✖


Jump to content

Конфокальная микроскопия

Конфокальная микроскопия
МеШ Д018613
Код ОПС-301 3-301
Продолжительность: 2 минуты 42 секунды. Доступны субтитры.
Принцип действия флуоресцентных и конфокальных микроскопов

Конфокальная микроскопия , чаще всего сканирующая микроскопия ( CLSM ) или лазерная сканирующая конфокальная микроскопия ( LSCM ), представляет собой метод оптической визуализации для увеличения оптического разрешения и контрастности микрофотографии конфокальная лазерная посредством использования пространственного отверстия для блокировки нефокусного света. в формировании имиджа. [1] Захват нескольких двумерных изображений на разной глубине в образце позволяет реконструировать трехмерные структуры (процесс, известный как оптическое разрезание ) внутри объекта. Этот метод широко используется в научных и промышленных кругах, а типичными применениями являются науки о жизни , контроль полупроводников и материаловедение .

Свет проходит через образец под обычным микроскопом настолько глубоко, насколько это возможно, в то время как конфокальный микроскоп фокусирует только меньший луч света на одном узком уровне глубины за раз. CLSM обеспечивает контролируемую и сильно ограниченную глубину резкости.

Основная концепция

[ редактировать ]
Принцип конфокального точечного датчика из патента Мински
Слитый белок GFP экспрессируется в Nicotiana benthamiana . Флуоресценция видна с помощью конфокальной микроскопии.

Принцип конфокальной визуализации был запатентован в 1957 году Марвином Мински. [2] и направлен на преодоление некоторых ограничений традиционных флуоресцентных микроскопов с широким полем зрения . [3] В обычном (т.е. широкопольном) флуоресцентном микроскопе весь образец равномерно освещается светом от источника света. Все части образца могут быть возбуждены одновременно, и возникающая в результате флуоресценция микроскопа, регистрируется фотодетектором или камерой включая большую несфокусированную фоновую часть. Напротив, конфокальный микроскоп использует точечное освещение (см. « Функция распространения точки ») и точечное отверстие в оптически сопряженной плоскости перед детектором для устранения сигнала вне фокуса - название «конфокальный» происходит от этой конфигурации. Поскольку можно обнаружить только свет, создаваемый флуоресценцией очень близко к фокальной плоскости изображения , оптическое разрешение , особенно в направлении глубины образца, намного лучше, чем у широкоугольных микроскопов. Однако, поскольку большая часть света флуоресценции образца блокируется в точечном отверстии, такое повышенное разрешение достигается за счет снижения интенсивности сигнала, поэтому длительные экспозиции часто требуются . Чтобы компенсировать это падение сигнала после пинхол , интенсивность света обнаруживается чувствительным детектором, обычно фотоумножителем ( ФЭУ) или лавинным фотодиодом , преобразующим световой сигнал в электрический. [4]

Поскольку одновременно освещается только одна точка образца, двухмерное или трехмерное изображение требует сканирования обычного растра (т. е. прямоугольного рисунка из параллельных линий сканирования) в образце. Луч сканируется по образцу в горизонтальной плоскости с помощью одного или нескольких ( сервоуправляемых ) колеблющихся зеркал. Этот метод сканирования обычно имеет низкую задержку реакции , а скорость сканирования можно изменять. Более медленное сканирование обеспечивает лучшее соотношение сигнал/шум , что приводит к лучшей контрастности .

Достижимая толщина фокальной плоскости определяется главным образом длиной волны используемого света, деленной на апертуру объектива числовую , а также оптическими свойствами образца. Возможность получения тонких оптических срезов делает эти типы микроскопов особенно эффективными при 3D-визуализации и профилировании поверхности образцов.

Последовательные срезы составляют «z-стек», который можно либо обработать для создания 3D-изображения, либо объединить в 2D-стек (преимущественно берется максимальная интенсивность пикселей, другие распространенные методы включают использование стандартного отклонения или суммирование пикселей). [1]

Конфокальная микроскопия обеспечивает возможность прямого, неинвазивного, серийного оптического разделения неповрежденных, толстых, живых образцов с минимальной пробоподготовкой, а также незначительное улучшение латерального разрешения по сравнению с широкопольной микроскопией. [4] Биологические образцы часто обрабатывают флуоресцентными красителями, чтобы сделать отдельные объекты видимыми. Однако фактическая концентрация красителя может быть низкой, чтобы свести к минимуму нарушение биологических систем: некоторые инструменты могут отслеживать отдельные флуоресцентные молекулы. Кроме того, с помощью трансгенных методов можно создавать организмы, которые производят свои собственные флуоресцентные химерные молекулы (например, слияние GFP, зеленого флуоресцентного белка с интересующим белком). Конфокальные микроскопы работают по принципу точечного возбуждения в образце (пятно, ограниченное дифракцией) и точечного обнаружения результирующего флуоресцентного сигнала. Отверстие в детекторе обеспечивает физический барьер, блокирующий флуоресценцию вне фокуса. только фокус, или центральное пятно диска Эйри Записывается .

Методы, используемые для горизонтального сканирования

[ редактировать ]
На этой проекции нескольких конфокальных изображений, полученных в лаборатории световой микроскопии EMBL , показана группа диатомовых водорослей с голубыми клеточными стенками, красными хлоропластами, синей ДНК и зелеными мембранами и органеллами.

