Ген нокаут

Нокауты генов (также известные как делеция генов или инактивация генов ) представляют собой широко используемый метод генотической инженерии, который включает в себя целенаправленное удаление или инактивацию специфического гена в геноме организма. Это можно сделать с помощью различных методов, включая гомологичную рекомбинацию , CRISPR-CAS9 и TALEN .

Одним из основных преимуществ нокаутов генов является то, что они позволяют исследователям изучать функцию специфического гена in vivo и понять роль гена в нормальном развитии и физиологии, а также в патологии заболеваний. Изучив фенотип организма с нокаутированным геном, исследователи могут получить представление о биологических процессах, в которых участвует ген.

Существует два основных типа нокаутов генов: полные и условные. Полный ген -нокаут постоянно инактивирует ген, в то время как условный нокаут гена позволяет выключать ген в определенное время или в определенных тканях. Условные нокауты особенно полезны для изучения процессов развития и для понимания роли гена в конкретных типах клеток или тканях.

Нокауты генов широко использовались во многих различных организмах, включая бактерии, дрожжи, фруктовые мухи, рыбок данио и мышей. У мышей нокауты генов обычно используются для изучения функции специфических генов в развитии, физиологии и исследованиях рака.

Использование нокаутов генов в мышиных моделях было особенно ценным при изучении заболеваний человека. Например, нокауты генов у мышей использовались для изучения роли специфических генов в раке, неврологических расстройствах, иммунных расстройствах и метаболических расстройствах.

Тем не менее, нокауты генов также имеют некоторые ограничения. Например, потеря одного гена может не полностью имитировать эффекты генетического заболевания, и нокауты могут оказывать непреднамеренное влияние на другие гены или пути. Кроме того, нокауты генов не всегда являются хорошей моделью для заболеваний человека, поскольку мышиный геном не идентичен геному человека, а физиология мышей отличается от физиологии человека.

Техника КО, по сути, противоположна нокауту гена . Выбивая два гена одновременно в организме, известно как двойной нокаут ( DKO ). Точно так же термины тройной нокаут ( TKO ) и четырехкратные нокауты ( QKO ) используются для описания трех или четырех выбитых генов соответственно. Тем не менее, нужно различать гетерозиготные и гомозиготные KO. В первом, только одна из двух генов ( аллели ) выбивается, в последних оба выбиты.

Методы

Нокауты выполняются с помощью различных техник. Первоначально были идентифицированы природные мутации , а затем потеря или инактивация генов должна была быть установлена последовательно ДНК или другими методами. ^{[ 1 ]}

Ген нокаут мутацией

Нокаут гена по мутации обычно проводится у бактерий. Ранний случай использования этой техники в Escherichia coli был опубликован в 1989 году Hamilton, et al. ^{[ 2 ]} В этом эксперименте две последовательные рекомбинации были использованы для удаления гена. Эта работа установила осуществимость удаления или замены функционального гена в бактериях. С тех пор этот метод был разработан для других организмов, особенно исследовательских животных, таких как мыши. Нокаутные мыши обычно используются для изучения генов с эквивалентами человека, которые могут иметь значение для заболевания. Примером исследования с использованием нокаутированных мышей является исследование ролей белков XIRP в внезапном необъяснимом синдроме ночной смерти (Sunds) и синдроме Бругада в китайской популяции Хань. ^{[ 3 ]}

Ген молчания

Для исследований нокаута генов, РНК -интерференция (RNAi), более недавний метод, также известный как молчание генов, приобрела популярность. При интерференции РНК (RNAi) мессенджер РНК для конкретного гена инактивируется с использованием небольшой интерферирующей РНК (siRNA) или РНК короткой шпильки (SHRNA). Это эффективно останавливает экспрессируемый ген. Онкогены, такие как Bcl-2 и P53, а также гены, связанные с неврологическими заболеваниями, генетическими расстройствами и вирусными инфекциями, были нацелены на молчание генов с использованием интерференции РНК (RNAi). ^{[ Цитация необходима ]}

