы II, а оплодотворение оценивают через 16–18 часов. Развитие эмбриона дополнительно оценивается каждый день перед биопсией и до переноса в матку женщины. На стадии дробления оценку эмбриона проводят ежедневно на основании количества, размера, формы клеток и скорости фрагментации бластомеров. На 4-й день эмбрионы оценивали в зависимости от степени их уплотнения, а бластоцисты оценивали по качеству трофэктодермы и внутренней клеточной массы, а также степени их расширения.

Процедуры биопсии

Поскольку ПГД можно проводить на клетках разных стадий развития, процедуры биопсии соответственно различаются. Теоретически биопсию можно проводить на всех предимплантационных стадиях, но предложено только три: на неоплодотворенных и оплодотворенных ооцитах (для полярных телец, PB), на третьем дне стадии дробления эмбрионов (для бластомеров) и на бластоцистах (для клеток трофэктодермы). ).

Процедура биопсии всегда включает два этапа: вскрытие прозрачной оболочки и удаление клеток. Существуют разные подходы к обоим этапам, в том числе механические, химические и физические ( кислотный раствор Тирода ), а также лазерная технология для нарушения прозрачной оболочки, экструзия или аспирация для удаления PB и бластомеров, а также грыжеобразования клеток трофэктодермы.

Полярная биопсия тела

Основная статья: Биопсия полярного тела

Биопсия полярного тельца – это отбор проб полярного тельца , представляющего собой небольшую гаплоидную клетку, которая формируется одновременно с яйцеклеткой во время оогенеза , но которая обычно не обладает способностью к оплодотворению . По сравнению с биопсией бластоцисты , биопсия полярного тела потенциально может быть дешевле, иметь меньше вредных побочных эффектов и более чувствительна при обнаружении отклонений. Основное преимущество использования полярных телец в ПГД заключается в том, что они не являются необходимыми для успешного оплодотворения или нормального развития эмбриона, что не гарантирует никакого вредного воздействия на эмбрион. Одним из недостатков биопсии ПБ является то, что она дает информацию только о материнском вкладе в развитие эмбриона, поэтому могут быть диагностированы случаи наследственных по аутосомно-доминантному и Х-сцепленному типу заболеваний, передающихся исключительно по материнской линии, а аутосомно-рецессивные заболевания могут быть диагностированы только частично диагностировать. Другим недостатком является повышенный риск диагностической ошибки, например, из-за деградации генетического материала или событий рекомбинации, которые приводят к образованию гетерозиготных первых полярных телец.

Биопсия на стадии дробления (биопсия бластомера)

Биопсия на стадии дробления обычно проводится утром на третий день после оплодотворения, когда нормально развивающиеся эмбрионы достигают стадии восьми клеток. Биопсия обычно проводится на эмбрионах с менее чем 50% безъядерных фрагментов и на восьмиклеточной или более поздней стадии развития. В прозрачной зоне проделывают отверстие и один или два бластомера, осторожно аспирируют или выдавливают через него содержащие ядро. Основное преимущество биопсии на стадии дробления перед анализом PB заключается в том, что можно изучить генетический вклад обоих родителей. С другой стороны, эмбрионы на стадии дробления имеют высокий уровень хромосомного мозаицизма , что ставит под вопрос, будут ли результаты, полученные на одном или двух бластомерах, репрезентативными для остальной части эмбриона. Именно по этой причине в некоторых программах используется комбинация биопсии PB и биопсии бластомеров. Кроме того, биопсия на стадии расщепления, как и в случае биопсии ПБ, дает очень ограниченное количество ткани для диагностики, что делает необходимым исследование одноклеточных клеток. ПЦР и FISH Методы . Хотя теоретически биопсия ПБ и биопсия бластоцисты менее вредны, чем биопсия на стадии дробления, этот метод по-прежнему является распространенным. Он используется примерно в 94% циклов ПГД, о которых сообщается Консорциуму ESHRE PGD. Основная причина заключается в том, что она позволяет поставить более безопасный и более полный диагноз, чем биопсия ПБ, и при этом оставляет достаточно времени для завершения диагностики до того, как эмбрионы должны быть заменены в матке пациентки, в отличие от биопсии бластоцисты. Из всех стадий дробления общепринято, что оптимальным моментом для биопсии является стадия восьми клеток. Это диагностически безопаснее, чем биопсия ПБ, и, в отличие от биопсии бластоцисты, позволяет диагностировать эмбрионы до 5-го дня. На этой стадии клетки еще тотипотентны, а эмбрионы еще не уплотняются. Хотя было показано, что до четверти человеческого эмбриона можно удалить, не нарушая его развития, еще предстоит изучить, коррелирует ли биопсия одной или двух клеток со способностью эмбриона к дальнейшему развитию, имплантации и перерасти в доношенную беременность.

Не все методы открытия прозрачной зоны имеют одинаковый уровень успеха, поскольку на благополучие эмбриона и бластомера может влиять процедура, используемая для биопсии. Сверление зоны с помощью кислотного раствора Тирода (ZD) сравнивали с частичной диссекцией зоны (PZD), чтобы определить, какой метод приведет к более успешной беременности и окажет меньшее влияние на эмбрион и/или бластомер. ZD использует пищеварительный фермент, такой как проназа, что делает его химическим методом бурения. Химические вещества, используемые при ЗД, могут оказать повреждающее воздействие на эмбрион. PZD использует стеклянную микроиглу для разрезания прозрачной оболочки, что делает этот метод механическим рассечением, для выполнения которого обычно требуются квалифицированные руки. В исследовании, в котором участвовала 71 пара, ЗД выполнялось в 26 циклах у 19 пар, а ПЗД - в 59 циклах у 52 пар. При анализе отдельных клеток показатель успеха составил 87,5% в группе PZD и 85,4% в группе ZD. Возраст матери, количество полученных ооцитов, частота оплодотворения и другие переменные не различались между группами ZD и PZD. Было обнаружено, что PZD приводил к значительно более высокому уровню наступления беременности (40,7% против 15,4%), продолжающейся беременности (35,6% против 11,5%) и имплантации (18,1% против 5,7%), чем ZD. Это говорит о том, что использование механического метода ЗД в биопсии бластомеров для преимплантационной генетической диагностики может быть более эффективным, чем использование химического метода ЗД. Успех PZD по сравнению с ZD можно объяснить тем, что химический агент в ZD оказывает вредное воздействие на эмбрион и/или бластомер. В настоящее время преобладающим методом вскрытия прозрачной зоны является сверление зоны с помощью лазера. Использование лазера является более простым методом, чем использование механических или химических средств. Однако лазерное сверление может быть вредным для эмбриона, и его использование очень дорого для лабораторий экстракорпорального оплодотворения, особенно когда ПГД не является распространенным процессом в наше время. PZD может стать жизнеспособной альтернативой этим проблемам.