В продаже имеются четыре типа конфокальных микроскопов:

В конфокальных лазерных сканирующих микроскопах используется несколько зеркал (обычно 2 или 3, сканирующих линейно вдоль осей X и Y) для сканирования лазером по образцу и «десканирования» изображения через фиксированное отверстие и детектор. Этот процесс обычно медленный и не работает для изображений в реальном времени, но может быть полезен для создания репрезентативных изображений фиксированных образцов с высоким разрешением.

Конфокальные микроскопы с вращающимся диском ( диск Нипкова ) используют серию движущихся отверстий на диске для сканирования световых пятен. Поскольку ряд точечных отверстий сканирует область параллельно, каждому точечному отверстию разрешено зависать над определенной областью в течение более длительного периода времени, тем самым уменьшая энергию возбуждения, необходимую для освещения образца, по сравнению с лазерными сканирующими микроскопами. Снижение энергии возбуждения снижает фототоксичность и фотообесцвечивание образца, что часто делает его предпочтительной системой для визуализации живых клеток или организмов.

Конфокальные микроскопы с улучшенными микролинзами или с двойным вращающимся диском работают по тем же принципам, что и конфокальные микроскопы с вращающимся диском, за исключением того, что второй вращающийся диск, содержащий микролинзы, помещается перед вращающимся диском, содержащим точечные отверстия. Каждому точечному отверстию соответствует соответствующая микролинза. Микролинзы улавливают широкую полосу света и фокусируют ее в каждом точечном отверстии, значительно увеличивая количество света, направляемого в каждое точечное отверстие, и уменьшая количество света, блокируемого вращающимся диском. Таким образом, конфокальные микроскопы с микролинзами значительно более чувствительны, чем стандартные системы с вращающимся диском. Yokogawa Electric изобрела эту технологию в 1992 году. [5]

В программируемых матричных микроскопах (PAM) используется пространственный модулятор света (SLM) с электронным управлением, который создает набор движущихся точечных отверстий. SLM — это устройство, содержащее массив пикселей с некоторыми свойствами ( непрозрачностью , отражательной способностью или оптическим вращением ) отдельных пикселей, которые можно регулировать электронным способом. SLM содержит микроэлектромеханические зеркала или жидкокристаллические компоненты. Изображение обычно получается камерой с зарядовой связью (CCD).

Каждый из этих классов конфокальных микроскопов имеет свои преимущества и недостатки. Большинство систем оптимизированы либо для скорости записи (т. е. захвата видео), либо для высокого пространственного разрешения. Конфокальные лазерные сканирующие микроскопы могут иметь программируемую плотность выборки и очень высокое разрешение, в то время как Nipkow и PAM используют фиксированную плотность выборки, определяемую разрешением камеры. изображения Частота кадров обычно ниже для систем одноточечного лазерного сканирования, чем для систем с вращающимся диском или PAM. Коммерческие конфокальные микроскопы с вращающимся диском достигают частоты кадров более 50 в секунду. [6] – желательная функция для динамических наблюдений, таких как визуализация живых клеток.

На практике Нипков и PAM позволяют нескольким точечным отверстиям сканировать одну и ту же область параллельно. [7] при условии, что отверстия находятся достаточно далеко друг от друга.

Передовые разработки в области конфокальной лазерной сканирующей микроскопии теперь позволяют получать изображения со скоростью видеосъемки, превышающей стандартную (60 кадров в секунду), за счет использования нескольких микроэлектромеханических сканирующих зеркал.

Конфокальная рентгеновская флуоресцентная визуализация — это новый метод, который позволяет контролировать глубину в дополнение к горизонтальному и вертикальному наведению, например, при анализе скрытых слоев на картине. [8]

Повышение разрешения

[ редактировать ]

CLSM — это метод сканирования изображений, полученное разрешение которого лучше всего объяснить путем сравнения его с другим методом сканирования, например, с использованием сканирующего электронного микроскопа (SEM). Преимущество CLSM заключается в том, что не требуется подвешивать датчик на расстоянии нанометра от поверхности, как, например, в AFM или STM , где изображение получается путем сканирования тонкой иглой по поверхности. Расстояние от объектива до поверхности (называемое рабочим расстоянием ) обычно сравнимо с расстоянием обычного оптического микроскопа. Оно зависит от оптической конструкции системы, но типично рабочее расстояние от сотен микрометров до нескольких миллиметров.

В CLSM образец освещается точечным лазерным источником, и каждому элементу объема соответствует дискретная интенсивность рассеяния или флуоресценции. Здесь размер объема сканирования определяется размером пятна (близкого к дифракционному пределу) оптической системы, поскольку изображение сканирующего лазера представляет собой не бесконечно малую точку, а трехмерную дифракционную картину. Размер этой дифракционной картины и определяемый ею фокальный объем контролируются числовой апертурой объектива системы и длиной волны используемого лазера. Это можно рассматривать как классический предел разрешения обычных оптических микроскопов, использующих широкоугольное освещение. Однако с помощью конфокальной микроскопии можно даже улучшить предел разрешения методов широкопольного освещения, поскольку конфокальную апертуру можно закрыть, чтобы исключить более высокие порядки дифракционной картины. [ нужна ссылка ] . Например, если диаметр точечного отверстия установлен на 1 единицу Эйри , то только первый порядок дифракционной картины проходит через апертуру детектора, в то время как более высокие порядки блокируются, что улучшает разрешение за счет небольшого уменьшения яркости. При флуоресцентных наблюдениях предел разрешения конфокальной микроскопии часто ограничивается соотношением сигнал/шум, вызванным небольшим количеством фотонов, обычно доступных во флуоресцентной микроскопии. Компенсировать этот эффект можно применением более чувствительных фотоприемников или увеличением интенсивности освещающего точечного лазерного источника. Увеличение интенсивности лазерного освещения может привести к чрезмерному обесцвечиванию или другому повреждению интересующего образца, особенно для экспериментов, в которых требуется сравнение яркости флуоресценции. При визуализации тканей с дифференциальной рефракцией, таких как губчатый мезофилл листьев растений или других тканей, содержащих воздушное пространство, часто возникают сферические аберрации, ухудшающие качество конфокального изображения. Однако такие аберрации можно значительно уменьшить, помещая образцы в оптически прозрачные, нетоксичные перфторуглероды, такие как перфтордекалин , который легко проникает в ткани и имеет показатель преломления, почти идентичный показателю преломления воды. [9] При визуализации в геометрии отражения также можно обнаружить интерференцию отраженного и рассеянного света объекта, например внутриклеточной органеллы. Интерферометрическая природа сигнала позволяет уменьшить диаметр точечного отверстия до 0,2 единиц Эйри и, следовательно, обеспечивает идеальное повышение разрешения на √2 без ущерба для соотношения сигнал/шум, как в конфокальной флуоресцентной микроскопии. [10]

