Немевалонатный путь

, Немевалонатный путь также известный как мевалонат-независимый путь и 2- C -метил- D -эритрит-4-фосфат/1-дезокси- D -ксилулозо-5-фосфат ( MEP/DOXP ) путь , является альтернативным метаболическим путем. путь биосинтеза предшественников изопреноидов изопентенилпирофосфата (IPP) и диметилаллилпирофосфата (DMAPP). ^{[ 1 ]}^{[ 2 ]}^{[ 3 ]} В настоящее время предпочтительным названием этого пути является путь MEP , поскольку MEP является первым детерминированным метаболитом на пути к IPP .

Биосинтез предшественников изопреноидов

Мевалонатный путь (путь MVA или путь HMG-CoA-редуктазы ) и путь MEP представляют собой метаболические пути биосинтеза предшественников изопреноидов: IPP и DMAPP. В то время как растения используют как MVA, так и MEP пути, большинство организмов используют только один из путей биосинтеза предшественников изопреноидов. В растительных клетках биосинтез IPP/DMAPP по пути MEP происходит в пластидных органеллах, тогда как биосинтез по пути MVA происходит в цитоплазме. ^{[ 4 ]} Большинство грамотрицательных бактерий, фотосинтезирующих цианобактерий и зеленых водорослей используют только путь MEP. ^{[ 5 ]} Бактерии, использующие путь MEP, включают важные патогены, такие как Mycobacterium Tuberculosis . ^{[ 6 ]}

IPP и DMAPP служат предшественниками биосинтеза молекул изопреноидов (терпеноидов), используемых в таких разнообразных процессах, как пренилирование белков , поддержание клеточных мембран , синтез гормонов , закрепление белков и N -гликозилирование во всех трех сферах жизни. ^{[ нужна ссылка ]} В фотосинтезирующих организмах предшественники МЭП используются для биосинтеза фотосинтетических пигментов, таких как каротиноиды и фитольная цепь хлорофилла и светособирающих пигментов. ^{[ 5 ]}

Такие бактерии, как Escherichia coli, были созданы для совместной экспрессии генов биосинтеза как MEP, так и MVA-пути . ^{[ 7 ]} Распределение метаболических потоков между МВП и путем MVA можно изучить с помощью ¹³ С-глюкозы Изотопомеры . ^{[ 8 ]}

Реакции

Реакции пути MEP следующие, взяты в основном у Эйзенрайха и его коллег, за исключением тех случаев, когда жирный шрифт представляет собой дополнительные местные сокращения, помогающие связать таблицу со схемой выше: ^{[ 10 ]}^{[ 9 ]}

Реагенты	Фермент	Продукт
Пируват ( Pyr ) и глицеральдегид-3-фосфат ( G3P )	ДОКСФ-синтаза (Dxs; DXP )	1-Дезокси-D-ксилулозо-5-фосфат (DOXP; DXP )
ДОХП ( ДХП )	DXP-редуктоизомераза (Dxr, IspC; DXR )	2-C-метилэритрит-4-фосфат (МЭП)
депутат Европарламента	2-C-метил-D-эритрит-4-фосфат цитидилилтрансфераза (YgbP, IspD; CMS )	4-дифосфоцитидил-2-C-метилэритрит (CDP-ME)
CDP-ME	4-дифосфоцитидил-2-C-метил-D-эритриткиназа (YchB, IspE; CMK )	4-дифосфоцитидил-2-C-метил-D-эритрит-2-фосфат (CDP-MEP)
CDP-MEP	2-C-метил-D-эритрит-2,4-циклодифосфатсинтаза ( YgbB , IspF; MCS )	2-C-метил-D-эритрит-2,4-циклодифосфат (MEcPP)
МЭКПП	HMB-PP-синтаза (GcpE, IspG; HDS )	(Е)-4-Гидрокси-3-метил-бут-2-енилпирофосфат (HMB-PP)
ИСБ-ПП	HMB-PP редуктаза (LytB, IspH; HDR ).	Изопентенилпирофосфат (IPP) и диметилаллилпирофосфат (DMAPP)