Биопсия бластоцисты

В попытке преодолеть трудности, связанные с одноклеточными методами, было предложено проводить биопсию эмбрионов на стадии бластоцисты, обеспечивая большее количество исходного материала для диагностики. Было показано, что если в одной пробирке с образцом присутствует более двух клеток, основные технические проблемы ПЦР или FISH одиночных клеток практически исчезнут. С другой стороны, как и в случае биопсии на стадии дробления, хромосомные различия между внутренней клеточной массой и трофэктодермой (TE) могут снизить точность диагностики, хотя, как сообщается, этот мозаицизм ниже, чем на стадии дробления. эмбрионы.

Было показано, что ТЕ-биопсия успешна на животных моделях, таких как кролики, мыши и приматы. Эти исследования показывают, что удаление части ТЕ-клеток не оказывает вредного воздействия на дальнейшее in vivo развитие эмбриона .

Биопсия человека на стадии бластоцисты для ПГД проводится путем проделывания отверстия в ЗП на третий день культивирования in vitro . Это позволяет развивающемуся ТЭ выступать после бластуляции, что облегчает биопсию. На пятый день после оплодотворения из ТЕ с помощью стеклянной иглы или лазерной энергии вырезают примерно пять клеток, оставляя эмбрион практически нетронутым и без потери внутренней клеточной массы. После постановки диагноза эмбрионы могут быть заменены в том же цикле или криоконсервированы и перенесены в следующем цикле.

У этого подхода есть два недостатка, обусловленные стадией, на которой он осуществляется. Во-первых, только примерно половина преимплантационных эмбрионов достигает стадии бластоцисты. Это может ограничить количество бластоцист, доступных для биопсии, ограничивая в некоторых случаях успех ПГД. Макартур и коллеги сообщают, что в 21% начатых циклов ПГД не было эмбриона, подходящего для биопсии ТЕ. Эта цифра примерно в четыре раза превышает средний показатель, представленный данными консорциума ESHRE PGD, где преобладающими методами являются PB и биопсия на стадии расщепления. С другой стороны, отсрочка биопсии до этой поздней стадии развития ограничивает время для проведения генетического диагноза, что затрудняет повторное проведение второго раунда ПЦР или регибридизацию зондов FISH до того, как эмбрионы будут перенесены обратно пациенту.

Отбор проб кучевых клеток

Отбор проб кумулюсных клеток можно проводить в дополнение к отбору проб полярных телец или клеток эмбриона. Из-за молекулярных взаимодействий между кумулюсными клетками и ооцитом можно выполнить профилирование экспрессии генов кумулюсных клеток для оценки качества ооцитов и эффективности протокола гиперстимуляции яичников , а также косвенно предсказать анеуплоидию , развитие эмбриона и исходы беременности.

Неинвазивные методы

Традиционная биопсия эмбриона может быть инвазивной и дорогостоящей. Поэтому исследователи постоянно ищут менее инвазивные методы преимплантационного генетического тестирования . Недавно были опубликованы исследования новых неинвазивных методов преимплантационного генетического скрининга, таких как жидкость бластоцеля и отработанная эмбриональная среда, в качестве альтернативы традиционным методам.

Использование жидкости бластоцеля

В ходе нормального процесса ЭКО правильная практика витрификации эмбрионов увеличивает вероятность здоровой беременности. В процессе витрификации развившийся бласт обезвоживается, он и полость его бластоцеля схлопываются для процесса замерзания. Для облегчения коллапса использовалось множество методов, включая лазерный импульс, повторное микропипетирование , прокол микроиглами или микроаспирацию. Обычно эту жидкость затем выбрасывают, однако при предимплантационном генетическом тестировании BL эту жидкость сохраняют, а затем проверяют на ДНК. Считается, что эта ДНК происходит из клеток, прошедших апоптоз, обнаруженных в развивающемся эмбрионе.

Использование кондиционированной среды для культуры бластоцист.

Другой метод менее инвазивного преимплантационного генетического тестирования включает тестирование культуральной среды, в которой развивался эмбрион. Было отмечено, что эмбрион высвобождает фрагменты ДНК из клеток, погибших в инкубационном периоде. Обладая этими знаниями, ученые пришли к выводу, что они смогут выделить эту ДНК и использовать ее для преимплантационного генетического тестирования.

Преимущества и последствия

Хотя существуют противоречивые данные о том, вредны ли для эмбриона более традиционные методы преимплантационного генетического тестирования, существуют более новые методы менее инвазивных и столь же эффективных методов тестирования с использованием жидкости бластоцеля и отработанной среды эмбриона. Две проблемы с этими альтернативами — минимальное количество ДНК, с которым можно работать, и точность этой технологии. Обе эти проблемы недавно были рассмотрены Кузнецовым, который решил использовать оба метода, объединив количество ДНК, полученное обоими методами. После выделения ДНК ее использовали для предимплантационного генетического тестирования. Результаты показали, что когда оба метода (жидкость бластоцисты и отработанная среда эмбриона) использовались в комбинации, они показали коэффициент кордантности для всей копии хромосомы 87,5% по сравнению с трофэктодермой и 96,4% по сравнению со всей бластоцистой (золотой стандарт). ). Кроме того, после амплификации с использованием этого нового метода они смогли получить 25,0–54,0 нг/мл ДНК на образец. Традиционными методами, такими как трофэктодерма, они собрали от 10 до 44 нг/мл.

Методы генетического анализа

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) и полимеразная цепная реакция (ПЦР) являются двумя широко используемыми технологиями первого поколения в ПГД. ПЦР обычно используется для диагностики моногенных заболеваний, а FISH используется для выявления хромосомных аномалий (например, скрининг анеуплоидии или хромосомных транслокаций). За последние несколько лет различные достижения в области ПГД-тестирования позволили улучшить полноту и точность доступных результатов в зависимости от используемой технологии. Недавно был разработан метод, позволяющий фиксировать метафазные пластинки из одиночных бластомеров. Этот метод в сочетании с FISH и m-FISH может дать более надежные результаты, поскольку анализ проводится на целых метафазных пластинках.

Помимо FISH и ПЦР, секвенирование единичного генома . в качестве метода преимплантационной генетической диагностики тестируется Это характеризует полную ДНК последовательность генома эмбриона.

РЫБА

FISH – наиболее часто применяемый метод определения хромосомной конституции эмбриона. В отличие от кариотипирования , его можно использовать на интерфазных хромосомах, поэтому его можно использовать на PB, бластомерах и образцах TE. Клетки фиксируют на предметных стеклах микроскопа и гибридизуют с ДНК-зондами. Каждый из этих зондов специфичен для части хромосомы и помечен флюорохромом.