Гомологичная рекомбинация

Гомологичная рекомбинация - это обмен генами между двумя цепями ДНК, которые включают обширные области базовых последовательностей, которые идентичны друг другу. У эукариотических видов, бактерий и некоторых вирусов гомологичная рекомбинация происходит спонтанно и является полезным инструментом в генетически инженерном. Гомологичная рекомбинация, которая происходит во время мейоза у эукариот, имеет важное значение для восстановления двухцепочечных разрывов ДНК и способствует генетической вариации, позволяя двигаться генетической информации во время хромосомного пересечения. Гомологичная рекомбинация, ключевой механизм репарации ДНК у бактерий, позволяет ввести генетическое материал, полученный посредством горизонтального переноса генов и трансформации в ДНК. Гомологичная рекомбинация в вирусах влияет на ход эволюции вируса. Гомологичная рекомбинация, тип нацеливания на генов, используемого в генетической инженерии, включает введение инженерной мутации в конкретный ген, чтобы узнать больше о функции этого гена. Этот метод включает в себя вставку инородной ДНК в клетку, которая имеет последовательность, похожую на ген -мишень, в то время как его окружают последовательности, которые являются одинаковыми вверх по течению и ниже по течению от гена -мишени. ДНК гена -мишени заменяется инородной последовательности ДНК во время репликации, когда клетка обнаруживает аналогичные фланкирующие области как гомологи. Целевой ген «выбит» по обмену. Используя этот метод для нацеливания на конкретные аллели в эмбриональных стволовых клетках у мышей, можно создать нокаутированных мышей. С помощью гена нацеливания генов были закрыты многочисленные мышиные гены, что привело к созданию сотен различных мышиных моделей различных заболеваний человека, таких как рак, диабет, сердечно -сосудистые заболевания и неврологические расстройства. ^{[ Цитация необходима ]} Марио Капеччи, сэр Мартин Дж. Эванс и Оливер Смити провели новаторское исследование гомологичной рекомбинации в стволовых клетках мыши, и они провели Нобелевскую премию 2007 года в области физиологии или медицины за свои результаты. ^{[ 4 ]} Традиционно гомологичная рекомбинация была основным методом для создания нокаута гена. Этот метод включает в себя создание ДНК -конструкции, содержащей желаемую мутацию. Для нокаутных целей это обычно включает в себя маркер лекарственной устойчивости вместо желаемого нокаутного гена. ^{[ 5 ]} Конструкция также будет содержать минимум 2 КБ гомологии для целевой последовательности. Конструкция может быть доставлена в стволовые ячейки либо через микроинъекцию , либо электропорацию . Затем этот метод опирается на собственные механизмы восстановления ячейки для рекомбинирования ДНК -конструкции в существующую ДНК. Это приводит к изменению последовательности гена, и в большинстве случаев ген будет переведен в нефункциональный белок , если он вообще будет транслироваться. Однако это неэффективный процесс, так как гомологичная рекомбинация составляет только 10 ⁻² до 10 ⁻³ Интеграции ДНК. ^{[ 5 ]}^{[ 6 ]} Часто маркер выбора лекарственного средства на конструкции используется для выбора клеток, в которых произошло событие рекомбинации.

Эти стволовые клетки, в которых теперь отсутствует ген, можно использовать in vivo , например, у мышей, вставив их в ранние эмбрионы. Если полученная химерная мышь содержала генетическое изменение в их зародышевой линии, это может быть передано на потомство. ^{[ 5 ]}

В диплоидных организмах, которые содержат два аллеля для большинства генов, и могут также содержать несколько родственных генов, которые сотрудничают в одной и той же роли, дополнительные раунды трансформации и отбор выполняются до тех пор, пока каждый целевой ген не будет выбит. Селективное размножение может потребоваться для получения гомозиготных нокаутных животных.

Специфичные для сайта нуклеазы

В настоящее время используются три метода, которые включают точно нацеливание последовательности ДНК, чтобы ввести двухцепочечный разрыв. Как только это произойдет, механизмы восстановления ячейки попытаются восстановить этот двойной перерыв, часто через не-гомологичное соединение (NHEJ), которое включает непосредственно лигирование двух концов. ^{[ 6 ]} Это может быть сделано несовершенно, поэтому иногда вызывает вставки или удаление пар оснований, которые вызывают мутации сдвига кадров . Эти мутации могут сделать ген, в котором они встречаются нефункциональными, создавая тем самым нокаут этого гена. Этот процесс более эффективен, чем гомологичная рекомбинация, и, следовательно, может быть легче использовать для создания биаллельных нокаутов. ^{[ 6 ]}

Цинковые ходьбы

Нуклеазы цинкового пальца состоят из ДНК-связывающих доменов, которые могут точно нацелиться на последовательность ДНК. ^{[ 6 ]} Каждый цинковый пальцев может распознавать кодоны желаемой последовательности ДНК и, следовательно, может быть модульно собрано, чтобы связываться с определенной последовательности. ^{[ 8 ]} Эти связывающие домены связаны с ограничительной эндонуклеазой , которая может вызвать двойной прорыв (DSB) в ДНК. ^{[ 6 ]} Процессы восстановления могут вводить мутации, которые разрушают функциональность гена. ^{[ Цитация необходима ]}

