Цикл мочевины

Цикл мочевины (также известный как орнитиновый цикл ) — это цикл биохимических реакций, в ходе которых образуется мочевина (NH ₂ ) ₂ CO из аммиака (NH ₃ ). Животные, использующие этот цикл, главным образом земноводные и млекопитающие, называются уреотелическими .

Цикл мочевины преобразует высокотоксичный аммиак в мочевину для выведения. ^{[ 1 ]} Этот цикл был первым метаболическим циклом, открытым Гансом Кребсом и Куртом Хензелейтом в 1932 году. ^{[ 2 ]}^{[ 3 ]}^{[ 4 ]} за пять лет до открытия цикла ТСА . Более подробно цикл мочевины был описан позже Ратнером и Коэном. Цикл мочевины протекает преимущественно в печени и, в меньшей степени, в почках .

Функция

Катаболизм аминокислот приводит к образованию отходов аммиака. Всем животным нужен способ выведения этого продукта. Большинство водных организмов , или аммонотелических организмов, выделяют аммиак, не преобразуя его. ^{[ 1 ]} Организмы, которые не могут легко и безопасно удалить азот в виде аммиака, преобразуют его в менее токсичное вещество, такое как мочевина , посредством цикла мочевины, который происходит главным образом в печени. Мочевина, вырабатываемая печенью, затем попадает в кровоток , откуда попадает в почки и в конечном итоге выводится с мочой . Цикл мочевины важен для этих организмов, потому что, если азот или аммиак не выводятся из организма, это может быть очень вредным. ^{[ 5 ]} У видов, включая птиц и большинство насекомых , аммиак превращается в мочевую кислоту или ее уратную соль, которая выводится из организма в твердой форме . Кроме того, цикл мочевины потребляет углекислый газ кислых отходов путем объединения его с основным аммиаком, помогая поддерживать нейтральный pH.

Реакции

Весь процесс преобразует две аминогруппы, одну из NH. ⁺
₄ и один от аспартата и атом углерода от HCO ⁻
₃ , к относительно нетоксичному продукту выделения мочевины . ^{[ 6 ]} Это происходит за счет четырех «высокоэнергетических» фосфатных связей (3 АТФ гидролизуются до 2 АДФ и одной АМФ ). Преобразование аммиака в мочевину происходит в пять основных этапов. Первый необходим для поступления аммиака в цикл, а следующие четыре являются частью самого цикла. Для входа в цикл аммиак преобразуется в карбамоилфосфат . Цикл мочевины состоит из четырех ферментативных реакций: одной митохондриальной и трех цитозольных . ^{[ 1 ]}^{[ 7 ]} Для этого используются 6 ферментов. ^{[ 6 ]}^{[ 7 ]}^{[ 8 ]}

Реакции цикла мочевины
Шаг	Реагенты	Продукты	Катализируется	Расположение
1	NH ₃ + HCO ⁻ ₃ + 2 АТФ	карбамоилфосфат + 2 АДФ + P _i	ЦПС1	митохондрии
2	карбамоилфосфат + орнитин	цитруллин + _Пи	OTC , цинк, биотин	митохондрии
3	цитруллин + аспартат + АТФ	аргининосукцинат + AMP + PP _i	ЖОПА	цитозоль
4	аргининосукцинат	аргинин + фумарат	АСЛ	цитозоль
5	аргинин + Н ₂ О	орнитин + мочевина	ARG1 , марганец	цитозоль

Реакции цикла мочевины

1 л - орнитин
2 карбамоилфосфат
3 л - цитруллин
4 аргининосукцинат
5 фумарат
6 л – аргинин
7 мочевина
L - L- аспартат Asp
CPS-1 карбамоилфосфатсинтетаза I
OTC Орнитин-транскарбамоилаза
ASS аргининсукцинатсинтетаза
ASL аргининсукцинатлиаза
ARG1 аргиназа 1

Первая реакция: вступление в цикл мочевины

Перед началом цикла мочевины аммиак превращается в карбамоилфосфат. Реакция катализируется карбамоилфосфатсинтетазой I и требует участия двух молекул АТФ . ^{[ 1 ]} Затем карбамоилфосфат поступает в цикл мочевины.