Двойной FISH считался эффективным методом определения пола предимплантационных эмбрионов человека и дополнительной способностью обнаруживать аномальное количество копий хромосом, что невозможно с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

В настоящее время доступна большая панель зондов для разных сегментов всех хромосом, но ограниченное количество различных флуорохромов ограничивает количество сигналов, которые можно анализировать одновременно.

Тип и количество зондов, используемых для исследования пробы, зависят от показаний. Для определения пола (используется, например, когда протокол ПЦР для данного Х-сцепленного заболевания недоступен) применяются зонды для X- и Y-хромосом вместе с зондами для одной или нескольких аутосом в качестве внутреннего контроля FISH. Можно добавить больше зондов для проверки анеуплоидий , особенно тех, которые могут привести к жизнеспособной беременности (например, трисомии 21 ). Использование зондов для хромосом X, Y, 13, 14, 15, 16, 18, 21 и 22 потенциально позволяет обнаружить 70% анеуплоидий, обнаруживаемых при самопроизвольных абортах.

Чтобы иметь возможность проанализировать больше хромосом в одном образце, можно провести до трех последовательных раундов FISH. В случае хромосомных перестроек необходимо выбирать определенные комбинации зондов, фланкирующие интересующую область. Считается, что метод FISH имеет вероятность ошибок 5–10%.

Основной проблемой использования FISH для изучения хромосомного строения эмбрионов является повышенный уровень мозаицизма, наблюдаемый на предимплантационной стадии человека. Метаанализ более 800 эмбрионов показал, что примерно 75% предимплантационных эмбрионов являются мозаичными, из них примерно 60% - диплоидно-анеуплоидной мозаикой и примерно 15% - анеуплоидной мозаикой. Ли и коллеги обнаружили, что 40% эмбрионов, диагностированных как анеуплоидные на 3-й день, имели эуплоидную внутреннюю клеточную массу на 6-й день. Штэссен и его коллеги обнаружили, что 17,5% эмбрионов, диагностированных как аномальные во время ПГС, и подвергнутых повторному анализу после ПГД, Было обнаружено, что они также содержат нормальные клетки, а 8,4% оказались абсолютно нормальными. Как следствие, был поставлен вопрос, действительно ли одна или две клетки, изученные из эмбриона, являются репрезентативными для целого эмбриона, и не выбрасываются ли жизнеспособные эмбрионы из-за ограничений метода. Тем не менее, мозаичные эмбрионы можно переносить, но только в том случае, если в наличии нет эуплоидов, предварительно проинформировав пациентов о рисках и желательно проведя пренатальную диагностику.

ПЦР

Кэри Маллис задумал ПЦР в 1985 году как vitro упрощенное воспроизведение in процесса репликации ДНК . Используя химические свойства ДНК и наличие термостабильных ДНК-полимераз , ПЦР позволяет обогатить образец ДНК определенной последовательностью. ПЦР дает возможность получить большое количество копий определенного участка генома, что делает возможным дальнейший анализ. Это высокочувствительная и специфичная технология, что делает ее пригодной для всех видов генетической диагностики, включая ПГД. В настоящее время существует множество различных вариаций самой ПЦР, а также различных методов апостериорного анализа продуктов ПЦР.

При использовании ПЦР в ПГД приходится сталкиваться с проблемой, которой не существует при рутинном генетическом анализе: мизерное количество доступной геномной ДНК. Поскольку ПГД выполняется на отдельных клетках, ПЦР необходимо адаптировать и довести до своих физических пределов, а также использовать минимально возможное количество матрицы: одну цепь. Это подразумевает длительный процесс тонкой настройки условий ПЦР и восприимчивость ко всем проблемам традиционной ПЦР, но в несколько степеней усиления. Большое количество необходимых циклов ПЦР и ограниченное количество матрицы делают ПЦР одной клетки очень чувствительной к загрязнению. Еще одной проблемой, специфичной для ПЦР одиночных клеток, является феномен выпадения аллелей (ADO). Он заключается в случайном отсутствии амплификации одного из аллелей, присутствующих в гетерозиготном образце. ADO серьезно ставит под угрозу надежность ПГД, поскольку гетерозиготный эмбрион может быть диагностирован как пораженный или непораженный, в зависимости от того, какой аллель не сможет амплифицироваться. Это особенно актуально при ПГД при аутосомно-доминантном заболевании. расстройства, при которых АДО пораженного аллеля может привести к переносу пораженного эмбриона.

Несколько анализов на основе ПЦР были разработаны для различных заболеваний, таких как триплетные повторы генов, связанных с миотонической дистрофией, и ломкий Х в отдельных соматических клетках человека, гаметах и ​​эмбрионах.

Концепция секвенирования нового поколения

Основная философия массового параллельного секвенирования, используемая в NGS, адаптирована из дробового секвенирования, разработанного для секвенирования более длинных участков ДНК. Технологии NGS считывают целевые шаблоны ДНК случайным образом. Целевая ДНК или весь геном разбивается на мелкие кусочки, а затем эти фрагменты ДНК лигируются к назначенным адаптерам для случайного считывания во время параллельный синтез ДНК. Длина чтения соответствует фактическому количеству непрерывных секвенированных оснований. Длина чтений намного короче, чем при секвенировании по Сэнгеру, поэтому результаты NGS называются короткими чтениями .

С 2014 года секвенирование нового поколения (NGS). в ПГТ проводится NGS — это группа методов, позволяющих секвенировать большие объемы ДНК при разумных затратах и ​​времени. Это может дать нам общее представление о полном геноме эмбриона, включая митохондриальный . Эти методы основаны на секвенировании коротких ридов длиной около 400 оснований каждый и перекрытии этих ридов с помощью мощного программного обеспечения для выравнивания.

Аналогично, NGS используется для выявления анеуплоидий в 24 хромосомах и дефектов одного гена, когда есть показания от родителей-носителей. Основным преимуществом является то, что NGS может сочетать выявление как анеуплоидий, так и моногенных заболеваний с помощью одной биопсии, а также снижает доступные затраты, делая его более доступным.

Двумя примерами NGS являются пиросеквенирование и обратимый терминатор красителя .

Пиросеквенирование

Метод пиросеквенирования основан на принципе секвенирования путем синтеза и на обнаружении высвобождаемого пирофосфата во время синтеза ДНК. Он использует серию из четырех ферментов для точного обнаружения последовательностей нуклеиновых кислот во время синтеза.