Речь

Активатор-активаторные эффекторные нуклеазы ( TALENS ) также содержат домен связывания ДНК и нуклеазу, которая может расщеплять ДНК. ^{[ 9 ]} Область связывания ДНК состоит из аминокислотных повторов, каждый из которых распознает одну пару оснований желаемой целевой последовательности ДНК. ^{[ 8 ]} Если это расщепление нацелено на область кодирования генов, а NEJ-опосредованный восстановление вводит вставки и делеции, часто возникает мутация фрэм-сдвига, тем самым нарушая функцию гена. ^{[ 9 ]}

CRISPR/CAS9

CRISPR (кластеризированный регулярно межсетенной короткие палиндромные повтора) - это метод генотической инженерии, который позволяет точно редактировать геном. Одним из применений CRISPR является нокаут генов, который включает в себя отключение или «выбивание» специфического гена в организме. ^{[ Цитация необходима ]}

Процесс нокаута гена с CRISPR включает в себя три основных этапа: проектирование направляющей РНК (GRNA), которая нацелена на определенное место в геноме, доставляя GRNA и фермент CAS9 (который действует как молекулярные ножницы), а затем и затем позволяя клетке восстанавливать разреза в ДНК. Когда клетки ремонтируют разрез, он может соединиться либо с разрезом, что приводит к нефункциональному гену, либо ввести мутацию, которая нарушает функцию гена.

Этот метод может быть использован в различных организмах, включая бактерии, дрожжи, растения и животных, и он позволяет ученым изучать функцию специфических генов, наблюдая за последствиями их отсутствия. Нокаут гена на основе CRISPR-это мощный инструмент для понимания генетической основы заболевания и разработки новых методов лечения.

Важно отметить, что нокаут генов на основе CRISPR, как и любой метод генотического инженера, обладает потенциалом для создания непреднамеренного или вредного воздействия на организм, поэтому его следует использовать с осторожностью. ^{[ 8 ]}^{[ 10 ]} Связанный CAS9 вызовет двойной перерыв в ДНК. ^{[ 8 ]} В соответствии с тем же принципом, что и цинковые, и Talens, попытки восстановить эти двойные перерывы часто приводят к мутациям сдвига кадров, которые приводят к нефункциональному геном. ^{[ 8 ]} Неинвазивная технология CRISPR-CAS9 успешно выбила ген, связанный с депрессией и тревогой у мышей, будучи первой успешной доставкой, проходящей через барьер крови-мозга , чтобы обеспечить модификацию генов. ^{[ 11 ]}

Нокауть

Gene Knock-in аналогичен нокауту гена, но заменяет ген другим, а не удаляет его. ^{[ Цитация необходима ]}

Типы

Условные нокауты

Условный нокаут генов допускает делецию гена в ткани специфическим образом. Это требуется вместо нокаута гена, если нулевая мутация приведет к эмбриональной смерти , ^{[ 12 ]} или конкретный тип ткани или клеток представляет особого интереса. Это делается путем введения коротких последовательностей, называемых сайтами LOXP вокруг гена. Эти последовательности будут введены в зародышевую линию через тот же механизм, что и нокаут. Эта зародышевая линия может быть затем пересекается на другую зародышевую линию, содержащую крекобиназу , которая представляет собой вирусный фермент, который может распознавать эти последовательности, рекомбинирует их и удаляет ген, окруженный этими сайтами. ^{[ Цитация необходима ]}

Гены, не участвующие в раннем развитии, были эффективно изучены с использованием нокаутных подходов, которые используют делецию генов. Однако, как правило, невозможно сбить гены, которые активны во время раннего развития, без организма, страдающего от смертельного исхода. Одним из методов вокруг этого является условное нокаут. Используя специфическую рекомбиназу, называемую CRE, исходную методику условного нокаута, рекомбинированная короткие целевые последовательности, известные как LOXP. С тех пор другие рекомбиназы были созданы и использованы в условных экспериментах по нокауту. ^{[ Цитация необходима ]}

Использовать

( Нокаутирующая мышь слева), которая является моделью ожирения по сравнению с нормальной мышью

Нокауты в первую очередь используются для понимания роли конкретной области гена или ДНК , сравнивая нокаутный организм с дикой природой с аналогичным генетическим фоном. ^{[ Цитация необходима ]}

Нокаутные организмы также используются в качестве инструментов скрининга при разработке лекарств , для нацеливания на конкретные биологические процессы или недостатки с использованием определенного нокаута или для понимания механизма действия препарата охватывающих с помощью библиотеки нокаутных организмов, весь геном , такой как в Saccharomyces cerevisiae . ^{[ 13 ]}