Ингибирование и другие исследования путей

Dxs, первый фермент пути, ингибируется по принципу обратной связи продуктами IPP и DMAPP. Dxs активен в виде гомодимера , и точный механизм ингибирования фермента обсуждается в этой области. Было предложено, чтобы IPP/DMAPP конкурировали с кофактором TPP. ^{[ 11 ]} деградацию фермента посредством взаимодействия с сайтом взаимодействия мономера, который отличается от активного центра фермента Более недавнее исследование показало, что IPP/DMAPP запускает мономеризацию и последующую . ^{[ 12 ]}

DXP-редуктоизомераза (также известная как: DXR, DOXP-редуктоизомераза, IspC, MEP-синтаза) является ключевым ферментом пути MEP. Его можно ингибировать с помощью природного продукта фосмидомицина , который изучается в качестве отправной точки для разработки потенциального антибактериального или противомалярийного препарата. ^{[ 13 ]}^{[ 14 ]}^{[ 15 ]}

Промежуточное соединение, HMB-PP , является естественным активатором Т-клеток Vγ9/Vδ2 человека , основной популяции γδ-Т-клеток в периферической крови, а также клеток, которые «играют решающую роль в иммунном ответе на микробные патогены». ^{[ 16 ]}

Ингибиторы IspH: немевалонатный путь метаболизма, который необходим для большинства бактерий, но отсутствует у человека, что делает его идеальной мишенью для разработки антибиотиков. Этот путь, называемый метил-D-эритритфосфатом (MEP) или немевалонатным путем, отвечает за биосинтез изопреноидов — молекул, необходимых для выживания клеток у большинства патогенных бактерий и, следовательно, полезных для большинства бактерий, устойчивых к антибактериальным препаратам. ^{[ 17 ]}

Метаболическая инженерия пути MEP/немевалоната

Путь MEP был тщательно изучен и сконструирован Escherichia coli , широко используемым видом микроорганизмов для лабораторных исследований и применения. ^{[ 18 ]} IPP и DMAPP, продукты пути MEP, могут быть использованы в качестве субстратов для получения гетерологичных терпеноидов, имеющих высокую ценность для применения в фармацевтической и химической промышленности. При экспрессии гетерологичных генов из разных организмов производство терпеноидов, таких как лимонен , бисаболен и изопрен, может быть достигнуто в разных микробных средах. ^{[ 19 ]}^{[ 20 ]}^{[ 21 ]}^{[ 22 ]} Исследования сверхэкспрессии различных генов биосинтеза этого пути показали, что экспрессия Dxs и Idi, катализирующих первый и последний этапы пути MEP, может значительно увеличить выход терпеноидов, полученных из MEP. ^{[ 19 ]}^{[ 22 ]} Dxs как первый фермент пути представляет собой узкое место для потока углерода, поступающего в путь. Idi, который взаимно превращает IPP в DMAPP и наоборот, по-видимому, важен для обеспечения соответствующего субстрата, который необходим при введении гетерологичного поглотителя углерода в сконструированные штаммы. Большая работа по метаболической инженерии на пути MEP была проделана на цианобактериях , фотоавтотрофных микробах, которые могут ассимилировать углекислый газ из атмосферы в различные углеродсодержащие метаболиты, включая терпеноиды. ^{[ 20 ]}^{[ 19 ]}^{[ 21 ]} Таким образом , для биотехнологии цианобактерии являются привлекательной платформой для устойчивого производства ценных соединений.