Циклы четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP) отдельно итеративно добавляются к реакционной смеси. Каскад начинается с реакции полимеризации нуклеиновой кислоты, в которой неорганический пирофосфат высвобождается в результате включения нуклеотидов полимеразой. За каждым событием включения нуклеотида следует высвобождение неорганического пирофосфата в количестве, эквимолярном количеству включенного нуклеотида. Высвободившийся пирофосфат количественно превращается в АТФ под действием АТФ-сульфурилазы в присутствии АПС. Образующийся АТФ запускает опосредованное люциферазой превращение люциферина в оксилюциферин, производя видимый свет в количествах, пропорциональных количеству АТФ. В ходе этого процесса синтеза цепь ДНК удлиняется за счет комплементарных нуклеотидов, и последовательность ДНК демонстрируется пирограммой на экране. Общая реакция от полимеризации до обнаружения света происходит в течение 3–4 секунд при комнатной температуре. АТФ-сульфуралаза превращает пирофосфат в АТФ примерно за 1,5 секунды, а генерация света люциферазой происходит менее чем за 0,2 секунды.

Пределы

Наряду с преимуществами, предлагаемыми этими технологиями, существует ряд проблем, как технических, так и этических, которые необходимо решить, прежде чем технологии NGS выйдут на клиническую арену диагностики эмбрионов. Одним из ограничений будет интерпретация массивных данных о последовательностях, полученных с помощью технологий NGS. Фоновые полиморфизмы следует отличать от потенциально вызывающих заболевания мутаций и вариаций числа копий. Путем выборочного восстановления и последующего секвенирования представляющих интерес геномных локусов генерируемые данные и усилия по анализу могут быть значительно сокращены по сравнению с подходом полногеномного секвенирования.

Установление диагноза

Постановка диагноза при ПГД не всегда проста. Критерии, используемые для выбора эмбрионов для замены по результатам FISH или ПЦР, не одинаковы во всех центрах. В случае FISH в некоторых центрах заменяют только те эмбрионы, которые признаны хромосомно нормальными (т.е. имеющими два сигнала для гоносом и анализируемых аутосом) после анализа одного или двух бластомеров, а также при анализе двух бластомеров. , результаты должны быть согласованными. Другие центры утверждают, что эмбрионы, диагностированные как моносомные, могут быть перенесены, поскольку ложная моносомия (т.е. потеря одного сигнала FISH в нормальной диплоидной клетке) является наиболее часто встречающимся ошибочным диагнозом. В этих случаях риск анеуплоидной беременности отсутствует, а нормальные диплоидные эмбрионы не теряются при переносе из-за ошибки FISH. Более того, было показано, что эмбрионы, диагностированные как моносомные на 3-й день (за исключением хромосом Х и 21), никогда не развиваются в бластоцисты, что коррелирует с тем, что эти моносомии никогда не наблюдаются при продолжающихся беременностях.

Диагноз и ошибочный диагноз при ПГД с использованием ПЦР были математически смоделированы в работе Навиди и Арнхейма, а также Льюиса и соавторов. Важнейший вывод этих публикаций заключается в том, что для эффективной и точной диагностики эмбриона необходимы два генотипа. Это может быть основано на связанных генотипах маркера и заболевания из одной клетки или на генотипах маркера/заболевания из двух клеток. Интересным аспектом, рассматриваемым в этих работах, является детальное изучение всех возможных комбинаций аллелей, которые могут появиться в результатах ПЦР для конкретного эмбриона. Авторы указывают, что некоторые из генотипов, которые могут быть получены во время диагностики, могут не соответствовать ожидаемому образцу связанных маркерных генотипов, но все же обеспечивают достаточную уверенность в отношении незатронутого генотипа эмбриона. Хотя эти модели обнадеживают, они основаны на теоретической модели, и обычно диагноз устанавливается на более консервативной основе, чтобы избежать возможности ошибочного диагноза. Когда во время анализа клетки появляются неожиданные аллели, в зависимости от наблюдаемого генотипа, считается, что либо была проанализирована аномальная клетка, либо произошло загрязнение, и диагноз не может быть установлен. Случай, в котором аномалию анализируемой клетки можно четко идентифицировать, – это когда с помощью мультиплексная ПЦР на сцепленные маркеры, в образце обнаруживаются только аллели одного из родителей. В этом случае клетку можно рассматривать как несущую моносомию по хромосоме, на которой расположены маркеры, или, возможно, как гаплоидную. Появление единственного аллеля, указывающего на пораженный генотип, считается достаточным для диагностики пораженного эмбриона, и для замены предпочтительны эмбрионы, у которых диагностирован полный непораженный генотип. Хотя эта политика может привести к меньшему количеству непораженных эмбрионов, пригодных для переноса, она считается предпочтительной, чем возможность ошибочного диагноза.

Преимплантационное генетическое гаплотипирование

Основная статья: Преимплантационное генетическое гаплотипирование

Преимплантационное генетическое гаплотипирование (PGH) — это метод ПГД, при котором гаплотип генетических маркеров идентифицируется , статистически связанных с целевым заболеванием, а не мутация, вызывающая заболевание.

Как только панель связанных генетических маркеров будет создана для конкретного заболевания, ее можно будет использовать для всех носителей этого заболевания. Напротив, поскольку даже моногенное заболевание может быть вызвано множеством различных мутаций в пораженном гене, традиционные методы ПГД, основанные на обнаружении конкретной мутации, потребуют тестов, специфичных для мутации. Таким образом, PGH расширяет доступность ПГД в тех случаях, когда тесты, специфичные для мутаций, недоступны.

PGH также имеет преимущество перед FISH в том, что FISH обычно не способен дифференцировать эмбрионы, обладающие сбалансированной формой хромосомной транслокации , и эмбрионы, несущие гомологичные нормальные хромосомы. Эта неспособность может серьезно навредить поставленному диагнозу. PGH может отличить то, что FISH часто не может. PGH делает это, используя полиморфные маркеры, которые лучше подходят для распознавания транслокаций. Эти полиморфные маркеры способны различать эмбрионы, несущие нормальные, сбалансированные и несбалансированные транслокации. FISH также требует большей фиксации клеток для анализа, тогда как PGH требует только переноса клеток в пробирки для полимеразной цепной реакции. Перенос клеток является более простым методом и оставляет меньше возможностей для неудачного анализа.

Перенос эмбрионов и криоконсервация лишних эмбрионов

Перенос эмбрионов обычно выполняется на третий или пятый день после оплодотворения, сроки зависят от методов, используемых для ПГД, и стандартных процедур центра ЭКО , где он проводится.