Смотрите также

Ссылки

^ Griffiths AJ, Miller JH, Suzuki DT, Lewontin WC, Gelbart WM (2000). Введение в генетический анализ (7 -е изд.). Нью -Йорк: WH Freeman. ISBN 978-0-7167-3771-1 .
^ Гамильтон CM, Aldea M, Washburn BK, Babitzke P, Kushner SR (сентябрь 1989 г.). «Новый метод генерации делеций и замены генов в Escherichia coli » . Журнал бактериологии . 171 (9): 4617–4622. doi : 10.1128/jb.171.9.4617-4622.1989 . PMC 210259 . PMID 2548993 .
^ Хуан, Лей; и др. (Январь 2018). «Критическая роль белков XIRP в сердечной проводимости и их редкие варианты, выявленные в внезапном необъяснимом синдроме ночной смерти и синдроме Бругада в китайской популяции Хань» . J. Am. Heart Assoc . 7 (1). doi : 10.1161/jaha.117.006320 .
^ «Нобелевская премия по физиологии или медицине 2007» . Нобелевский фонд . Получено 15 декабря 2008 года .
^ Jump up to: ^а ^{беременный} ^в Холл, Брэдфорд; ЛИМАЙ, АВТОР; Kulkarni, Ashok B. (2009-09-01). «Обзор: генерация мышей, нокаутированных по генам» . Текущие протоколы в клеточной биологии . 44 Wiley-Blackwell: блок 19.12 19.12.1–17. doi : 10.1002/0471143030.cb1912S44 . ISBN 978-0471143031 Полем PMC 2782548 . PMID 19731224 .
^ Jump up to: ^а ^{беременный} ^в ^{дюймовый} ^и Сантьяго, Иоланда; Чан, Эдмонд; Лю, Пей-цес; Орландо, Сальваторе; Чжан, Лин; Урнов, Фёдор Д.; Холмс, Майкл С.; Гашин, Дмитрий; Уэйт, Адам (2008-04-15). «Целевой нокаут генов в клетках млекопитающих с использованием инженерных нуклеаз цинкового пальца» . Труды Национальной академии наук . 105 (15): 5809–5814. doi : 10.1073/pnas.0800940105 . ISSN 0027-8424 . PMC 2299223 . PMID 18359850 .
^ Egener T, Granado J, Guitton MC, Hohe A, Holtorf H, Lucht JM, et al. (2002). «Высокая частота фенотипических отклонений в растениях Physcomiterlla Patens, трансформированных библиотекой взрывов генов» . BMC Биология растений . 2 (1): 6. doi : 10.1186/1471-2229-2-6 . PMC 117800 . PMID 12123528 .
^ Jump up to: ^а ^{беременный} ^в ^{дюймовый} ^и Гадж, Томас; Герсбах, Чарльз А.; Барбас, Карлос Ф. (2013). «Методы ZFN, Talen и CRISPR/CAS для инженерии генома» . Тенденции в биотехнологии . 31 (7): 397–405. doi : 10.1016/j.tibtech.2013.04.004 . PMC 3694601 . PMID 23664777 .
^ Jump up to: ^а ^{беременный} Joung, J. Keith; Сандер, Джеффри Д. (январь 2013 г.). «Talens: широко применимая технология для целевого редактирования генома» . Природа обзор молекулярной клеточной биологии . 14 (1): 49–55. doi : 10.1038/nrm3486 . ISSN 1471-0080 . PMC 3547402 . PMID 23169466 .
^ Ni, wei ; / Cas9 System " . PLOS ONE . 9 (9): E106718. Bibcode : 2014ploso ... 9J6718N . DOI : 10.1371/ Journal.pone.0106718 ISSN 1932-6203 . PMC 4154755. PMID ::: ::::::::::::::::: ::::::::::::::::: ::::::::::::::: :::::: 25188313 . .
^ «Первый в своем роде неинвазивный метод CRISPR выбивает ген тревоги» . Новый Атлас . 2023-06-21 . Получено 2024-01-18 .
^ Ле, Юньчжэн; Sauer, Brian (2001-03-01). «Условный нокаут генов с использованием рекомбиназы CRE». Молекулярная биотехнология . 17 (3): 269–275. doi : 10.1385/mb: 17: 3: 269 . ISSN 1073-6085 . PMID 11434315 . S2CID 41578035 .
^ "DeastDeletionWebPages" . Архивировано с оригинала 29 сентября 2012 года . Получено 21 февраля 2017 года .