Ссылки

^ Ромер М; Ромер, Мишель (1999). «Открытие независимого от мевалоната пути биосинтеза изопреноидов в бактериях, водорослях и высших растениях». Представитель Nat Prod . 16 (5): 565–574. дои : 10.1039/a709175c . ПМИД 10584331 .
^ В. Эйзенрайх; А. Бахер; Д. Аригони; Ф. Родич (2004). «Обзор биосинтеза изопреноидов по немевалонатному пути» . Клеточные и молекулярные науки о жизни . 61 (12): 1401–1426. дои : 10.1007/s00018-004-3381-z . ПМЦ 11138651 . ПМИД 15197467 . S2CID 24558920 .
^ Хантер, Западная Нью-Йорк (2007). «Немевалонатный путь биосинтеза предшественников изопреноидов» . Журнал биологической химии . 282 (30): 21573–21577. дои : 10.1074/jbc.R700005200 . ПМИД 17442674 .
^ Лихтенталер Х (1999). «1-дезокси-D-ксилулозо-5-фосфатный путь биосинтеза изопреноидов в растениях». Ежегодный обзор физиологии растений и молекулярной биологии растений . 50 : 47–65. doi : 10.1146/annurev.arplant.50.1.47 . ПМИД 15012203 .
^ Jump up to: ^а ^б Вранова, Ева; Коман, Диана; Грюиссем, Вильгельм (29 апреля 2013 г.). «Сетевой анализ путей MVA и MEP для синтеза изопреноидов» . Ежегодный обзор биологии растений . 64 (1): 665–700. doi : 10.1146/annurev-arplant-050312-120116 . ISSN 1543-5008 . ПМИД 23451776 .
^ Вимер, Эй Джей; Сяо, Швейцария; Вимер, Д.Ф. (2010). «Метаболизм изопреноидов как терапевтическая мишень у грамотрицательных патогенов». Актуальные темы медицинской химии . 10 (18): 1858–1871. дои : 10.2174/156802610793176602 . ПМИД 20615187 .
^ Мартин М.Дж., Питера Дж.Д., Уизерс С.Т., Ньюман Дж.Д., Кислинг Дж.Д. (2003). «Разработка мевалонатного пути в Escherichia coli для производства терпеноидов». Природная биотехнология . 21 (7): 796–802. дои : 10.1038/nbt833 . ПМИД 12778056 . S2CID 17214504 .
^ Орси Э., Биквилдер Дж., Пик С., Эггинк Г., Кенген С.В., Веустуис Р.А. (2020). «Анализ соотношения метаболических потоков путем параллельного мечения 13C биосинтеза изопреноидов у Rhodobacter sphaeroides » . Метаболическая инженерия . 57 : 228–238. дои : 10.1016/j.ymben.2019.12.004 . ПМИД 31843486 .
^ Jump up to: ^а ^б Кидваи Т., Джамал Ф., Хан М.Ю., Шарма Б. (2014). «Изучение мишеней лекарственных средств на пути биосинтеза изопреноидов для Plasmodium falciparum» . Международное исследование биохимии . 2014 : 657189. doi : 10.1155/2014/657189 . ПМК 4017727 . ПМИД 24864210 . (Отозвано, см. дои : 10.1155/2022/8426183 , ПМИД 35340427 . Если это намеренная ссылка на отозванную статью, замените {{retracted|...}} с {{retracted|...|intentional=yes}}. )
^ Jump up to: ^а ^б Эйзенрайх В., Бахер А., Аригони Д., Родих Ф. (2004). «Биосинтез изопреноидов по немевалонатному пути» . Клетка. Мол. Наука о жизни . 61 (12): 1401–26. дои : 10.1007/s00018-004-3381-z . ПМЦ 11138651 . ПМИД 15197467 . S2CID 24558920 .
^ Банерджи, Апараджита; Ву, Ян; Банерджи, Рахул; Ли, Юэ; Ян, Хунгао; Шарки, Томас Д. (июнь 2013 г.). «Ингибирование дезокси-д-ксилулозо-5-фосфатсинтазы по принципу обратной связи регулирует путь метилэритрит-4-фосфата» . Журнал биологической химии . 288 (23): 16926–16936. дои : 10.1074/jbc.m113.464636 . ISSN 0021-9258 . ПМЦ 3675625 . ПМИД 23612965 .