Этапы цикла мочевины

Карбамоилфосфат превращается в цитруллин . При катализе орнитинтранскарбамилазой карбамоилфосфатная группа передается орнитину и высвобождает фосфатную группу. ^{[ 1 ]}
Реакция конденсации происходит между аминогруппой аспартата и карбонильной группой цитруллина с образованием аргининосукцината . Эта реакция является АТФ-зависимой и катализируется аргининосукцинатсинтетазой . ^{[ 1 ]}
Аргининосукцинат подвергается расщеплению аргининосукциназой с образованием аргинина и фумарата . ^{[ 1 ]}
Аргинин расщепляется аргиназой с образованием мочевины и орнитина. Затем орнитин транспортируется обратно в митохондрии, чтобы снова начать цикл мочевины. ^{[ 1 ]}^{[ 7 ]}

Общее уравнение реакции

В первой реакции NH ⁺
₄ + ОЗ ⁻
₃ эквивалентно NH ₃ + CO ₂ + H ₂ O .

Таким образом, общее уравнение цикла мочевины выглядит так:

NH ₃ + CO ₂ + аспартат + 3 АТФ + 3 H ₂ O → мочевина + фумарат + 2 АДФ + 2 P _i + AMP + PP _i + H ₂ O

Поскольку фумарат получают удалением NH ₃ из аспартата (посредством реакций 3 и 4), а PP _i + H ₂ O → 2 Pi _, уравнение можно упростить следующим образом:

2 NH ₃ + CO ₂ + 3 АТФ + 3 H ₂ O → мочевина + 2 АДФ + 4 P _i + АМФ

Обратите внимание, что реакции, связанные с циклом мочевины, также вызывают образование 2 НАДН , поэтому в целом реакция выделяет немного больше энергии, чем потребляет. НАДН производится двумя способами:

Одна молекула НАДН вырабатывается ферментом глутаматдегидрогеназой при превращении глутамата в аммоний и α-кетоглутарат . Глутамат является нетоксичным носителем аминогрупп. Это обеспечивает ион аммония, используемый при первоначальном синтезе карбамоилфосфата.
Фумарат, высвобождаемый в цитозоле, гидратируется до малата цитозольной фумаразой . Этот малат затем окисляется до оксалоацетата цитозольной малатдегидрогеназой , образуя восстановленный НАДН в цитозоле. Оксалоацетат является одной из кетокислот, предпочитаемых трансаминазами , и поэтому будет перерабатываться в аспартат , поддерживая поток азота в цикл мочевины.

Мы можем обобщить это, объединив реакции:

CO ₂ + глутамат + аспартат + 3 АТФ + 2 НАД ⁺+ 3 H ₂ O → мочевина + α-кетоглутарат + оксалоацетат + 2 АДФ + 2 P _i + AMP + PP _i + 2 НАДН

Два произведенных НАДН могут обеспечить энергию для образования 5 АТФ (цитозольный НАДН обеспечивает 2,5 АТФ с помощью малатно-аспартатного челнока в клетках печени человека), что является чистым производством двух высокоэнергетических фосфатных связей для цикла мочевины. Однако, если в цитозоле происходит глюконеогенез , последний восстанавливающий эквивалент используется для изменения стадии GAPDH вместо генерации АТФ.

Судьба оксалоацетата заключается либо в производстве аспартата посредством трансаминирования, либо в превращении в фосфоенолпируват , который является субстратом глюконеогенеза .

Продукты цикла мочевины

Как указано выше, многие позвоночные используют цикл мочевины для создания мочевины из аммония, чтобы аммоний не повреждал организм. Хотя это полезно, существуют и другие эффекты цикла мочевины. Например: потребление двух АТФ, производство мочевины, образование Н. ⁺, объединение ОХО − 3 и NH + 4 в формы, где он может быть регенерирован, и, наконец, потребление НХ + 4 . ^{[ 9 ]}

Регулирование

N -ацетилглутаминовая кислота

Синтез карбамоилфосфата и цикл мочевины зависят от присутствия N -ацетилглутаминовой кислоты (NAcGlu), которая аллостерически активирует CPS1 . NAcGlu является облигатным активатором карбамоилфосфатсинтетазы. ^{[ 10 ]} Синтез NAcGlu с помощью N -ацетилглутаматсинтазы (NAGS) стимулируется как Arg, аллостерическим стимулятором NAGS, так и Glu, продуктом реакций трансаминирования и одним из субстратов NAGS, уровень обоих из которых повышается при свободных аминокислот повышении уровня . Таким образом, Glu не только является субстратом для NAGS, но также служит активатором цикла мочевины.