С введением в Европе политики переноса одного эмбриона, направленной на снижение частоты многоплодной беременности после ВРТ, в матке обычно заменяется один эмбрион или ранняя бластоциста. Сывороточный ХГЧ определяют на 12 день. Если установлена ​​беременность, проводят ультразвуковое исследование на 7 неделе для подтверждения наличия сердцебиения плода. Парам обычно рекомендуется пройти ПНД из-за хотя и низкого риска постановки неправильного диагноза.

Нет ничего необычного в том, что после ПГД эмбрионов, пригодных для переноса обратно женщине, оказывается больше, чем необходимо. Для пар, проходящих ПГД, эти эмбрионы очень ценны, поскольку текущий цикл пары может не привести к продолжающейся беременности. Криоконсервация эмбрионов , а затем их размораживание и замена могут дать им второй шанс на беременность без необходимости повторять громоздкие и дорогостоящие процедуры ВРТ и ПГД.

Побочные эффекты для эмбриона

По словам Майкла Такера, доктора философии, научного директора и главного эмбриолога компании Georgia Reproductive Specialists в Атланте, ПГД/ПГС — это инвазивная процедура, которая требует серьезного рассмотрения. По словам Серены Х. Чен, доктора медицинских наук, репродуктивного эндокринолога из Нью-Джерси из IRMS репродуктивной медицины в Сент-Барнава, один из рисков ПГД включает в себя повреждение эмбриона во время процедуры биопсии (что, в свою очередь, разрушает эмбрион в целом). Другим риском является криоконсервация, при которой эмбрион хранится в замороженном состоянии, а затем размораживается для проведения процедуры. Около 20% размороженных эмбрионов не выживают. Было проведено исследование, показывающее, что эмбрион, полученный при биопсии, с меньшей вероятностью выживет при криоконсервации. Другое исследование предполагает, что ПГС с биопсией на стадии дробления приводит к значительно более низкому уровню живорождения у женщин пожилого материнского возраста. Кроме того, другое исследование рекомендует проявлять осторожность и длительное наблюдение, поскольку ПГД/ПГС увеличивает перинатальную смертность при многоплодной беременности.

В исследовании на мышах ПГД связывают с различными долгосрочными рисками, включая увеличение веса и ухудшение памяти; протеомный анализ мозга взрослых мышей показал значительные различия между биопсией и контрольной группой, многие из которых тесно связаны с нейродегенеративными расстройствами, такими как болезнь Альцгеймера и синдром Дауна.

Этические проблемы

ПГД поднимает этические проблемы, хотя этот подход может снизить зависимость от отмены отбора плода во время беременности. Этот метод можно использовать для пренатального определения пола эмбриона и, таким образом, потенциально можно использовать для отбора эмбрионов одного пола в пользу другого в контексте « семейного баланса ». Об использовании ПГД для определения гендерного разнообразия сообщалось в Индии, где программа ЭКО в Бомбее в настоящее время предоставляет ПГД для выбора потомства мужского пола в качестве второго ребенка от пар, у которых уже есть дочь. Из-за важности наследника мужского пола в Индии эти пары могли прибегнуть к аборту, если были беременны плодом женского пола (хотя это и незаконно). В таких условиях ПГД для выбора пола с учетом гендерного разнообразия представляется оправданной. Возможно, в будущем появится возможность сделать другой выбор «социального отбора», который вызовет социально-экономические проблемы. В матку женщины имплантируют только непораженные эмбрионы; те, которые пострадали, либо выбрасываются, либо передаются науке.

Возражения против ПГД, основанные на ее влиянии на эмбрионы, повторяют дебаты по поводу абортов и статуса эмбрионов, которые имели место во многих других контекстах, от абортов до исследований эмбриональных стволовых клеток. Люди, которые думают, что эмбрион или плод — это человек, будут возражать против создания и уничтожения эмбрионов и выступают против большинства методов ПГД. Другие считают, что предимплантационные эмбрионы слишком рудиментарны в развитии, чтобы иметь интересы или права, но они заслуживают особого уважения как первый этап на пути к новому человеку.

ПГД имеет потенциал для выявления генетических проблем, не связанных с медицинской необходимостью , таких как интеллект и красота, а также отрицательных черт, таких как инвалидность. Медицинское сообщество сочло это предложение противоречивым и противоречивым. Перспектива « дизайнерского ребенка » тесно связана с методом ПГД, создавая опасения, что увеличение частоты генетического скрининга приведет к развитию современного евгенического движения. принцип репродуктивной благотворительности С другой стороны, предлагается , который представляет собой предполагаемое моральное обязательство родителей , имеющих возможность отбирать своих детей в пользу тех, у кого ожидается лучшая жизнь. Аргументом в пользу этого принципа является то, что черты характера (такие как сочувствие, память и т. д.) являются «универсальными средствами» в том смысле, что они имеют инструментальную ценность в реализации любых жизненных планов, которые может возникнуть у ребенка. Уолтер Вейт утверждал, что не существует внутренней моральной разницы между «созданием» и «выбором» жизни, что делает евгенику естественным следствием принятия принципа репродуктивной благотворительности.

Инвалиды

В 2006 году три процента клиник ПГД в США сообщили, что выбрали эмбрион на наличие инвалидности. Причастные пары были обвинены в умышленном причинении вреда ребенку. Эта практика примечательна карликовостью, когда родители намеренно создают ребенка-карлика. При выборе брата-спасителя для проведения подходящей трансплантации костного мозга уже существующему больному ребенку возникают проблемы, включая превращение в товар и благополучие ребенка-донора.

Опираясь на результат одной клетки многоклеточного эмбриона, ПГД действует исходя из предположения, что эта клетка является репрезентативной для остальной части эмбриона. Это может быть не так, поскольку частота мозаицизма часто относительно высока. В некоторых случаях ПГД может привести к ложноотрицательному результату, приводящему к принятию аномального эмбриона, или к ложноположительному результату, приводящему к отмене отбора нормального эмбриона.

Еще одним проблемным случаем являются случаи желательного неразглашения результатов ПГД при некоторых генетических нарушениях, которые могут еще не проявляться у родителя, таких как болезнь Хантингтона . Его применяют, когда пациенты не желают знать свой статус носителя, но хотят гарантировать, что у них будет потомство, свободное от заболевания. Эта процедура может поставить практикующих врачей в сомнительные этические ситуации, например, когда нет здоровых, непораженных эмбрионов для переноса и необходимо провести имитацию переноса, чтобы такие пациенты не заподозрили, что они являются носителями. вместо этого Целевая группа по этике Европейского общества репродукции человека и эмбриологии (ESHRE) в настоящее время рекомендует использовать исключающее тестирование . Тестирование на исключение основано на анализе сцепления с полиморфными маркерами , с помощью которого можно установить родительское и прародительское происхождение хромосом. Таким образом, заменяются только эмбрионы, которые не содержат хромосому, полученную от пораженного дедушки и бабушки, что позволяет избежать необходимости обнаружения самой мутации.