Использование

[ редактировать ]

CLSM широко используется в различных биологических дисциплинах, от клеточной биологии и генетики до микробиологии и биологии развития . [11] Он также используется в квантовой оптике, визуализации нанокристаллов и спектроскопии.

Биология и медицина

[ редактировать ]
Пример стопки изображений конфокального микроскопа, показывающих распределение актиновых нитей по клетке.

Клинически CLSM используется при оценке различных заболеваний глаз и особенно полезен для визуализации, качественного анализа и количественного определения эндотелиальных клеток роговицы . [12] Он используется для локализации и выявления присутствия нитевидных грибковых элементов в строме роговицы при кератомикозе , что позволяет быстро поставить диагноз и, тем самым, на раннем этапе назначить окончательную терапию. исследования методов CLSM для эндоскопических процедур ( эндомикроскопии ). Многообещающими также являются [13] В фармацевтической промышленности рекомендовано следить за процессом изготовления тонкопленочных лекарственных форм, контролировать качество и равномерность распределения лекарств. [14] Конфокальную микроскопию применяют также для изучения биопленок — сложных пористых структур, которые являются предпочтительной средой обитания микроорганизмов. Некоторые временные и пространственные функции биопленок можно понять только путем изучения их структуры на микро- и мезо-масштабах. Исследование на микроуровне необходимо для выявления активности и организации одиночных микроорганизмов. [15]

Оптика и кристаллография

[ редактировать ]

CLSM используется в качестве механизма поиска данных в некоторых системах хранения оптических 3D-данных и помог определить возраст папируса Магдалины .

Сохранение аудио

[ редактировать ]

Система IRENE использует конфокальную микроскопию для оптического сканирования и восстановления поврежденных исторических аудиозаписей. [16]

Характеристика поверхности материала

[ редактировать ]

Лазерные сканирующие конфокальные микроскопы используются для исследования поверхности микроструктурированных материалов, таких как кремниевые пластины, используемые при производстве солнечных элементов . На первых этапах обработки пластины подвергаются мокрому химическому травлению кислотными или щелочными соединениями, придающими текстуру их поверхности. Затем с помощью лазерной конфокальной микроскопии наблюдают за состоянием полученной поверхности на рычаге микрометра. Лазерную конфокальную микроскопию также можно использовать для анализа толщины и высоты пальцев металлизации, напечатанных на верхней части солнечных элементов.

Варианты и улучшения

[ редактировать ]

Улучшение осевого разрешения

[ редактировать ]

Функция рассеяния точки точечного отверстия представляет собой эллипсоид, длина которого в несколько раз превышает его ширину. Это ограничивает осевое разрешение микроскопа. Одним из методов решения этой проблемы является микроскопия 4Pi, при которой падающий и/или излучаемый свет может интерферировать как сверху, так и снизу образца, чтобы уменьшить объем эллипсоида. Альтернативный метод — конфокальная тета-микроскопия . В этом методе конус освещающего света и обнаруженный свет располагаются под углом друг к другу (лучшие результаты, когда они перпендикулярны). Пересечение двух точечных функций распределения дает гораздо меньший эффективный объем выборки. В результате появился микроскоп с одноплоскостным освещением . Кроме того, деконволюцию можно использовать с использованием экспериментально полученной функции рассеяния точки для удаления не сфокусированного света, улучшая контраст как в осевой, так и в боковой плоскостях.

Супер разрешение

[ редактировать ]

Существуют конфокальные варианты, которые достигают разрешения ниже дифракционного предела, такие как микроскопия истощения стимулированного излучения (STED). широкий спектр других (не конфокальных) методов сверхразрешения, Помимо этого метода, доступен таких как PALM, (d)STORM , SIM и так далее. Все они имеют свои преимущества, такие как простота использования, разрешение и необходимость специального оборудования, буферов или флуорофоров.

Низкотемпературная работоспособность

[ редактировать ]

Для изображения образцов при низких температурах использовались два основных подхода, оба основанные на архитектуре лазерной сканирующей конфокальной микроскопии . Один из подходов заключается в использовании криостата непрерывного потока : только образец находится при низкой температуре и оптически обрабатывается через прозрачное окно. [17] Другой возможный подход — поместить часть оптики (особенно объектива микроскопа) в криогенный дьюар для хранения . [18] Этот второй подход, хотя и более громоздкий, гарантирует лучшую механическую стабильность и позволяет избежать потерь из-за окна.