Концентрации субстрата

Остальные ферменты цикла контролируются концентрациями их субстратов. Таким образом, унаследованный дефицит ферментов цикла, отличных от ARG1, не приводит к значительному снижению выработки мочевины (если какой-либо фермент цикла полностью отсутствует, смерть наступает вскоре после рождения). Скорее, субстрат дефицитного фермента накапливается, увеличивая скорость реакции дефицита до нормальной.

Однако аномальное накопление субстрата не обходится без затрат. Концентрации субстрата повышаются на всем пути обратного цикла до NH. ⁺
₄ , что приводит к гипераммониемии (повышение [ NH ⁺
₄ ] _П ).

Хотя основная причина NH ⁺
₄ токсичность до конца не выяснена, высокая [ NH ⁺
₄ ] оказывает огромную нагрузку на NH ⁺
_4- система очистки, особенно в головном мозге (симптомы недостаточности ферментов цикла мочевины включают умственную отсталость и вялость ). Эта система очистки включает GLUD1 и GLUL , которые уменьшают пулы 2-оксоглутарата (2OG) и Glu. Мозг наиболее чувствителен к истощению этих пулов. Истощение 2OG снижает уровень TCAC , тогда как Glu является одновременно нейромедиатором и предшественником GABA , другого нейромедиатора. [1] (стр.734)

Связь с циклом лимонной кислоты

Цикл мочевины и цикл лимонной кислоты являются независимыми циклами, но связаны между собой. Один из атомов азота в цикле мочевины получается в результате переаминирования оксалоацетата в аспартат. ^{[ 11 ]} Фумарат, образующийся на третьем этапе, также является промежуточным продуктом цикла лимонной кислоты и возвращается в этот цикл. ^{[ 11 ]}

Нарушения цикла мочевины

Нарушения цикла мочевины встречаются редко и затрагивают примерно одного из 35 000 человек в Соединенных Штатах . ^{[ 12 ]} Могут возникнуть генетические дефекты ферментов, участвующих в цикле, которые обычно проявляются в течение нескольких дней после рождения. ^{[ 5 ]} Недавно родившийся ребенок обычно испытывает различные приступы рвоты и периоды летаргии . ^{[ 5 ]} В конечном итоге младенец может впасть в кому и получить повреждение головного мозга . ^{[ 5 ]} Новорожденные с UCD подвергаются гораздо более высокому риску осложнений или смерти из-за несвоевременных скрининговых тестов и неправильно диагностированных случаев. Наиболее частым ошибочным диагнозом является неонатальный сепсис . Признаки UCD могут присутствовать в течение первых 2–3 дней жизни, но существующий метод получения подтверждения по результатам анализов может занять слишком много времени. ^{[ 13 ]} Это потенциально может вызвать такие осложнения, как кома или смерть. ^{[ 13 ]}

Нарушения цикла мочевины также могут быть диагностированы у взрослых, и симптомы могут включать делирия эпизоды , летаргию и симптомы, подобные симптомам инсульта . ^{[ 14 ]} Помимо этих симптомов, если цикл мочевины в печени начинает нарушаться , у пациента может развиться цирроз печени . ^{[ 15 ]} Это также может привести к саркопении (потере мышечной массы). ^{[ 15 ]} Мутации приводят к дефициту различных ферментов и транспортеров, участвующих в цикле мочевины, и вызывают нарушения цикла мочевины. ^{[ 1 ]} Если люди с дефектом любого из шести ферментов, используемых в цикле, потребляют аминокислоты сверх того, что необходимо для минимальной суточной потребности, то образующийся аммиак не сможет преобразоваться в мочевину. У этих людей может наблюдаться гипераммониемия или накопление промежуточного продукта цикла.