Внешние ссылки

[1] Griffiths AJ, Miller JH, Suzuki DT, Lewontin WC, Gelbart WM (2000). Введение в генетический анализ (7 -е изд.). Нью -Йорк: WH Freeman. ISBN 978-0-7167-3771-1 .

[Hamilton-2] Гамильтон CM, Aldea M, Washburn BK, Babitzke P, Kushner SR (сентябрь 1989 г.). «Новый метод генерации делеций и замены генов в Escherichia coli » . Журнал бактериологии . 171 (9): 4617–4622. doi : 10.1128/jb.171.9.4617-4622.1989 . PMC 210259 . PMID 2548993 .

[Huang-3] Хуан, Лей; и др. (Январь 2018). «Критическая роль белков XIRP в сердечной проводимости и их редкие варианты, выявленные в внезапном необъяснимом синдроме ночной смерти и синдроме Бругада в китайской популяции Хань» . J. Am. Heart Assoc . 7 (1). doi : 10.1161/jaha.117.006320 .

[Nobel_2007-4] «Нобелевская премия по физиологии или медицине 2007» . Нобелевский фонд . Получено 15 декабря 2008 года .

[Hall-5] Jump up to: ^а ^{беременный} ^в Холл, Брэдфорд; ЛИМАЙ, АВТОР; Kulkarni, Ashok B. (2009-09-01). «Обзор: генерация мышей, нокаутированных по генам» . Текущие протоколы в клеточной биологии . 44 Wiley-Blackwell: блок 19.12 19.12.1–17. doi : 10.1002/0471143030.cb1912S44 . ISBN 978-0471143031 Полем PMC 2782548 . PMID 19731224 .

[:1-6] Jump up to: ^а ^{беременный} ^в ^{дюймовый} ^и Сантьяго, Иоланда; Чан, Эдмонд; Лю, Пей-цес; Орландо, Сальваторе; Чжан, Лин; Урнов, Фёдор Д.; Холмс, Майкл С.; Гашин, Дмитрий; Уэйт, Адам (2008-04-15). «Целевой нокаут генов в клетках млекопитающих с использованием инженерных нуклеаз цинкового пальца» . Труды Национальной академии наук . 105 (15): 5809–5814. doi : 10.1073/pnas.0800940105 . ISSN 0027-8424 . PMC 2299223 . PMID 18359850 .

[Egener_2002-7] Egener T, Granado J, Guitton MC, Hohe A, Holtorf H, Lucht JM, et al. (2002). «Высокая частота фенотипических отклонений в растениях Physcomiterlla Patens, трансформированных библиотекой взрывов генов» . BMC Биология растений . 2 (1): 6. doi : 10.1186/1471-2229-2-6 . PMC 117800 . PMID 12123528 .

[:2-8] Jump up to: ^а ^{беременный} ^в ^{дюймовый} ^и Гадж, Томас; Герсбах, Чарльз А.; Барбас, Карлос Ф. (2013). «Методы ZFN, Talen и CRISPR/CAS для инженерии генома» . Тенденции в биотехнологии . 31 (7): 397–405. doi : 10.1016/j.tibtech.2013.04.004 . PMC 3694601 . PMID 23664777 .

[:3-9] Jump up to: ^а ^{беременный} Joung, J. Keith; Сандер, Джеффри Д. (январь 2013 г.). «Talens: широко применимая технология для целевого редактирования генома» . Природа обзор молекулярной клеточной биологии . 14 (1): 49–55. doi : 10.1038/nrm3486 . ISSN 1471-0080 . PMC 3547402 . PMID 23169466 .

[10] Ni, wei ; / Cas9 System " . PLOS ONE . 9 (9): E106718. Bibcode : 2014ploso ... 9J6718N . DOI : 10.1371/ Journal.pone.0106718 ISSN 1932-6203 . PMC 4154755. PMID ::: ::::::::::::::::: ::::::::::::::::: ::::::::::::::: :::::: 25188313 . .

[11] «Первый в своем роде неинвазивный метод CRISPR выбивает ген тревоги» . Новый Атлас . 2023-06-21 . Получено 2024-01-18 .

[12] Ле, Юньчжэн; Sauer, Brian (2001-03-01). «Условный нокаут генов с использованием рекомбиназы CRE». Молекулярная биотехнология . 17 (3): 269–275. doi : 10.1385/mb: 17: 3: 269 . ISSN 1073-6085 . PMID 11434315 . S2CID 41578035 .

[13] "DeastDeletionWebPages" . Архивировано с оригинала 29 сентября 2012 года . Получено 21 февраля 2017 года .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]

[ 11 ]

[ 12 ]

[ 13 ]