Молекулярное взаимодействие

[ редактировать ]

Для изучения молекулярных взаимодействий с использованием CLSM можно использовать резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET), чтобы подтвердить, что два белка находятся на определенном расстоянии друг от друга.

Изображения

[ редактировать ]
  • β-тубулин у Tetrahymena (реснитчатого простейшего).
    β-тубулин у Tetrahymena (реснитчатое простейшее ).
  • Частичный профиль поверхности монеты номиналом 1 евро, измеренный с помощью дискового конфокального микроскопа Нипкова.
    Частичный профиль поверхности монеты номиналом 1 евро, измеренный с помощью дискового конфокального микроскопа Нипкова.
  • Данные отражения для монеты номиналом 1 евро.
    Данные отражения для монеты номиналом 1 евро.
  • Цветное изображение актиновых нитей в раковой клетке.
    Цветное изображение актиновых нитей в раковой клетке.
  • Зеленый сигнал от антитубулинового антитела, конъюгированного с Alexa Fluor 488) и ядер (синий сигнал от ДНК, окрашенной DAPI) в клетках корневой меристемы 4-дневного Arabidopsis thaliana (Col-0). Масштабная линейка: 5 мкм.
    Зеленый сигнал от антитубулинового антитела , конъюгированного с Alexa Fluor 488) и ядер (синий сигнал от ДНК, окрашенной DAPI) в клетках корневой меристемы 4-дневного Arabidopsis thaliana (Col-0). Масштабная линейка: 5 мкм.

История

[ редактировать ]

Начало: 1940–1957 гг.

[ редактировать ]
Схема из патентной заявки Мински, показывающая принцип построенного им просвечивающего конфокального сканирующего микроскопа.

В 1940 году Ганс Гольдманн, офтальмолог из Берна , Швейцария, разработал систему щелевой лампы для документирования осмотров глаз. [19] Эту систему некоторые более поздние авторы считают первой конфокальной оптической системой. [20] [21]

В 1943 году Зюн Коана опубликовал конфокальную систему. [22] [20]

В 1951 году Хирото Наора, коллега Коана, описал в журнале Science конфокальный микроскоп для спектрофотометрии . [23]

Первый конфокальный сканирующий микроскоп был построен Марвином Мински в 1955 году, а патент был подан в 1957 году. Сканирование точки освещения в фокальной плоскости достигалось за счет перемещения предметного столика. Ни одной научной публикации представлено не было, и никаких изображений, сделанных с ее помощью, не сохранилось. [2] [24]

Тандемный сканирующий микроскоп

[ редактировать ]
Схема тандемного сканирующего микроскопа Петрана. Добавлена ​​красная полоса для обозначения диска Нипкова.

В 1960-х годах чехословацкий Моймир Петрань с медицинского факультета Карлова университета в Пльзене разработал тандемный сканирующий микроскоп, первый коммерческий конфокальный микроскоп. Он продавался небольшой компанией в Чехословакии и в США компанией Tracor-Northern (позже Noran) и использовал вращающийся диск Нипкова для создания множества точечных отверстий возбуждения и излучения. [21] [25]

Чехословацкий патент был подан в 1966 году Петраном и Миланом Хадравским, чехословацким коллегой. Первая научная публикация с данными и изображениями, полученными с помощью этого микроскопа, была опубликована в журнале Science в 1967 году под авторством М. Дэвида Эггера из Йельского университета и Петрана. [26] В примечании к этой статье упоминается, что Петрань спроектировал микроскоп и руководил его конструкцией, а также что он частично был «научным сотрудником» в Йельском университете. Во второй публикации 1968 года описывалась теория и технические детали прибора, а дополнительными авторами были Хадравский и Роберт Галамбос , руководитель группы в Йельском университете. [27] В 1970 году был получен патент США. Оно было подано в 1967 году. [28]

1969: Первый конфокальный лазерный сканирующий микроскоп.

[ редактировать ]

В 1969 и 1971 годах М. Дэвид Эггер и Пол Давидовиц из Йельского университета опубликовали две статьи, описывающие первый конфокальный лазерный сканирующий микроскоп. [29] [30] Это был точечный сканер, то есть генерировалось только одно пятно освещения. Для наблюдения за нервной тканью использовалась микроскопия с отражением эпи-освещения. Гелий-неоновый лазер мощностью 5 мВт и длиной волны 633 нм отражался полупрозрачным зеркалом в сторону объектива. Объектив представлял собой простую линзу с фокусным расстоянием 8,5 мм. В отличие от всех более ранних и большинства более поздних систем, образец сканировался движением этой линзы (объективное сканирование), приводящим к перемещению точки фокуса. Отраженный свет возвращался к полупрозрачному зеркалу, прошедшая часть фокусировалась другой линзой на детектирующем отверстии, за которым располагался фотоумножитель. Сигнал визуализировался ЭЛТ осциллографа , катодный луч перемещался одновременно с объективом. Специальное устройство позволило сделать фотографии Polaroid , три из которых были показаны в публикации 1971 года.

Авторы размышляют о флуоресцентных красителях для исследований in vivo . Они ссылаются на патент Мински, благодаря Стиву Баеру, в то время аспиранту Медицинской школы Альберта Эйнштейна в Нью-Йорке , где он разработал конфокальный линейный сканирующий микроскоп. [31] за предложение использовать лазер с «микроскопом Минского» и поблагодарить Галамбоса, Хадравского и Петрана за обсуждения, приведшие к разработке их микроскопа. Мотивацией для их разработки было то, что в тандемном сканирующем микроскопе только часть 10 −7 свет освещения участвует в формировании изображения в окуляре. Таким образом, качество изображения было недостаточным для большинства биологических исследований. [20] [32]

1977–1985: Точечные сканеры с лазерами и сценическое сканирование.

