Аспартаткарбамоилтрансфераза
| Аспартаткарбамоилтрансфераза | |||
|---|---|---|---|
 Escherichia coli Гетерододекамера аспартаткарбамоилтрансферазы с каталитическими субъединицами, окрашенными в красный и синий цвета, и регуляторными субъединицами в оранжевый цвет. PDB : 4FYY | |||
| Идентификаторы | |||
| Номер ЕС. | 2.1.3.2 | ||
| Номер CAS. | 9012-49-1 | ||
| Базы данных | |||
| ИнтЭнк | вид IntEnz | ||
| БРЕНДА | БРЕНДА запись | ||
| Экспаси | Просмотр NiceZyme | ||
| КЕГГ | КЕГГ запись | ||
| МетаЦик | метаболический путь | ||
| ПРЯМОЙ | профиль | ||
| PDB Структуры | RCSB PDB PDBe PDBsum | ||
| Генная онтология | АмиГО / QuickGO | ||
| |||
| Карбамоилфосфатсинтетаза 2 человека, аспартаттранскарбамоилаза, дигидрооротаза | |||
|---|---|---|---|
| Идентификаторы | |||
| Символ | САПР | ||
| ген NCBI | 790 | ||
| HGNC | 1424 | ||
| МОЙ БОГ | 114010 | ||
| RefSeq | НМ_004341 | ||
| ЮниПрот | P27708 | ||
| Другие данные | |||
| Номер ЕС | 2.1.3.2 | ||
| Локус | Хр. 2 п22-п21 | ||
| |||
Аспартаткарбамоилтрансфераза (также известная как аспартаттранскарбамоилаза или АТКаза ) катализирует первый этап пути биосинтеза пиримидина ( EC 2.1.3.2 ). [1]
В E. coli фермент представляет собой многосубъединичный белковый комплекс , состоящий из 12 субъединиц (всего 300 кДа). [2] Состав субъединиц C 6 R 6 , образующий 2 тримера каталитических субъединиц (34 кДа) и 3 димера регуляторных субъединиц (17 кДа). Особое расположение каталитических и регуляторных субъединиц в этом ферменте обеспечивает комплексу сильно аллостерическое поведение по отношению к его субстратам. [3] Фермент является архетипическим примером аллостерической модуляции тонкого контроля метаболических ферментативных реакций.
ATCase не следует кинетике Михаэлиса-Ментен . Вместо этого оно находится между «напряженным» состоянием низкой активности и низкой аффинности и «расслабленным» состоянием высокой активности и высокой аффинности. [4] Связывание субстрата с каталитическими субъединицами приводит к сдвигу равновесия в сторону состояния R, тогда как связывание CTP с регуляторными субъединицами приводит к сдвигу равновесия в сторону состояния T. Связывание АТФ с регуляторными субъединицами приводит к сдвигу равновесия в сторону состояния R. [5]
Реакция
[ редактировать ]АТКаза представляет собой строго регулируемый фермент, который катализирует первую стадию биосинтеза пиримидинов, конденсацию L-аспартата и карбамоилфосфата с образованием N-карбамоил-L-аспартата и неорганического фосфата . Катализ АТКазой служит стадией, ограничивающей скорость биосинтеза пиримидинов, поскольку он изменяет его каталитическую скорость в ответ на клеточные уровни как пиримидинов , так и пуринов . Конечный продукт пиримидинового пути, CTP , снижает каталитическую скорость, тогда как АТФ , конечный продукт параллельного пуринового пути, увеличивает каталитическую скорость.
Структура
[ редактировать ]
Последующее обсуждение структуры, каталитического центра и аллостерического сайта основано на прокариотической версии АТКазы, в частности E. coli .
Ранние исследования показали, что АТКаза состоит из двух разных типов полипептидных цепей, которые выполняют разные роли. [7] Каталитические субъединицы катализируют карбамилирование аминогруппы аспартата , но не обладают регуляторными свойствами, тогда как регуляторные субъединицы не обладают каталитической активностью, но содержат регуляторные сайты для связывания эффекторов. АТКазы Голофермент состоит из двух каталитических тримеров, которые контактируют и удерживаются вместе тремя регуляторными димерами, поэтому нативная форма фермента содержит по шесть цепей каждого типа с общей молекулярной массой 310 кДа .