Критика ПГД

Из-за деликатности этого вопроса преимплантационная генетическая диагностика вызвала бурные дебаты в научных кругах и за их пределами.

Те, кто против возможности выбрасывания эмбриона во избежание риска инвалидности (например, возможного неблагоприятного отбора эмбрионов, у которых может развиться «инвалидность», такая как глухота), утверждают, что если есть только две возможности, это «существование и несуществование» («существование и несуществование» («существование и несуществование»). прийти в мир» или «не прийти в мир»), предоставление им права прийти в мир лучше, чем альтернатива несуществования.

Другой широко используемый аргумент в пользу отказа от преимплантационной генетической диагностики связан со значением термина «инвалидность» (Bickenach & Chatterji, 2003). Язык медицины описывает инвалидность как нечто, функциональность которого отклоняется от нормального функционирования. Однако большая часть сообщества инвалидов подчеркивает, что инвалидность часто определяется тем, как общество структурирует мир . Таким образом, понятия «норма» и «здоровье» относительны и зависят от времени, места и общества. Противники ПГД выступают против предотвращения рождения людей с ограниченными возможностями посредством преимплантационной генетической диагностики и утверждают, что люди должны сначала определить, что такое инвалидность.

Поддержка ПГД

В литературе выделяются три наиболее распространенных типа аргументов в пользу преимплантационной генетической диагностики. Аргументы первого типа в основном выдвигаются частью научных кругов, которые считают, что инвалидность или расстройство, вероятно, влекут за собой снижение качества жизни будущего ребенка. Второй наиболее распространенный тип аргументации сосредоточен прежде всего на обязанностях родителей по отношению к человеческому процветанию личности. Этот аргумент основан на идее о том, что родители обязаны и несут ответственность за обеспечение минимальных условий жизни для будущего ребенка.

Последняя категория аргументов – это те, которые подчеркивают важность появления в мире людей с ограниченными возможностями и расстройствами, принимая во внимание, какой вклад они могут внести в социально-экономический рост общества, предполагая, что эти люди не смогут внести свой вклад в улучшение статуса. кво и благополучие общества в целом.

Юридический статус

В Японии моногенное преимплантационное генетическое тестирование (ПГТ-М) стало темой ожесточенных дебатов среди людей, страдающих генетическими заболеваниями, с одной стороны, и феминистских групп и групп активистов по борьбе с инвалидностью - с другой. Как отмечает Кройдон, «потенциальные пациенты PGT-M, такие как люди репродуктивного возраста, страдающие инвалидностью, и их супруги... хотели воспользоваться преимуществами этой технологии», но они столкнулись с противодействием со стороны «групп, проводящих кампанию в защиту женщин и инвалидов». права людей, [которые] включают людей, которые рассматривают генетическое тестирование эмбрионов одним или всеми из следующих способов: 1) оно оказывает неоправданное давление на вовлеченных женщин, сообщая им, что им разрешено воспроизводить потомство только в том случае, если они приносят в мир здоровое потомство; 2) это усиливает существующее дискриминационное отношение в обществе к людям с ограниченными возможностями и 3) обход болезней посредством репродуктивного процесса снижает потребность научного сообщества в продолжении разработки методов лечения людей с ограниченными возможностями; в настоящее время живу с инвалидностью». В конечном счете, использование PGT-M остается ограничительным в Японии и неофициально регулируется Японским обществом акушерства и гинекологии (JSOG).

Интерсекс-черты

Основная статья: Генетическая диагностика интерсексуалов

ПГД допускает дискриминацию людей с интерсексуальными чертами. Джорджианн Дэвис утверждает, что такая дискриминация не учитывает тот факт, что многие люди с интерсексуальными чертами вели полноценную и счастливую жизнь. Морган Карпентер подчеркивает появление нескольких интерсексуальных вариаций в списке «серьезных» «генетических заболеваний», составленном Управлением по оплодотворению и эмбриологии человека , которые могут быть исключены в Великобритании, включая дефицит 5-альфа-редуктазы и синдром нечувствительности к андрогенам , признаки очевидны. в элитных спортсменках и «первом в мире мэре-интерсексуале ». Организация Intersex International Australia призвала Австралийский национальный совет по здравоохранению и медицинским исследованиям запретить подобные вмешательства, отметив «тесную взаимосвязь интерсекс-статуса, гендерной идентичности и сексуальной ориентации с социальным пониманием пола и гендерных норм, а также с медицинской и медицинской социологической литературой». ".

В 2015 году Совет Европы опубликовал Тематический доклад о правах человека и интерсексуалах , в котором отмечалось:

Право интерсексуалов на жизнь может быть нарушено в результате дискриминационного «выбора пола» и «преимплантационной генетической диагностики, других форм тестирования и отбора по определенным характеристикам». Такая отмена отбора или выборочные аборты несовместимы с этикой и стандартами прав человека из-за дискриминации, совершаемой в отношении интерсекс-людей на основании их половых характеристик.

Братья и сестры-спасители

ПГД в сочетании с сопоставлением HLA (человеческого лейкоцитарного антигена) позволяет парам выбирать эмбрионы, не затронутые генетическим заболеванием, в надежде спасти существующего больного ребенка. «Брат-спаситель» предположительно пожертвует спасительную ткань, совместимую с его/ее братом или сестрой. Некоторые специалисты по этике утверждают, что «братья и сестры-спасители», созданные в результате этой процедуры, будут рассматриваться как товар. Еще один аргумент против выбора «братьев и сестер-спасителей» заключается в том, что это приводит к появлению генетически модифицированных «дизайнерских детей». Этот аргумент вызывает дискуссию между моральным различием улучшения качеств и предотвращения болезней. Наконец, противники «братьев-спасителей» обеспокоены благополучием ребенка, главным образом тем, что эта процедура причинит ребенку эмоциональный и психологический вред.

В настоящее время в Соединенных Штатах не существует официальных правил или руководящих принципов. Этические решения относительно этой процедуры остаются на усмотрение поставщиков медицинских услуг и их пациентов. Напротив, использование ПГД в Великобритании регулируется Законом об оплодотворении и эмбриологии человека (HFEA), который требует, чтобы клиники, применяющие эту технику, получили лицензию и следовали строгим критериям.

Религиозные возражения

См. Также: Экстракорпоральное оплодотворение § Этика.