[ редактировать ]

В 1977 году Колин Дж. Р. Шеппард и Амарджиоти Чоудхури из Оксфорда , Великобритания, опубликовали теоретический анализ конфокальных и лазерных сканирующих микроскопов. [33] Вероятно, это первая публикация, в которой используется термин «конфокальный микроскоп». [20] [32]

В 1978 году братья Кристоф Кремер и Томас Кремер опубликовали конструкцию конфокального лазерного сканирующего микроскопа, использующего флуоресцентное возбуждение с электронной автофокусировкой. Они также предложили лазерную подсветку точек с использованием «4π-точечной голограммы ». [32] [34] объединила метод лазерного сканирования с 3D-обнаружением биологических объектов, меченных флуоресцентными маркерами Эта конструкция CLSM впервые .

В 1978 и 1980 годах Оксфордская группа во главе с Колином Шеппардом и Тони Уилсоном описала конфокальный микроскоп с эпилазерной подсветкой, предметным сканированием и фотоумножителями в качестве детекторов. Платформа могла перемещаться вдоль оптической оси (ось Z), позволяя получать последовательные оптические срезы. [32]

В 1979 году Фред Бракенхофф и его коллеги продемонстрировали, что теоретические преимущества оптического секционирования и улучшения разрешения действительно достижимы на практике. В 1985 году эта группа стала первой, кто опубликовал убедительные изображения, полученные с помощью конфокального микроскопа и способные ответить на биологические вопросы. [35] Вскоре после этого многие другие группы начали использовать конфокальную микроскопию для ответа на научные вопросы, которые до этого оставались загадкой из-за технологических ограничений.

В 1983 году И. Дж. Кокс и К. Шеппард из Оксфорда опубликовали первую работу, в которой конфокальный микроскоп управлялся компьютером. Первый коммерческий лазерный сканирующий микроскоп, столик-сканер SOM-25, был предложен Oxford Optoelectronics (после нескольких поглощений, приобретенных BioRad), начиная с 1982 года. Он был основан на разработке Оксфордской группы. [21] [36]

Начиная с 1985 г.: лазерные точечные сканеры с лучевым сканированием.

[ редактировать ]

В середине 1980-х годов Уильям Брэдшоу Амос и Джон Грэм Уайт и их коллеги, работавшие в Лаборатории молекулярной биологии в Кембридже, построили первый сканирующий конфокальный лучевой микроскоп. [37] [38] Столик с образцом не двигался, вместо него двигалось пятно освещения, что позволяло быстрее получать изображения: четыре изображения в секунду по 512 строк каждое. Чрезвычайно увеличенные промежуточные изображения благодаря длине пути луча 1–2 метра позволили использовать обычную ирисовую диафрагму в качестве «обскуры» диаметром ~ 1 мм. Первые микрофотографии были сделаны с длительной экспозицией на пленку до того, как была добавлена ​​цифровая камера. Дальнейшее усовершенствование позволило впервые приблизиться к подготовке. Zeiss , Leitz и Cambridge Instruments не были заинтересованы в коммерческом производстве. [39] Совет медицинских исследований (MRC) наконец спонсировал разработку прототипа. Конструкция была приобретена Bio-Rad , дополнена компьютерным управлением и коммерциализирована как «MRC 500». Преемник MRC 600 позже стал основой для разработки первого двухфотонного флуоресцентного микроскопа, разработанного в 1990 году в Корнельском университете . [35]

Примерно в то же время разработки в Королевском технологическом институте KTH в Стокгольме привели к созданию коммерческого CLSM, распространяемого шведской компанией Sarastro. [40] Предприятие было приобретено в 1990 году компанией Molecular Dynamics. [41] но в конечном итоге производство CLSM было прекращено. В Германии компания Heidelberg Instruments , основанная в 1984 году, разработала CLSM, который изначально предназначался для промышленного применения, а не для биологии. Этот инструмент был приобретен в 1990 году компанией Leica Lasertechnik . Zeiss уже имел на рынке неконфокальный лазерный сканирующий микроскоп с летающим пятном, который был модернизирован до конфокального. Отчет 1990 года, [42] упомянул некоторых производителей конфокальных аппаратов: Sarastro, Technical Instrument, Meridian Instruments, Bio-Rad, Leica, Tracor-Northern и Zeiss. [35]

В 1989 году Фриц Карл Прейкшат вместе со своим сыном Экхардом Прейкшатом изобрел сканирующий лазерный диодный микроскоп для анализа размеров частиц. [43] [44] и стал соучредителем Lasentec для его коммерциализации. В 2001 году компания Lasentec была приобретена Mettler Toledo . [45] Они используются в основном в фармацевтической промышленности для обеспечения контроля процесса кристаллизации на месте в крупных системах очистки.

2010-е: Вычислительные методы удаления выходного отверстия.

[ редактировать ]

В стандартных конфокальных инструментах второе или «выходное» отверстие используется для фильтрации излучаемого или рассеянного света. Традиционно это отверстие представляет собой пассивный компонент, который блокирует свет для его оптической фильтрации. Однако в новых разработках эту фильтрацию пытались выполнить в цифровом виде.