Индивидуальные расстройства

Дефицит N-ацетилглутаматсинтазы (NAGS)
Дефицит карбамоилфосфатсинтетазы (CPS)
Дефицит орнитинтранскарбамоилазы (ОТС)
Цитруллинемия I типа (дефицит синтазы аргининоянтарной кислоты)
Аргининоянтарная ацидурия (дефицит лиазы аргининоянтарной кислоты)
Аргининемия (дефицит аргиназы)
Гиперорнитинемия, гипераммониемия, синдром гомоцитруллинурии (ГГГ) (дефицит митохондриального переносчика орнитина) ^{[ 8 ]}^{[ 16 ]}

Все дефекты цикла мочевины, за исключением дефицита ОТС, наследуются по аутосомно-рецессивному типу. Дефицит ОТК наследуется как Х-сцепленное рецессивное заболевание, хотя у некоторых женщин могут проявляться симптомы. Большинство нарушений цикла мочевины связаны с гипераммониемией , однако аргининемия и некоторые формы аргининоянтарной ацидурии не сопровождаются повышенным содержанием аммиака.

Дополнительные изображения

Цикл мочевины.
Цветной цикл мочевины.

Ссылки

^ Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час ^я Кокс, Майкл (1 января 2013 г.). Ленингерские принципы биохимии . Фриман. ISBN 9781429234146 . OCLC 901647690 .
^ Кребс, Ганс Адольф ; Хенселейт, Курт (1932). «Исследования образования мочевины в организме животных». Клинический еженедельник . 11 (18): 757–759. дои : 10.1007/bf01757657 .
^ Кребс, Ганс Адольф ; Хенселейт, Курт (1932). «Исследования образования мочевины в организме животных. II». Клинический еженедельник . 11 (27): 1137–1139. дои : 10.1007/BF01758220 .
^ Кребс, Ганс Адольф ; Хенселейт, Курт (1932). «Исследования образования мочевины в организме животных». Журнал физиологической химии Хоппе-Зейлера . 210 (1–2): 33–66. дои : 10.1515/bchm2.1932.210.1-2.33 .
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д Тимочко, Джон Л.; Берг, Джереми М.; Страйер, Люберт (2013). БИОХИМИЯ Краткий курс . WH Freeman and Company, Нью-Йорк. п. 529. ИСБН 978-1-4292-8360-1 .
^ Перейти обратно: ^а ^б Мяу, Николас Ах; Паппа, Мария Белен; Гропман, Андреа Л. (01 января 2015 г.), Розенберг, Роджер Н.; Паскуаль, Хуан М. (ред.), «Глава 57 - Нарушения цикла мочевины» , Молекулярные и генетические основы неврологических и психиатрических заболеваний Розенберга (пятое издание) , Бостон: Academic Press, стр. 633–647, doi : 10.1016/b978 -0-12-410529-4.00057-7 , ISBN 978-0-12-410529-4 , получено 10 ноября 2020 г.
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с Уокер, Валери (01 января 2014 г.), Маковски, Грегори С. (редактор), «Глава третья - Метаболизм аммиака и гипераммониемические расстройства» , «Достижения в клинической химии» , 67 , Elsevier: 73–150, doi : 10.1016/bs .acc.2014.09.002 , PMID 25735860 , получено 10 ноября 2020 г.
^ Перейти обратно: ^а ^б Перл, Филлип Л. (01 января 2017 г.), Суэйман, Кеннет Ф.; Ашвал, Стивен; Ферриеро, Донна М .; Шор, Нина Ф. (ред.), «76 – Наследственные метаболические эпилепсии» , Детская неврология Сваймана (шестое издание) , Elsevier, стр. 594–599, doi : 10.1016/b978-0-323-37101-8.00076-x , ISBN 978-0-323-37101-8 , получено 10 ноября 2020 г.
^ Аткинсон, Дэниел (20 сентября 1991 г.). «Функциональная роль мочевины у позвоночных». Физиологическая зоология . 65 (2) (2-е изд.). Лос-Анджелес: Издательство Чикагского университета: 243–267. дои : 10.1086/physzool.65.2.30158252 . JSTOR 30158252 . S2CID 87121092 .
^ Kaplan Medical USMLE, шаг 1, конспект лекций по биохимии и медицинской генетике, 2010 г., стр. 261
^ Перейти обратно: ^а ^б Шамбо, GE (1 декабря 1977 г.). «Биосинтез мочевины I. Цикл мочевины и связь с циклом лимонной кислоты» . Американский журнал клинического питания . 30 (12): 2083–2087. дои : 10.1093/ajcn/30.12.2083 . ISSN 0002-9165 . ПМИД 337792 .
^ Итог, Маршалл Л.; Келькер, Стефан; Фриденберг, Дебра; Ле Монс, Синтия; Хаберле, Йоханнес; Ли, Хе Сын; Кирмсе, Брайан (2013). «Частота нарушений цикла мочевины» . Молекулярная генетика и обмен веществ . 110 (1–2): 179–180. дои : 10.1016/j.ymgme.2013.07.008 . ISSN 1096-7192 . ПМЦ 4364413 . ПМИД 23972786 .
^ Перейти обратно: ^а ^б Мерритт, Дж.Л.; Броуди, LL; Пино, Г.; Ринальдо, П. (2018). «Скрининг новорожденных на нарушения проксимального цикла мочевины: современные данные, подтверждающие рекомендации по скринингу новорожденных». Молекулярная генетика и обмен веществ . 124 (2): 109–113. дои : 10.1016/j.ymgme.2018.04.006 . ПМИД 29703588 . S2CID 13858458 .
^ Джадд, Сандра (2010). Справочник по генетическим расстройствам . Омниграфика. п. 225. ИСБН 978-0-7808-1076-1 .
^ Перейти обратно: ^а ^б Цю, Цзя (9 июля 2013 г.). «Гипераммониемия при циррозе печени индуцирует транскрипционную регуляцию миостатина с помощью NF-κB-опосредованного механизма» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 110 (45). Национальная академия наук: 18162–18167. Бибкод : 2013PNAS..11018162Q . дои : 10.1073/pnas.1317049110 . JSTOR 23754730 . ПМЦ 3831479 . ПМИД 24145431 .
^ Смит, Л.Д.; Гарг, У. (01 января 2017 г.), Гарг, Уттам; Смит, Лори Д. (ред.), «Глава 5: Цикл мочевины и другие нарушения гипераммониемии» , Биомаркеры врожденных ошибок метаболизма , Сан-Диего: Elsevier, стр. 103–123, doi : 10.1016/b978-0-12 -802896-4.00004-3 , ISBN 978-0-12-802896-4 , получено 10 ноября 2020 г.