Некоторые религиозные организации не одобряют эту процедуру. Римско-католическая церковь, например, занимает позицию, согласно которой это предполагает уничтожение человеческой жизни. и кроме того, выступает против необходимого экстракорпорального оплодотворения яйцеклеток как противоречащего аристотелевским принципам природы. Ортодоксальный иудаизм, напротив, поддерживает ПГД.

Психологический фактор

Проведенный метаанализ показывает, что исследования, проведенные в области ПГД, подчеркивают будущие исследования. Это связано с положительными результатами опросов об отношении, последующими исследованиями после родов, которые не продемонстрировали существенных различий между теми, кто использовал ПГД, и теми, кто зачал естественным путем, а также этнографическими исследованиями, которые подтвердили, что те, у кого в анамнезе был негативный опыт, нашли ПГД как облегчение. Во-первых, в ходе опроса отношений женщины с историей бесплодия, прерывания беременности и повторных выкидышей сообщили о более позитивном отношении к преимплантационной генетической диагностике. Они более терпимо относились к проведению ПГД. Во-вторых, аналогично первому исследованию отношений, этнографическое исследование, проведенное в 2004 году, дало аналогичные результаты. Пары, у которых в анамнезе были множественные выкидыши, бесплодие и больной ребенок, считали, что преимплантационная генетическая диагностика является жизнеспособным вариантом. Они также почувствовали большее облегчение; «Те, кто использовал эту технологию, на самом деле были мотивированы не повторять потерю беременности». Таким образом, хотя некоторые из этих исследований ограничены из-за их ретроспективного характера и ограниченных выборок, результаты исследования указывают на общую удовлетворенность участников использованием ПГД. Тем не менее, авторы исследований указывают, что эти исследования подчеркивают необходимость будущих исследований, таких как создание перспективного проекта с действенной психологической шкалой, необходимой для оценки уровней стресса и настроения во время переноса и имплантации эмбриона.

Политика и законность

Канада

До принятия в 2004 году Закона о вспомогательной репродукции человека (AHR) ПГД в Канаде не регулировалась. Закон запретил выбор пола в немедицинских целях.

Из-за сокращения национального бюджета в 2012 году AHR был упразднен. Затем регулирование вспомогательной репродукции было делегировано каждой провинции. Эта делегация предоставляет провинциям большую свободу действий, чтобы они могли делать все, что им заблагорассудится. В результате такие провинции, как Квебек, Альберта и Манитоба, включили почти полную стоимость ЭКО в счет государственного здравоохранения. Доктор Сантьяго Мунне, разработчик первого ПГД-теста на синдром Дауна и основатель компании Reprogenetics, увидел в этих провинциальных решениях возможность для своей компании вырасти и открыть больше лабораторий репродуктивной генетики по всей Канаде. Он отверг все споры относительно младенцев из каталога и заявил, что у него нет проблем с идеальными младенцами.

Однако в Онтарио нет конкретных правил в отношении ПГД. С 2011 года Министерство по делам детей и молодежи Онтарио выступает за развитие финансируемого государством образования по вопросам безопасного зачатия, мониторинга эмбрионов и услуг вспомогательной репродукции для всех жителей Онтарио. Этот правительственный отчет показывает, что Онтарио не только имеет неопределенные правила в отношении услуг вспомогательной репродукции, таких как ЭКО и ПГД, но также не финансирует ни одну из этих услуг. Все существующие репродуктивные клиники являются частными и расположены только в Брэмптоне, Маркеме, Миссиссоге, Скарборо, Торонто, Лондоне и Оттаве. Напротив, такие провинции, как Альберта и Квебек, не только имеют больше клиник, но также имеют подробные законы, касающиеся вспомогательной репродукции и государственного финансирования этой практики.

Германия

До 2010 года использование ПГД находилось в «серой зоне» закона. В 2010 году Федеральный суд Германии постановил, что ПГД может использоваться в исключительных случаях. 7 июля 2011 года Бундестаг принял закон, разрешающий ПГД в определенных случаях. Эту процедуру можно использовать только в том случае, если существует большая вероятность того, что родители передадут генетическое заболевание, или когда существует высокая генетическая вероятность мертворождения или выкидыша. 1 февраля 2013 года Бундесрат утвердил правило, регулирующее практическое использование ПГД.

Венгрия

В Венгрии ПГД разрешена при тяжелых наследственных заболеваниях (когда генетический риск превышает 10%). Преимплантационная генетическая диагностика анеуплоидии (PGS/PGD-A) также является общепринятым методом. В настоящее время его рекомендуют в случае множественных выкидышей и/или нескольких неудачных процедур ЭКО и/или когда мать старше 35 лет. Несмотря на то, что ПГД-А является одобренным методом, он доступен только в одной клинике репродуктивной медицины в Венгрии.

Индия

В Индии Министерство здравоохранения и благосостояния семьи регулирует эту концепцию в соответствии с Законом о методах пренатальной диагностики 1994 года . После 1994 года Закон был дополнительно пересмотрен, и в него были внесены необходимые поправки, которые своевременно обновляются на официальном веб-сайте правительства Индии, посвященном этому делу. Использование ПГД для определения пола/выбора ребенка запрещено в Индии.

Мексика

По состоянию на 2006 год клиники Мексики на законных основаниях предоставляли услуги ПГД.

ЮАР

В Южной Африке, где право на репродуктивную свободу является конституционно защищенным правом, было предложено, чтобы государство могло ограничивать ПГД только в той степени, в которой родительский выбор может нанести вред будущему ребенку, или в той степени, в которой родительский выбор будет усиливать социальные предрассудки.

Украина

Преимплантационная генетическая диагностика разрешена в Украине и с 1 ноября 2013 года регламентируется приказом Министерства здравоохранения Украины "Об утверждении возможности применения вспомогательных репродуктивных технологий в Украине" от 09.09.2013 № 787.

Великобритания

В Великобритании вспомогательные репродуктивные технологии регулируются Законом об оплодотворении и эмбриологии человека (HFE) 2008 года. Однако Закон HFE не затрагивает вопросы, связанные с ПГД. Таким образом, в 2003 году было создано Управление HFE (HFEA) в качестве национального регулирующего органа, который выдает лицензии и контролирует клиники, предоставляющие ПГД. HFEA разрешает использование PGD только в том случае, если соответствующая клиника имеет лицензию HFEA и устанавливает правила такого лицензирования в своем Кодексе практики. Для каждой клиники и каждого заболевания требуется отдельное заявление, в котором HFEA проверяет пригодность предложенного генетического теста, а также навыки и возможности персонала клиники. Только в этом случае пациенту можно будет использовать ПГД.