Недавние подходы заменили пассивную обскуру составным детекторным элементом. Обычно после цифровой обработки этот подход приводит к лучшему разрешению и фотонному бюджету, поскольку предел разрешения может приближаться к пределу бесконечно маленького отверстия. [46]

Другие исследователи попытались в цифровом виде перефокусировать свет от точечного источника возбуждения, используя глубокие сверточные нейронные сети. [47]

См. также

[ редактировать ]
  • Микроскопия с двухфотонным возбуждением : хотя они используют родственную технологию (оба являются лазерными сканирующими микроскопами), многофотонные флуоресцентные микроскопы не являются строго конфокальными микроскопами. Термин конфокальный возникает из-за наличия диафрагмы в сопряженной фокальной плоскости (конфокальной). Эта диафрагма обычно отсутствует в многофотонных микроскопах из-за трудностей с сканированием луча.

Ссылки

[ редактировать ]
  1. ^ Перейти обратно: а б Поли Дж.Б., изд. (2006). Справочник по биологической конфокальной микроскопии (3-е изд.). Берлин: Шпрингер. ISBN  0-387-25921-Х .
  2. ^ Перейти обратно: а б US 3013467 , Мински, Марвин, «Аппарат для микроскопии», опубликовано 19 декабря 1961 г.  
  3. ^ Мемуары об изобретении конфокального сканирующего микроскопа , Scanning 10 (1988), стр. 128–138.
  4. ^ Перейти обратно: а б Феллерс Т.Дж., Дэвидсон М.В. (2007). «Введение в конфокальную микроскопию» . Ресурсный центр Olympus Fluoview . Национальная лаборатория сильных магнитных полей . Проверено 25 июля 2007 г.
  5. ^ US 5162941 , Фавро, Лоуренс Д.; Томас, Роберт Л. и Куо, Пао-Куанг и др., «Конфокальный микроскоп», опубликовано 10 ноября 1992 г., передано Совету управляющих Государственного университета Уэйна .  
  6. ^ «Техническое описание NanoFocus µsurf конфокального микроскопа белого света с вращающимся диском » . Архивировано из оригинала 20 января 2014 г. Проверено 14 августа 2013 г.
  7. ^ «Техническое описание сенсорной головки Sensofar 'PLu neox' с двойной технологией, сочетающей методы конфокальной и интерферометрии, а также спектроскопической рефлектометрии» .
  8. ^ Винце Л. (2005). «Конфокальная рентгенофлуоресцентная визуализация и РФА-томография для трехмерного микроанализа микроэлементов» . Микроскопия и микроанализ . 11 (Приложение 2). дои : 10.1017/S1431927605503167 .
  9. ^ Литтлджон, Джордж Р.; Гувейя, Жоао Д.; Эднер, Кристоф; Смирнов, Николай; С любовью, Джон (2010). «Перфтордекалин повышает разрешение мезофилла Arabidopsis thaliana in vivo при конфокальной микроскопии». Новый фитолог . 186 (4): 1018–1025. дои : 10.1111/j.1469-8137.2010.03244.x . hdl : 10026.1/9344 . ISSN   1469-8137 . ПМИД   20374500 .
  10. ^ Купперс, Мишель; Альбрехт, Дэвид; Кашканова Анна Дмитриевна; Люр, Дженнифер; Сандогдар, Вахид (7 апреля 2023 г.). «Микроскопия конфокального интерферометрического рассеяния выявляет трехмерную наноскопическую структуру и динамику в живых клетках» . Природные коммуникации . 14 (1): 1962. Бибкод : 2023NatCo..14.1962K . дои : 10.1038/s41467-023-37497-7 . ISSN   2041-1723 . ПМЦ   10081331 . ПМИД   37029107 .
  11. ^ Хуан Карлос Стокерт, Альфонсо Бласкес-Кастро (2017). «Глава 6. Приборы и методы флуоресценции» . Флуоресцентная микроскопия в науках о жизни . Издательство Bentham Science. стр. 180–184. ISBN  978-1-68108-519-7 . Архивировано из оригинала 14 мая 2019 года . Проверено 24 декабря 2017 г.
  12. ^ Патель Д.В., МакГи CN (2007). «Современная конфокальная микроскопия in vivo роговицы живого человека с использованием методов белого света и лазерного сканирования: основной обзор». Клин. Экспериментируйте. Офтальмол . 35 (1): 71–88. дои : 10.1111/j.1442-9071.2007.01423.x . ПМИД   17300580 . S2CID   23029612 .
  13. ^ Хоффман А., Гетц М., Вит М., Галле П.Р., Нейрат М.Ф., Кисслих Р. (2006). «Конфокальная лазерная эндомикроскопия: техническое состояние и современные показания». Эндоскопия . 38 (12): 1275–83. дои : 10.1055/s-2006-944813 . ПМИД   17163333 . S2CID   260134204 .
  14. ^ Ле Персон, С.; Пуиггали, младший; Барон, М.; Рокес, М. (1998). «Сушка тонких фармацевтических пленок в ближнем инфракрасном диапазоне: экспериментальный анализ внутреннего массопереноса» (PDF) . Химическая инженерия и переработка: интенсификация процессов . 37 (3): 257–263. дои : 10.1016/S0255-2701(98)00032-4 .
  15. ^ Гитис, Виталий; Ротенберг, Гади (2020). Гитис, Виталий; Ротенберг, Гади (ред.). Справочник по пористым материалам . Сингапур: World Scientific. стр. 63–64. дои : 10.1142/11909 . ISBN  978-981-122-322-8 .