Внешние ссылки

Химическая логика цикла мочевины
Базовая нейрохимия - аминокислотные нарушения

[:0-1] Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час ^я Кокс, Майкл (1 января 2013 г.). Ленингерские принципы биохимии . Фриман. ISBN 9781429234146 . OCLC 901647690 .

[Krebs1932a-2] Кребс, Ганс Адольф ; Хенселейт, Курт (1932). «Исследования образования мочевины в организме животных». Клинический еженедельник . 11 (18): 757–759. дои : 10.1007/bf01757657 .

[Krebs1932b-3] Кребс, Ганс Адольф ; Хенселейт, Курт (1932). «Исследования образования мочевины в организме животных. II». Клинический еженедельник . 11 (27): 1137–1139. дои : 10.1007/BF01758220 .

[Krebs1932c-4] Кребс, Ганс Адольф ; Хенселейт, Курт (1932). «Исследования образования мочевины в организме животных». Журнал физиологической химии Хоппе-Зейлера . 210 (1–2): 33–66. дои : 10.1515/bchm2.1932.210.1-2.33 .

[:122-5] Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д Тимочко, Джон Л.; Берг, Джереми М.; Страйер, Люберт (2013). БИОХИМИЯ Краткий курс . WH Freeman and Company, Нью-Йорк. п. 529. ИСБН 978-1-4292-8360-1 .

[:2-6] Перейти обратно: ^а ^б Мяу, Николас Ах; Паппа, Мария Белен; Гропман, Андреа Л. (01 января 2015 г.), Розенберг, Роджер Н.; Паскуаль, Хуан М. (ред.), «Глава 57 - Нарушения цикла мочевины» , Молекулярные и генетические основы неврологических и психиатрических заболеваний Розенберга (пятое издание) , Бостон: Academic Press, стр. 633–647, doi : 10.1016/b978 -0-12-410529-4.00057-7 , ISBN 978-0-12-410529-4 , получено 10 ноября 2020 г.