^ Ди, Сюэни; Ортега-Аларкон, Дэвид; Какуману, Раму; Черчс-Фернандес, Хавьер; Диас, Люсия; Байду, Эдвард ЭК; Веласкес-Филд, Адриан; Родригес-Концепция, Мануэль; Перес-Хиль, Хорди (08 мая 2023 г.). «Продукты пути MEP аллостерически способствуют мономеризации дезокси-D-ксилулозо-5-фосфатсинтазы, регулируя их поступление по принципу обратной связи» . Заводские коммуникации . 4 : 100512.doi : (3 ) 10.1016/j.xplc.2022.100512 . hdl : 10261/335525 . ISSN 2590-3462 . PMID 36575800 .
^ Хейл И., О'Нил П.М., Берри Н.Г., Одом А., Шарма Р. (2012). «Путь MEP и разработка ингибиторов как потенциальных противоинфекционных агентов». Мед. хим. Коммун . 3 (4): 418–433. дои : 10.1039/C2MD00298A .
^ Джомаа Х., Виснер Дж., Сандербранд С. и др. (1999). «Ингибиторы немевалонатного пути биосинтеза изопреноидов как противомалярийные препараты». Наука . 285 (5433): 1573–6. дои : 10.1126/science.285.5433.1573 . ПМИД 10477522 .
^ К. Зингле; Л. Кунц; Д. Трич; К. Гродеманж-Бильярд; М. Ромер (2010). «Биосинтез изопреноидов через путь метилэритритфосфата: структурные изменения вокруг фосфонатного якоря и спейсера фосмидомицина, мощного ингибитора дезоксисилулозофосфатредуктоизомеразы». Дж. Орг. хим. 75 (10): 3203–3207. дои : 10.1021/jo9024732 . ПМИД 20429517 .
^ Эберл М., Хинц М., Райхенберг А., Коллас А.К., Виснер Дж., Джомаа Х. (2003). «Микробный биосинтез изопреноидов и активация γδ Т-клеток человека» . ФЭБС Летт . 544 (1–3): 4–10. дои : 10.1016/S0014-5793(03)00483-6 . ПМИД 12782281 . S2CID 9930822 .
^ «Исследовательская группа сообщает о новом классе антибиотиков, активных против широкого спектра бактерий» . MDLinx . 23 декабря 2020 г. Проверено 23 января 2023 г. ^{[ мертвая ссылка ]}
^ Родригес-Консепсьон, Мануэль; Боронат, Альберт (1 ноября 2002 г.). «Выяснение пути метилэритритфосфата для биосинтеза изопреноидов в бактериях и пластидах. Метаболическая веха, достигнутая посредством геномики» . Физиология растений . 130 (3): 1079–1089. дои : 10.1104/стр.007138 . ПМЦ 1540259 . ПМИД 12427975 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с Энглунд, Элиас; Шабестары, Киян; Хадсон, Элтон П.; Линдберг, Пиа (01 сентября 2018 г.). «Систематическое исследование сверхэкспрессии с целью поиска целевых ферментов, усиливающих выработку терпенов в Synechocystis PCC 6803, с использованием изопрена в качестве модельного соединения» . Метаболическая инженерия . 49 : 164–177. дои : 10.1016/j.ymben.2018.07.004 . ISSN 1096-7176 . ПМИД 30025762 .
^ Jump up to: ^а ^б Гао, Сян; Гао, Фанг; Лю, Дэн; Чжан, Хао; Не, Сяоцюнь; Ян, Чен (13 апреля 2016 г.). «Разработка пути метилэритритфосфата у цианобактерий для фотосинтетического производства изопрена из CO2» . Энергетика и экология . 9 (4): 1400–1411. дои : 10.1039/C5EE03102H . ISSN 1754-5706 .
^ Jump up to: ^а ^б Родригеш, Жоао С.; Линдберг, Пиа (01 июня 2021 г.). «Метаболическая инженерия Synechocystis sp. PCC 6803 для улучшения производства бисаболена» . Метаболические инженерные коммуникации . 12 : e00159. doi : 10.1016/j.mec.2020.e00159 . ISSN 2214-0301 . ПМК 7809396 . ПМИД 33489752 .
^ Jump up to: ^а ^б Ду, Фу-Лян; Ю, Хуэй-Лэй; Сюй, Цзянь-Хе; Ли, Чун-Сю (31 августа 2014 г.). «Увеличение производства лимонена за счет оптимизации экспрессии генов биосинтеза лимонена и пути MEP в E. coli» . Биоресурсы и биопереработка . 1 (1): 10. дои : 10.1186/s40643-014-0010-z . ISSN 2197-4365 .