  16. ^ Процесс оцифровки . Проект IRENE, Библиотеки Калифорнийского университета в Беркли .
  17. ^ Хиршфельд, В.; Хюбнер, К.Г. (2010). «Чувствительный и универсальный лазерный сканирующий конфокальный оптический микроскоп для флуоресценции одиночных молекул при 77 К». Обзор научных инструментов . 81 (11): 113705–113705–7. Бибкод : 2010RScI...81k3705H . дои : 10.1063/1.3499260 . ПМИД   21133476 .
  18. ^ Грациозо, Ф.; Паттон, БР; Смит, Дж. М. (2010). «Высокостабильный конфокальный оптический микроскоп с лучевым сканированием для работы при низких температурах». Обзор научных инструментов . 81 (9): 093705–4. Бибкод : 2010RScI...81i3705G . дои : 10.1063/1.3484140 . ПМИД   20886985 .
  19. ^ Ганс Гольдманн (1939). «Spaltlampenphotographie und –photometrie». Офтальмологика . 98 (5/6): 257–270. дои : 10.1159/000299716 . Примечание. Том 98 датирован 1939 годом, однако на первой странице статьи в качестве даты публикации указан январь 1940 года.
  20. ^ Перейти обратно: а б с д Колин-младший Шеппард (3 ноября 2009 г.). «Конфокальная микроскопия. Развитие современной микроскопии». Визуализация и микроскопия . онлайн
  21. ^ Перейти обратно: а б с Барри Р. Мастерс: конфокальная микроскопия и микроскопия многофотонного возбуждения. Генезис визуализации живых клеток. SPIE Press, Беллингем, Вашингтон, США, 2006 г., ISBN   978-0-8194-6118-6 , стр. 120–121.
  22. ^ Зюн Коана (1942). Журнал Светотехнического института . 26 (8): 371–385. {{cite journal}}: Отсутствует или пусто |title= ( помощь ) Статья доступна на сайте журнала . PDF-файл с пометкой «P359 - 402» имеет размер 19 020 килобайт и содержит также соседние статьи из того же номера. На рис. 1б статьи показана схема конфокального пути прохождения луча.
  23. ^ Наора, Хирото (1951). «Микроспектрофотометрия и цитохимический анализ нуклеиновых кислот». Наука . 114 (2959): 279–280. Бибкод : 1951Sci...114..279N . дои : 10.1126/science.114.2959.279 . ПМИД   14866220 .
  24. ^ Марвин Мински (1988). «Воспоминания об изобретении конфокального сканирующего микроскопа». Сканирование . 10 (4): 128–138. дои : 10.1002/sca.4950100403 .
  25. ^ Гай Кокс: Методы оптической визуализации в клеточной биологии. 1. издание. CRC Press, Taylor & Francisco Group, Бока-Ратон, Флорида, США, 2006 г., ISBN   0-8493-3919-7 , страницы 115–122.
  26. ^ Эггер, доктор медицинских наук, Петран М. (июль 1967 г.). «Новый микроскоп отраженного света для просмотра неокрашенных клеток головного мозга и ганглиев». Наука . 157 (786): 305–7. Бибкод : 1967Sci...157..305E . дои : 10.1126/science.157.3786.305 . ПМИД   6030094 . S2CID   180450 .
  27. ^ МОЙМИР ПЕТРАН; МИЛАН ХАДРАВСКИЙ; М. ДЭВИД ЭГГЕР; РОБЕРТ ГАЛАМБОС (1968). «Тандемно-сканирующий микроскоп отраженного света». Журнал Оптического общества Америки . 58 (5): 661–664. Бибкод : 1968JOSA...58..661P . дои : 10.1364/JOSA.58.000661 .
  28. ^ США 3517980 , Петран, Моймир и Хадавски, Милан, «Способ и устройство для улучшения разрешающей способности и контрастности», опубликовано 30 июня 1970 г., передано Чешскословенской академии.  
  29. ^ Давидовиц П.; Эггер, доктор медицины (1969). «Сканирующий лазерный микроскоп» . Природа . 223 (5208): 831. Бибкод : 1969Natur.223..831D . дои : 10.1038/223831a0 . ПМИД   5799022 . S2CID   4161644 .
  30. ^ Давидовиц П.; Эггер, доктор медицины (1971). «Сканирующий лазерный микроскоп для биологических исследований». Прикладная оптика . 10 (7): 1615–1619. Бибкод : 1971ApOpt..10.1615D . дои : 10.1364/AO.10.001615 . ПМИД   20111173 .
  31. ^ Барри Р. Мастерс: конфокальная микроскопия и микроскопия многофотонного возбуждения. Генезис визуализации живых клеток. SPIE Press, Беллингем, Вашингтон, США, 2006 г., ISBN   978-0-8194-6118-6 , стр. 124–125.
  32. ^ Перейти обратно: а б с д Шинья Иноуэ (2006). «Глава 1: Основы конфокальной сканированной визуализации в световой микроскопии». В Джеймсе Поли (ред.). Справочник по биологической конфокальной микроскопии (3-е изд.). ООО «Спрингер Сайенс энд Бизнес Медиа». стр. 1–19 . ISBN  978-0-387-25921-5 .
  33. ^ Шеппард, CJR; Чоудри, А. (1977). «Формирование изображения в сканирующем микроскопе». Optica Acta: Международный журнал оптики . 24 (10): 1051–1073. Бибкод : 1977AcOpt..24.1051S . дои : 10.1080/713819421 .
  34. ^ Кремер, К.; Кремер, Т. (1978). «Соображения по поводу лазерного сканирующего микроскопа с высоким разрешением и глубиной резкости». Микроскопика Акта . 81 (1): 31–44. ПМИД   713859 .