Каждый из каталитических доменов состоит из двух структурных доменов: аспартатного домена, который содержит большую часть остатков, ответственных за связывание аспартата , и карбамоилфосфатного домена, который содержит большую часть остатков, связывающихся с карбамоилфосфатом . Каждый регуляторный домен также состоит из двух доменов: аллостерического домена, который имеет сайт связывания для нуклеотидных эффекторов , и цинкового домена, состоящего из четырех цистеина остатков , сгруппированных в его С-концевой области. Эти остатки координируют атом цинка , который не участвует в каких-либо каталитических свойствах, но, как было показано, необходим для ассоциации регуляторных и каталитических субъединиц. [8]
Трехмерное расположение каталитических и регуляторных субъединиц предполагает несколько ионных и гидрофобных стабилизирующих контактов между аминокислотными остатками. [6] Каждая каталитическая цепь контактирует с тремя другими каталитическими цепями и двумя регуляторными цепями. Каждый регуляторный мономер контактирует с еще одной регуляторной цепью и двумя каталитическими цепями. В несвязанном ферменте два каталитических тримера также находятся в контакте.
Каталитический центр
[ редактировать ]Каталитический сайт АТКазы расположен на границе раздела двух соседних каталитических цепей в одном тримере и включает боковые цепи аминокислот обеих этих субъединиц. Понимание способа связывания субстратов с каталитическим центром АТКазы впервые стало возможным благодаря связыванию аналога бисубстрата, N-(фосфоноацетил)-L-аспартата (PALA). [9] Это соединение является сильным ингибитором АТКазы и имеет структуру, которая, как полагают, очень близка к структуре переходного состояния субстратов. [10] Кроме того, были получены кристаллические структуры АТКазы, связанной с карбамоилфосфатом и сукцинатом. [11] Эти исследования, в дополнение к исследованиям с использованием сайт-направленного мутагенеза конкретных аминокислот, выявили несколько остатков, которые имеют решающее значение для катализа, таких как Ser52, Thr53, Arg54, Thr55, Arg105, His134, Gln137, Arg167, Arg229, Glu231 и Ser80 и Lys84 из соседней каталитической цепи. Активный сайт представляет собой очень положительно заряженный карман. Одна из наиболее важных боковых цепей принадлежит Arg54, который взаимодействует с концевым кислородом и ангидридным кислородом карбамоилфосфата, стабилизируя отрицательный заряд уходящей фосфатной группы. Arg105, His134 и Thr55 помогают повысить электрофильность карбонильного углерода за счет взаимодействия с карбонильным кислородом. [7] В целом повышение скорости АТКазы достигается за счет ориентации и стабилизации субстратов, промежуточных продуктов и продуктов, а не за счет прямого участия аминокислотных остатков в каталитическом механизме.
Аллостерический сайт
[ редактировать ]Аллостерический сайт в аллостерическом домене R-цепей АТКазного комплекса связывается с нуклеотидами АТФ, CTP и/или UTP. В каждом регуляторном димере имеется один сайт с высоким сродством к АТФ и CTP и один с аффинностью к этим нуклеотидам в 10–20 раз меньшей. [7] АТФ связывается преимущественно с сайтами с высоким сродством и впоследствии активирует фермент, тогда как связывание UTP и CTP приводит к ингибированию активности. UTP может связываться с аллостерическим сайтом, но ингибирование АТКазы UTP возможно только в сочетании с CTP. При наличии CTP связывание UTP усиливается и преимущественно направляется на сайты с низким сродством. Напротив, связывание UTP приводит к усилению сродства к CTP в сайтах с высоким сродством, и вместе они ингибируют активность фермента до 95%, тогда как связывание CTP само по себе ингибирует активность на 50–70%. [3] Сравнение кристаллических структур Т- и R-форм АТКазы показывает, что при аллостерическом переходе она увеличивается в размерах, а каталитические субъединицы в ходе этого процесса конденсируются. Два каталитических тримера раздвигаются вдоль тройной оси на 12 Å и поворачиваются вокруг этой оси на 5° каждый, что в конечном итоге приводит к переориентации регуляторных субъединиц вокруг их двойной оси на 15°. [12] Это изменение четвертичной структуры связано с изменениями в межсубъединичных и междоменных взаимодействиях. Взаимодействие между субъединицами C1-C4 и R1 во время этого преобразования сильно изменяется. В частности, наблюдается большое перемещение аминокислотных остатков 230–254, известных под общим названием петля 240s. Эти остатки расположены в щели между карбамоилфосфатными и аспартатными доменами на границе раздела C1-C4. Общим результатом этих структурных изменений является то, что два домена каждой каталитической цепи сближаются, обеспечивая лучший контакт с субстратами или их аналогами .