[1] Ромер М; Ромер, Мишель (1999). «Открытие независимого от мевалоната пути биосинтеза изопреноидов в бактериях, водорослях и высших растениях». Представитель Nat Prod . 16 (5): 565–574. дои : 10.1039/a709175c . ПМИД 10584331 .

[2] В. Эйзенрайх; А. Бахер; Д. Аригони; Ф. Родич (2004). «Обзор биосинтеза изопреноидов по немевалонатному пути» . Клеточные и молекулярные науки о жизни . 61 (12): 1401–1426. дои : 10.1007/s00018-004-3381-z . ПМЦ 11138651 . ПМИД 15197467 . S2CID 24558920 .

[HunterJBC07-3] Хантер, Западная Нью-Йорк (2007). «Немевалонатный путь биосинтеза предшественников изопреноидов» . Журнал биологической химии . 282 (30): 21573–21577. дои : 10.1074/jbc.R700005200 . ПМИД 17442674 .

[4] Лихтенталер Х (1999). «1-дезокси-D-ксилулозо-5-фосфатный путь биосинтеза изопреноидов в растениях». Ежегодный обзор физиологии растений и молекулярной биологии растений . 50 : 47–65. doi : 10.1146/annurev.arplant.50.1.47 . ПМИД 15012203 .

[Vranová_665–700-5] Jump up to: ^а ^б Вранова, Ева; Коман, Диана; Грюиссем, Вильгельм (29 апреля 2013 г.). «Сетевой анализ путей MVA и MEP для синтеза изопреноидов» . Ежегодный обзор биологии растений . 64 (1): 665–700. doi : 10.1146/annurev-arplant-050312-120116 . ISSN 1543-5008 . ПМИД 23451776 .

[6] Вимер, Эй Джей; Сяо, Швейцария; Вимер, Д.Ф. (2010). «Метаболизм изопреноидов как терапевтическая мишень у грамотрицательных патогенов». Актуальные темы медицинской химии . 10 (18): 1858–1871. дои : 10.2174/156802610793176602 . ПМИД 20615187 .

[7] Мартин М.Дж., Питера Дж.Д., Уизерс С.Т., Ньюман Дж.Д., Кислинг Дж.Д. (2003). «Разработка мевалонатного пути в Escherichia coli для производства терпеноидов». Природная биотехнология . 21 (7): 796–802. дои : 10.1038/nbt833 . ПМИД 12778056 . S2CID 17214504 .

[13C-8] Орси Э., Биквилдер Дж., Пик С., Эггинк Г., Кенген С.В., Веустуис Р.А. (2020). «Анализ соотношения метаболических потоков путем параллельного мечения 13C биосинтеза изопреноидов у Rhodobacter sphaeroides » . Метаболическая инженерия . 57 : 228–238. дои : 10.1016/j.ymben.2019.12.004 . ПМИД 31843486 .

[QidwaiBRI14-9] Jump up to: ^а ^б Кидваи Т., Джамал Ф., Хан М.Ю., Шарма Б. (2014). «Изучение мишеней лекарственных средств на пути биосинтеза изопреноидов для Plasmodium falciparum» . Международное исследование биохимии . 2014 : 657189. doi : 10.1155/2014/657189 . ПМК 4017727 . ПМИД 24864210 . (Отозвано, см. дои : 10.1155/2022/8426183 , ПМИД 35340427 . Если это намеренная ссылка на отозванную статью, замените {{retracted|...}} с {{retracted|...|intentional=yes}}. )

[EisenreichMLS04-10] Jump up to: ^а ^б Эйзенрайх В., Бахер А., Аригони Д., Родих Ф. (2004). «Биосинтез изопреноидов по немевалонатному пути» . Клетка. Мол. Наука о жизни . 61 (12): 1401–26. дои : 10.1007/s00018-004-3381-z . ПМЦ 11138651 . ПМИД 15197467 . S2CID 24558920 .

[11] Банерджи, Апараджита; Ву, Ян; Банерджи, Рахул; Ли, Юэ; Ян, Хунгао; Шарки, Томас Д. (июнь 2013 г.). «Ингибирование дезокси-д-ксилулозо-5-фосфатсинтазы по принципу обратной связи регулирует путь метилэритрит-4-фосфата» . Журнал биологической химии . 288 (23): 16926–16936. дои : 10.1074/jbc.m113.464636 . ISSN 0021-9258 . ПМЦ 3675625 . ПМИД 23612965 .

[12] Ди, Сюэни; Ортега-Аларкон, Дэвид; Какуману, Раму; Черчс-Фернандес, Хавьер; Диас, Люсия; Байду, Эдвард ЭК; Веласкес-Филд, Адриан; Родригес-Концепция, Мануэль; Перес-Хиль, Хорди (08 мая 2023 г.). «Продукты пути MEP аллостерически способствуют мономеризации дезокси-D-ксилулозо-5-фосфатсинтазы, регулируя их поступление по принципу обратной связи» . Заводские коммуникации . 4 : 100512.doi : (3 ) 10.1016/j.xplc.2022.100512 . hdl : 10261/335525 . ISSN 2590-3462 . PMID 36575800 .