  35. ^ Перейти обратно: а б с Амос, ВБ ; Уайт, Дж. Г. (2003). «Как конфокальный лазерный сканирующий микроскоп вошел в биологические исследования» . Биология клетки . 95 (6): 335–342. дои : 10.1016/S0248-4900(03)00078-9 . ПМИД   14519550 . S2CID   34919506 .
  36. ^ Кокс, Эй Джей; Шеппард, CJ (1983). «Сканирующий оптический микроскоп с цифровой рамкой и микрокомпьютером». Прикладная оптика . 22 (10): 1474. Бибкод : 1983ApOpt..22.1474C . дои : 10.1364/ao.22.001474 . ПМИД   18195988 .
  37. ^ Уайт, Дж. Г. (1987). «Оценка конфокальной и традиционной визуализации биологических структур с помощью флуоресцентной световой микроскопии» . Журнал клеточной биологии . 105 (1): 41–48. дои : 10.1083/jcb.105.1.41 . ISSN   0021-9525 . ПМК   2114888 . ПМИД   3112165 .
  38. ^ Анон (2005). «Доктор Джон Уайт, ФРС» . royalsociety.org . Лондон: Королевское общество . Архивировано из оригинала 17 ноября 2015 г.
  39. ^ Амос, Всемирный банк; Уайт, Дж. Г. (2003). «Как конфокальный лазерный сканирующий микроскоп вошел в биологические исследования» . Биология клетки . 95 (6): 335–342. дои : 10.1016/S0248-4900(03)00078-9 . ПМИД   14519550 . S2CID   34919506 .
  40. ^ Карлссон, К.; Даниэльссон, ЧП; Ленц, Р.; Лильеборг, А.; Майлёф, Л.; Ослунд, Н. (1985). «Трехмерная микроскопия с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа». Оптические письма . 10 (2): 53–55. Бибкод : 1985OptL...10...53C . дои : 10.1364/OL.10.000053 . ПМИД   19724343 .
  41. ^ Брент Джонсон (1 февраля 1999 г.). «Имидж – это все». Ученый . онлайн
  42. ^ Дайана Морган (23 июля 1990 г.). «Конфокальные микроскопы расширяют горизонты карьеры в области клеточной биологии». Ученый . онлайн
  43. ^ US 4871251 , Прейкшат, Фриц К. и Прейкшат, Экхард, «Устройство и метод для анализа частиц», опубликовано 3 октября 1989 г.  
  44. ^ US 5012118 , Прейкшат, Фриц К. и Прейкшат, Экхард, «Устройство и метод для анализа частиц», опубликовано 30 апреля 1991 г.  
  45. ^ защищены, все права Mettler-Toledo International Inc. «Анализ гранулометрического состава» . Архивировано из оригинала 9 октября 2016 г. Проверено 6 октября 2016 г.
  46. ^ Вайсхарт, Клаус. «Основной принцип воздушного сканирования» (PDF) . актив-загрузки.zeiss.com . Проверено 6 сентября 2023 г.
  47. ^ Си, Чен; Михаил, Кандель; Шэнхуа, Хэ; Чэньфэй, Ху; Янг Джэ, Ли; Кэтрин, Салливан; Грегори, Трейси; Хи Юнг, Чунг; Хён Джун, Конг; Марк, Анастасио; Габриэль, Попеску (2023). «Искусственная конфокальная микроскопия для глубокой визуализации без меток» . Природная фотоника . 17 (3): 250–258. arXiv : 2110.14823 . Бибкод : 2023NaPho..17..250C . дои : 10.1038/s41566-022-01140-6 . ПМЦ   10153546 . ПМИД   37143962 .
[ редактировать ]
Викискладе есть медиафайлы, связанные с конфокальной микроскопией .
Ресурсы библиотеки о
Конфокальная микроскопия
Retrieved from "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Confocal_microscopy&oldid=1218011356#Techniques_used_for_horizontal_scanning"
Arc.Ask3.Ru: конец переведенного документа.
Arc.Ask3.Ru
Номер скриншота №: 4199af970915b72af4caf384b038a759__1712632860
URL1:https://arc.ask3.ru/arc/aa/41/59/4199af970915b72af4caf384b038a759.html
Заголовок, (Title) документа по адресу, URL1:
Confocal microscopy - Wikipedia
Данный printscreen веб страницы (снимок веб страницы, скриншот веб страницы), визуально-программная копия документа расположенного по адресу URL1 и сохраненная в файл, имеет: квалифицированную, усовершенствованную (подтверждены: метки времени, валидность сертификата), открепленную ЭЦП (приложена к данному файлу), что может быть использовано для подтверждения содержания и факта существования документа в этот момент времени. Права на данный скриншот принадлежат администрации Ask3.ru, использование в качестве доказательства только с письменного разрешения правообладателя скриншота. Администрация Ask3.ru не несет ответственности за информацию размещенную на данном скриншоте. Права на прочие зарегистрированные элементы любого права, изображенные на снимках принадлежат их владельцам. Качество перевода предоставляется как есть. Любые претензии, иски не могут быть предъявлены. Если вы не согласны с любым пунктом перечисленным выше, вы не можете использовать данный сайт и информация размещенную на нем (сайте/странице), немедленно покиньте данный сайт. В случае нарушения любого пункта перечисленного выше, штраф 55! (Пятьдесят пять факториал, Денежную единицу (имеющую самостоятельную стоимость) можете выбрать самостоятельно, выплаичвается товарами в течение 7 дней с момента нарушения.)