[:3-7] Перейти обратно: ^а ^б ^с Уокер, Валери (01 января 2014 г.), Маковски, Грегори С. (редактор), «Глава третья - Метаболизм аммиака и гипераммониемические расстройства» , «Достижения в клинической химии» , 67 , Elsevier: 73–150, doi : 10.1016/bs .acc.2014.09.002 , PMID 25735860 , получено 10 ноября 2020 г.

[:4-8] Перейти обратно: ^а ^б Перл, Филлип Л. (01 января 2017 г.), Суэйман, Кеннет Ф.; Ашвал, Стивен; Ферриеро, Донна М .; Шор, Нина Ф. (ред.), «76 – Наследственные метаболические эпилепсии» , Детская неврология Сваймана (шестое издание) , Elsevier, стр. 594–599, doi : 10.1016/b978-0-323-37101-8.00076-x , ISBN 978-0-323-37101-8 , получено 10 ноября 2020 г.

[9] Аткинсон, Дэниел (20 сентября 1991 г.). «Функциональная роль мочевины у позвоночных». Физиологическая зоология . 65 (2) (2-е изд.). Лос-Анджелес: Издательство Чикагского университета: 243–267. дои : 10.1086/physzool.65.2.30158252 . JSTOR 30158252 . S2CID 87121092 .

[10] Kaplan Medical USMLE, шаг 1, конспект лекций по биохимии и медицинской генетике, 2010 г., стр. 261

[:1-11] Перейти обратно: ^а ^б Шамбо, GE (1 декабря 1977 г.). «Биосинтез мочевины I. Цикл мочевины и связь с циклом лимонной кислоты» . Американский журнал клинического питания . 30 (12): 2083–2087. дои : 10.1093/ajcn/30.12.2083 . ISSN 0002-9165 . ПМИД 337792 .

[12] Итог, Маршалл Л.; Келькер, Стефан; Фриденберг, Дебра; Ле Монс, Синтия; Хаберле, Йоханнес; Ли, Хе Сын; Кирмсе, Брайан (2013). «Частота нарушений цикла мочевины» . Молекулярная генетика и обмен веществ . 110 (1–2): 179–180. дои : 10.1016/j.ymgme.2013.07.008 . ISSN 1096-7192 . ПМЦ 4364413 . ПМИД 23972786 .

[:5-13] Перейти обратно: ^а ^б Мерритт, Дж.Л.; Броуди, LL; Пино, Г.; Ринальдо, П. (2018). «Скрининг новорожденных на нарушения проксимального цикла мочевины: современные данные, подтверждающие рекомендации по скринингу новорожденных». Молекулярная генетика и обмен веществ . 124 (2): 109–113. дои : 10.1016/j.ymgme.2018.04.006 . ПМИД 29703588 . S2CID 13858458 .

[14] Джадд, Сандра (2010). Справочник по генетическим расстройствам . Омниграфика. п. 225. ИСБН 978-0-7808-1076-1 .

[:6-15] Перейти обратно: ^а ^б Цю, Цзя (9 июля 2013 г.). «Гипераммониемия при циррозе печени индуцирует транскрипционную регуляцию миостатина с помощью NF-κB-опосредованного механизма» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 110 (45). Национальная академия наук: 18162–18167. Бибкод : 2013PNAS..11018162Q . дои : 10.1073/pnas.1317049110 . JSTOR 23754730 . ПМЦ 3831479 . ПМИД 24145431 .

[16] Смит, Л.Д.; Гарг, У. (01 января 2017 г.), Гарг, Уттам; Смит, Лори Д. (ред.), «Глава 5: Цикл мочевины и другие нарушения гипераммониемии» , Биомаркеры врожденных ошибок метаболизма , Сан-Диего: Elsevier, стр. 103–123, doi : 10.1016/b978-0-12 -802896-4.00004-3 , ISBN 978-0-12-802896-4 , получено 10 ноября 2020 г.

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]

[ 11 ]

[ 12 ]

[ 13 ]

[ 14 ]

[ 15 ]

[ 16 ]