HFEA строго запрещает выбор пола по социальным или культурным причинам, но позволяет избежать расстройств, связанных с полом. Они заявляют, что ПГД неприемлема для «социальных или психологических характеристик, нормальных физических отклонений или любых других состояний, которые не связаны с инвалидностью или серьезным заболеванием». Однако оно доступно для пар или отдельных лиц с известным семейным анамнезом серьезных генетических заболеваний. Тем не менее, HFEA рассматривает интерсексуальные вариации как «серьезное генетическое заболевание», такое как дефицит 5-альфа-редуктазы , черта, свойственная некоторым элитным спортсменкам. Защитники интерсексуалов утверждают, что такие решения основаны на социальных нормах пола и культурных причинах.

Соединенные Штаты

В Соединенных Штатах не существует единой системы регулирования вспомогательных репродуктивных технологий, включая генетическое тестирование. Практика и регулирование ПГД чаще всего подпадают под действие законов штата или профессиональных руководств, поскольку федеральное правительство не имеет прямой юрисдикции над медицинской практикой. На сегодняшний день ни один штат не ввел в действие законы, непосредственно относящиеся к ПГД, поэтому исследователям и врачам приходится соблюдать рекомендации, установленные профессиональными ассоциациями. Центры по контролю и профилактике заболеваний (CDC) заявляют, что все клиники, проводящие ЭКО, должны ежегодно сообщать федеральному правительству об успешности наступления беременности, но отчетность об использовании и результатах ПГД не требуется. Профессиональные организации, такие как Американское общество репродуктивной медицины (ASRM), предоставили ограниченные рекомендации по этическому использованию ПГД. Американское общество репродуктивной медицины (ASRM) заявляет, что «ПГД следует рассматривать как признанный метод со специфическим и расширяющимся применением в стандартной клинической практике». Они также заявляют: «Хотя использование ПГД с целью предотвращения заболеваний, связанных с полом, является этическим, использование ПГД исключительно для выбора пола не рекомендуется».

В 2024 году Верховный суд Алабамы постановил по влиятельному делу, что замороженные эмбрионы в пробирках следует считать детьми, тем самым поднимая сложные юридические вопросы, последствия которых для репродуктивной помощи выходят далеко за пределы Алабамы.

Испания

В Испании преимплантационную генетическую диагностику не разрешается проводить открыто и доступно для всех, чтобы избежать евгеники. Поэтому его легализуют только в случаях повышенного риска.

Существует три основных требования (за исключением исключений, разрешенных комитетами по биоэтике) для проведения преимплантационной генетической диагностики эмбриона. Все три должны быть соблюдены:

• Эмбрион может содержать заболевание с ранним началом. Если бы это было заболевание с поздним началом, такое как болезнь Альцгеймера, его нельзя было бы предотвратить с помощью преимплантационной диагностики.
• Обнаруженная болезнь в настоящее время неизлечима. Если бы это была серьезная, но излечимая болезнь, ее нельзя было бы предотвратить этим методом. Примером патологии, для которой в настоящее время не существует лечения, при которой можно применить преимплантационную диагностику, может служить ретинобластома, которая является аутосомно-рецессивным моногенным заболеванием.
• Что заболевание опасно для жизни или серьезно влияет на умственное или психомоторное развитие ребенка.

Любой тип заболевания, не отвечающий этим трем требованиям, должен пройти через комитет по биоэтике и быть одобрен им, прежде чем можно будет провести ПГД.

Законодательство началось поздно, через десять лет после рождения в Соединенном Королевстве Луизы Браун , первого человека, зачатого с помощью ЭКО.

Упоминания в популярной культуре

• PGD ​​занимает видное место в фильме 1997 года «Гаттака» . Действие фильма происходит в мире недалекого будущего, где ПГД/ЭКО является наиболее распространенной формой репродукции. В фильме родители обычно используют ПГД, чтобы выбрать желаемые черты для своих детей, такие как рост, цвет глаз и отсутствие даже малейшей генетической предрасположенности к болезням. Этические последствия ПГД исследуются через историю главного героя, который сталкивается с дискриминацией, поскольку был зачат без таких методов.
• ПГД упоминается в романе 2004 года «Хранитель моей сестры» персонажами , поскольку главная героиня, Анна Фицджеральд, была создана с помощью ПГД, чтобы генетически соответствовать ее APL- положительной сестре Кейт, чтобы она могла пожертвовать костный мозг при рождении, чтобы помочь Кейт бороться. АПЛ. В книге также упоминается, что ее родители подверглись критике за этот поступок.

Информация на сайтах клиник

В исследовании 135 клиник ЭКО 88% имели веб-сайты, 70% упоминали ПГД, 27% последних располагались на базе университетов или больниц, а 63% были частными клиниками. Сайты, упоминающие ПГД, также упоминают использование и преимущества ПГД гораздо чаще, чем связанные с ним риски. Из сайтов, упоминающих ПГД, 76% описывают тестирование на моногенные заболевания, но только 35% упоминают риски отсутствия целевого диагноза и только 18% упоминают риски потери эмбриона. 14% назвали ПГД новой или спорной. Частные клиники чаще, чем другие программы, перечисляли определенные риски ПГД, например, диагностические ошибки, или отмечали, что ПГД является новым или спорным, ссылались на источники информации ПГД, предоставляли показатели точности генетического тестирования эмбрионов и предлагали выбор пола по социальным причинам. .

См. также

• Биоэтика
• Дизайнерский малыш
• Картирование QTL на основе семейства
• Полигенный балл
• Сортировка спермы

Дальнейшее чтение

• Лоран Кристиан; Аскер Мельхиор Телье; Натан Роберт Трефф; Стивен Сюй; Луи Лелло; Эрик Виден (2023). « Научное опровержение заявления ESHG о выборе эмбрионов ». Европейский журнал генетики человека 31, 278 https://doi.org/10.1038/s41431-022-01237-0

Внешние ссылки

• Интервью с доктором Марком Хьюзом, пионером ПГД, о ПГД
• Отбор эмбрионов для интеллекта: анализ затрат и выгод предельных затрат на отбор эмбрионов на основе ЭКО по интеллекту и другим признакам с использованием самых современных технологий 2016-2017 гг.
• Преимплантационная генетическая диагностика и выбор пола: как это работает в Великобритании?
• Список заболеваний, проверяемых в Великобритании и имеющих лицензию HFEA
• Скрининг эмбрионов на наличие заболеваний Джо Палка @ NPR.org
• Изображения преимплантационной генетической диагностики. Изображения биопсии полярного тела и бластомера. Нормальные и аномальные изображения FISH.
• Кузен-Франкель, Дженнифер (22 марта 2022 г.). «Ученые говорят, что они могут прочитать почти весь геном эмбриона, созданного с помощью ЭКО» . Наука .