Во время этого структурного перехода некоторые взаимодействия между боковыми цепями теряются и устанавливаются другие. Исследования подтвердили, что положение петли 240s напрямую влияет на связывание субстрата в соответствующем активном сайте. [13] Более ранние исследования с использованием сайт-направленного мутагенеза петли 240s показали, что взаимодействия между Asp271 и Tyr240, а также между Glu239 из C1 и Tyr165 из C4 стабилизируют Т-состояние, в то время как взаимодействия между Glu239 из C1 и Lys164 и Tyr165 из C4 стабилизируют R-состояние. [14]
Расположенная рядом с петлей 240s и активным центром область петли, охватывающая остатки 160–166, играет роль как во внутренней архитектуре фермента, так и в его регуляторных свойствах. [15] В частности, остаток Asp162 взаимодействует с Gln231 (известно, что он участвует в связывании аспартата) и связывает одни и те же остатки как в T, так и в R-состояниях. Мутант, у которого этот остаток мутировал на аланин, показал огромное снижение удельной активности, двукратное снижение сродства к аспартату , потерю гомотропной кооперативности и снижение активации АТФ . Было высказано предположение, что изменение общей структуры, вызванное введением этого остатка, влияет на другие остатки в интерфейсах R1-C1, R1-C4 и C1-C4, которые участвуют в переходе четвертичной структуры . [16]
Сборка комплекса
[ редактировать ]Регуляторные и каталитические субъединицы существуют в виде слитых белковых гомологов, что дает убедительные доказательства того, что они будут взаимодействовать друг с другом. [17] Два каталитических тримера и два регуляторных димера собираются с образованием промежуточного продукта аспартаткарбамоилтрансферазы, состоящего из 6 каталитических субъединиц и 4 регуляторных субъединиц. [18]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Симмер Дж.П., Келли Р.Э., Ринкер А.Г., Циммерманн Б.Х., Скалли Дж.Л., Ким Х., Эванс Д.Р. (январь 1990 г.). «Дигидрооротаза млекопитающих: нуклеотидная последовательность, пептидные последовательности и эволюция дигидрооротазного домена многофункционального белка CAD» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 87 (1): 174–8. Бибкод : 1990PNAS...87..174S . дои : 10.1073/pnas.87.1.174 . ПМЦ 53223 . ПМИД 1967494 .
- ^ Макол С.П., Цурута Х., Стек Б., Кантровитц Э.Р. (май 2001 г.). «Прямые структурные доказательства согласованного аллостерического перехода в аспартат-транскарбамоилазе Escherichia coli». Структурная биология природы . 8 (5): 423–6. дои : 10.1038/87582 . ПМИД 11323717 . S2CID 35403933 .
- ^ Jump up to: а б Хельмштадт К., Краппманн С., Браус Г.Х. (сентябрь 2001 г.). «Аллостерическая регуляция каталитической активности: аспартат-транскарбамоилаза Escherichia coli по сравнению с хоризматмутазой дрожжей» . Обзоры микробиологии и молекулярной биологии . 65 (3): 404–21, оглавление. дои : 10.1128/MMBR.65.3.404-421.2001 . ПМК 99034 . ПМИД 11528003 .
- ^ Биохимия, Кэмпбелл и Фаррел, Глава 7.
- ^ Альбертс, Брюс, автор. Молекулярная биология клетки . ISBN 978-1-315-73536-8 . OCLC 1082214404 .
{{cite book}}:|last=имеет общее имя ( справка ) CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ) - ^ Jump up to: а б Ке Х.М., Гонзатко Р.Б., Липскомб В.Н. (июль 1984 г.). «Структура нелигированной аспартаткарбамоилтрансферазы Escherichia coli с разрешением 2,6 Å» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 81 (13): 4037–40. дои : 10.1073/pnas.81.13.4037 . ПМЦ 345363 . ПМИД 6377306 .
- ^ Jump up to: а б с Липскомб В.Н. (1994). «Аспартат-транскарбамилаза из Escherichia coli: активность и регуляция». Достижения энзимологии и смежных областей молекулярной биологии . Достижения в энзимологии и смежных областях молекулярной биологии. Том. 68. стр. 67–151. дои : 10.1002/9780470123140.ch3 . ISBN 9780470123140 . ПМИД 8154326 .