[13] Хейл И., О'Нил П.М., Берри Н.Г., Одом А., Шарма Р. (2012). «Путь MEP и разработка ингибиторов как потенциальных противоинфекционных агентов». Мед. хим. Коммун . 3 (4): 418–433. дои : 10.1039/C2MD00298A .

[14] Джомаа Х., Виснер Дж., Сандербранд С. и др. (1999). «Ингибиторы немевалонатного пути биосинтеза изопреноидов как противомалярийные препараты». Наука . 285 (5433): 1573–6. дои : 10.1126/science.285.5433.1573 . ПМИД 10477522 .

[15] К. Зингле; Л. Кунц; Д. Трич; К. Гродеманж-Бильярд; М. Ромер (2010). «Биосинтез изопреноидов через путь метилэритритфосфата: структурные изменения вокруг фосфонатного якоря и спейсера фосмидомицина, мощного ингибитора дезоксисилулозофосфатредуктоизомеразы». Дж. Орг. хим. 75 (10): 3203–3207. дои : 10.1021/jo9024732 . ПМИД 20429517 .

[16] Эберл М., Хинц М., Райхенберг А., Коллас А.К., Виснер Дж., Джомаа Х. (2003). «Микробный биосинтез изопреноидов и активация γδ Т-клеток человека» . ФЭБС Летт . 544 (1–3): 4–10. дои : 10.1016/S0014-5793(03)00483-6 . ПМИД 12782281 . S2CID 9930822 .

[17] «Исследовательская группа сообщает о новом классе антибиотиков, активных против широкого спектра бактерий» . MDLinx . 23 декабря 2020 г. Проверено 23 января 2023 г. ^{[ мертвая ссылка ]}

[18] Родригес-Консепсьон, Мануэль; Боронат, Альберт (1 ноября 2002 г.). «Выяснение пути метилэритритфосфата для биосинтеза изопреноидов в бактериях и пластидах. Метаболическая веха, достигнутая посредством геномики» . Физиология растений . 130 (3): 1079–1089. дои : 10.1104/стр.007138 . ПМЦ 1540259 . ПМИД 12427975 .

[:0-19] Jump up to: ^а ^б ^с Энглунд, Элиас; Шабестары, Киян; Хадсон, Элтон П.; Линдберг, Пиа (01 сентября 2018 г.). «Систематическое исследование сверхэкспрессии с целью поиска целевых ферментов, усиливающих выработку терпенов в Synechocystis PCC 6803, с использованием изопрена в качестве модельного соединения» . Метаболическая инженерия . 49 : 164–177. дои : 10.1016/j.ymben.2018.07.004 . ISSN 1096-7176 . ПМИД 30025762 .

[:1-20] Jump up to: ^а ^б Гао, Сян; Гао, Фанг; Лю, Дэн; Чжан, Хао; Не, Сяоцюнь; Ян, Чен (13 апреля 2016 г.). «Разработка пути метилэритритфосфата у цианобактерий для фотосинтетического производства изопрена из CO2» . Энергетика и экология . 9 (4): 1400–1411. дои : 10.1039/C5EE03102H . ISSN 1754-5706 .

[:2-21] Jump up to: ^а ^б Родригеш, Жоао С.; Линдберг, Пиа (01 июня 2021 г.). «Метаболическая инженерия Synechocystis sp. PCC 6803 для улучшения производства бисаболена» . Метаболические инженерные коммуникации . 12 : e00159. doi : 10.1016/j.mec.2020.e00159 . ISSN 2214-0301 . ПМК 7809396 . ПМИД 33489752 .

[:3-22] Jump up to: ^а ^б Ду, Фу-Лян; Ю, Хуэй-Лэй; Сюй, Цзянь-Хе; Ли, Чун-Сю (31 августа 2014 г.). «Увеличение производства лимонена за счет оптимизации экспрессии генов биосинтеза лимонена и пути MEP в E. coli» . Биоресурсы и биопереработка . 1 (1): 10. дои : 10.1186/s40643-014-0010-z . ISSN 2197-4365 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]

[ 11 ]

[ 12 ]

[ 13 ]

[ 14 ]

[ 15 ]

[ 16 ]

[ 17 ]

[ 18 ]

[ 19 ]

[ 20 ]

[ 21 ]

[ 22 ]