- ^ Кантровитц Э.Р., Липскомб В.Н. (август 1988 г.). «Аспартаттранскарбамилаза Escherichia coli: связь между структурой и функцией». Наука . 241 (4866): 669–74. Бибкод : 1988Sci...241..669K . дои : 10.1126/science.3041592 . ПМИД 3041592 .
- ^ Краузе К.Л., Фольц К.В., Липскомб В.Н. (февраль 1987 г.). «2.5 Структура аспартаткарбамоилтрансферазы в комплексе с аналогом бисубстрата N-(фосфонацетил)-L-аспартатом». Журнал молекулярной биологии . 193 (3): 527–53. дои : 10.1016/0022-2836(87)90265-8 . ПМИД 3586030 .
- ^ Ван Дж., Штиглиц К.А., Кардия Дж.П., Кантровитц Э.Р. (июнь 2005 г.). «Структурная основа упорядоченного связывания субстратов и кооперативности в аспартат-транскарбамоилазе» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 102 (25): 8881–6. Бибкод : 2005PNAS..102.8881W . дои : 10.1073/pnas.0503742102 . ПМК 1157055 . ПМИД 15951418 .
- ^ Гуо Дж. Э., Липскомб В. Н. (июнь 1988 г.). «Трехмерная структура карбамоилфосфата и сукцината, связанных с аспартаткарбамоилтрансферазой» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 85 (12): 4205–8. Бибкод : 1988PNAS...85.4205G . дои : 10.1073/pnas.85.12.4205 . ПМК 280395 . ПМИД 3380787 .
- ^ Кантровитц Э.Р., Липскомб В.Н. (февраль 1990 г.). «Аспартат-транскарбамоилаза Escherichia coli: молекулярная основа согласованного аллостерического перехода». Тенденции биохимических наук . 15 (2): 53–9. дои : 10.1016/0968-0004(90)90176-C . ПМИД 2186515 .
- ^ Фетлер Л., Вашетт П., Эрве Г., Ладжими М.М. (декабрь 1995 г.). «В отличие от перехода четвертичной структуры, изменение третичной структуры петли 240s в аллостерической аспартаттранскарбамилазе требует для завершения насыщения активного центра субстратом». Биохимия . 34 (48): 15654–60. дои : 10.1021/bi00048a008 . ПМИД 7495794 .
- ^ Миддлтон С.А., Кантровитц Э.Р. (август 1986 г.). «Важность петли остатков 230–245 в аллостерических взаимодействиях аспартаткарбамоилтрансферазы Escherichia coli» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 83 (16): 5866–70. Бибкод : 1986PNAS...83.5866M . дои : 10.1073/pnas.83.16.5866 . ПМЦ 386397 . ПМИД 3526342 .
- ^ Ньютон С.Дж., Стивенс Р.К., Кантровитц Э.Р. (март 1992 г.). «Важность консервативного остатка аспартата-162 для функции аспартаттранскарбамоилазы Escherichia coli». Биохимия . 31 (11): 3026–32. дои : 10.1021/bi00126a026 . ПМИД 1550826 .
- ^ Фетлер Л., Таук П., Бейкер Д.П., Макол С.П., Кантровитц Э.Р., Вачетт П. (май 2002 г.). «Замена Asp-162 на Ala предотвращает кооперативный переход субстратов, одновременно усиливая эффект аллостерического активатора АТФ на аспартат-транскарбамоилазу E. coli» . Белковая наука . 11 (5): 1074–81. дои : 10.1110/ps.4500102 . ПМК 2373563 . ПМИД 11967364 .
- ^ Марш Х.А., Эрнандес Х., Холл З., Анерт С.Е., Перика Т., Робинсон К.В., Тейхманн С.А. (апрель 2013 г.). «Белковые комплексы подвергаются эволюционному отбору, чтобы собраться упорядоченными путями» . Клетка . 153 (2): 461–470. дои : 10.1016/j.cell.2013.02.044 . ПМК 4009401 . ПМИД 23582331 .
- ^ Эванс Д.Р., Пастра-Лэндис СК, Липскомб В.Н. (апрель 1974 г.). «Промежуточный комплекс диссоциации аспартаттранскарбамилазы» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 71 (4): 1351–5. Бибкод : 1974PNAS...71.1351E . дои : 10.1073/pnas.71.4.1351 . ПМК 388226 . ПМИД 4598300 .
Внешние ссылки
[ редактировать ]- Аспартат + карбамоилтрансфераза Национальной медицинской библиотеки США по медицинским предметным рубрикам (MeSH)
