Плазматическая мембрана Ca ²⁺ АТФаза

Плазматическая мембрана Ca ²⁺ АТФаза ( PMCA ) — транспортный белок в плазматической мембране клеток , который действует как кальциевый насос для удаления кальция (Ca ²⁺) из клетки. Функция PMCA жизненно важна для регулирования количества Ca. ²⁺ внутри всех эукариотических клеток. ^{[ 1 ]}^{[ 2 ]} Существует очень большой трансмембранный электрохимический градиент Са. ²⁺ стимулируя проникновение иона в клетки, однако очень важно, чтобы они поддерживали низкие концентрации Ca ²⁺ для правильной передачи сигналов соты . Таким образом, клеткам необходимо использовать ионные насосы для удаления кальция. ²⁺. ^{[ 3 ]} PMCA и натрий-кальциевый обменник (NCX) вместе являются основными регуляторами внутриклеточного кальция. ²⁺ концентрации. ^{[ 2 ]} Поскольку он переносит Ca ²⁺ во внеклеточное пространство, PMCA также является важным регулятором концентрации кальция во внеклеточном пространстве . ^{[ 4 ]}

PMCAs принадлежат к семейству первичных ионтранспортных АТФаз P-типа , которые образуют промежуточные аспартилфосфаты. ^{[ 2 ]}

Различные формы PMCA экспрессируются в разных тканях , включая мозг . ^{[ 5 ]}

Действия

Насос работает за счет гидролиза аденозинтрифосфата ( АТФ ) со стехиометрией одного Ca. ²⁺ ион удаляется на каждую гидролизованную молекулу АТФ. Он прочно связывается с Ca ²⁺ ионы (обладает высоким сродством, с K _m от 100 до 200 нМ ), но не удаляет Ca ²⁺ очень быстрыми темпами. ^{[ 6 ]} В этом отличие от NCX , который имеет низкое сродство и высокую емкость. Таким образом, PMCA эффективно связывает Ca. ²⁺ даже когда его концентрация внутри клетки очень низка, поэтому он подходит для поддержания Ca ²⁺ обычно на очень низком уровне. ^{[ 3 ]} Кальций является важным вторичным мессенджером , поэтому его уровень в клетках должен поддерживаться на низком уровне, чтобы предотвратить шум и обеспечить точность передачи сигналов. ^{[ 7 ]} NCX лучше подходит для удаления больших количеств кальция. ²⁺ быстро, как это необходимо нейронам после потенциала действия . Таким образом, деятельность двух типов насосов дополняет друг друга.

PMCA действует аналогично другим ионным насосам p-типа. ^{[ 3 ]} АТФ переносит фосфат на PMCA, который образует фосфорилированный промежуточный продукт. ^{[ 3 ]}

Что ²⁺/ кальмодулин связывает и дополнительно активирует PMCA, увеличивая сродство Ca белка. ²⁺- сайт связывания 20-30 раз. ^{[ 6 ]} Кальмодулин также увеличивает скорость, с которой насос выдавливает Ca. ²⁺ из клетки, возможно, до десятикратного. ^{[ 3 ]}

Было высказано предположение, что в тканях головного мозга определенные типы PMCA важны для регуляции синаптической активности, поскольку PMCA участвует в регулировании количества кальция внутри клетки в синапсе. ^{[ 5 ]} и Ca ²⁺ участвует в высвобождении синаптических пузырьков . Кроме того, было показано, что активность PMCA модулируется и частично обеспечивается гликолизом в соматах и дендритах нейронов . ^{[ 8 ]} По-видимому, это связано с близостью ПМКА к транспортерам глюкозы в плазматической мембране.

Структура

Структура PMCA аналогична структуре кальциевых насосов SERCA , которые отвечают за удаление кальция из цитоплазмы в просвет саркоплазматической сети . ^{[ 2 ]} Кальций имеет тенденцию иметь несколько более низкое сродство к насосам PMCA, чем к насосам SERCA. ^{[ 9 ]} Считается, что насос PMCA имеет 10 сегментов, пересекающих плазматическую мембрану, причем C- и N-концы находятся внутри клетки. ^{[ 2 ]} На С-конце имеется длинный «хвост» от 70 до 200 аминокислот . длиной ^{[ 2 ]} Считается, что этот хвост отвечает за регулирование насоса. ^{[ 2 ]} Насосы из ПМКА имеют молекулярную массу около 140 кДа . ^{[ 10 ]}

Изоформы

Существует четыре изоформы PMCA, называемые PMCA с 1 по 4. ^{[ 5 ]}

ATP2B1 -PMCA1
ATP2B2 -PMCA2
ATP2B3 -PMCA3
ATP2B4 -PMCA4

Каждая изоформа кодируется отдельным геном и экспрессируется в разных частях тела. ^{[ 5 ]} Поочередный сплайсинг транскриптов мРНК этих генов приводит к образованию разных подтипов этих изоформ. ^{[ 2 ]} На данный момент идентифицировано более 20 вариантов сплайсинга. ^{[ 2 ]}

Три изоформы PMCA: PMCA1, PMCA2 и PMCA3 встречаются в головном мозге в различных распределениях. ^{[ 6 ]} PMCA1 повсеместно присутствует во всех тканях человека, и без него эмбрионы не выживают. ^{[ 4 ]} Отсутствие PMCA4, которое также очень часто встречается во многих тканях, можно пережить, но оно приводит к бесплодию у мужчин. ^{[ 4 ]} Типы PMCA 2 и 3 активируются быстрее и, следовательно, лучше подходят для типов возбудимых клеток, например, клеток нервной и мышечной ткани, которые испытывают большие притоки кальция. ²⁺ когда взволнован. ^{[ 5 ]} Типы PMCA 1, 2 и 4 были обнаружены в глиальных клетках, называемых астроцитами , у млекопитающих, хотя ранее считалось, что в глии присутствует только NCX. ^{[ 11 ]} Астроциты помогают поддерживать ионный баланс во внеклеточном пространстве головного мозга.

Нокаут PMCA2 вызывает проблемы с внутренним ухом , включая потерю слуха и проблемы с равновесием . ^{[ 12 ]}

PMCA4 существует в кавеолах . ^{[ 12 ]} Изоформа PMCA4b взаимодействует с синтазой оксида азота и снижает синтез оксида азота этим ферментом . ^{[ 12 ]}

Изоформа PMCA 4 имеет молекулярную массу 134 683, рассчитанную по ее последовательности. ^{[ 13 ]} Это хорошо согласуется с результатами гель-электрофореза в ДСН. ^{[ 14 ]}

Патология

Когда PMCA не функционирует должным образом, может возникнуть заболевание. Было обнаружено, что неправильное функционирование белков PMCA связано с такими состояниями, как нейросенсорная глухота , диабет и гипертония . ^{[ 4 ]}

При эксайтотоксичности — процессе, при котором чрезмерное количество нейромедиатора глутамата сверхактивирует нейроны , что приводит к чрезмерному притоку кальция. ²⁺ в клетки активность PMCA может оказаться недостаточной для удаления избытка Ca ²⁺.

В молочной железы ткани эпителиальные клетки молочной железы экспрессируют PMCA2, который транспортирует кальций через апикальную поверхность клеток в молоко . Экспрессия PMCA2 снижается при отъеме от груди , что приводит к кальций-индуцированному апоптозу и инволюции молочной железы . Постоянная экспрессия PMCA2 при некоторых видах рака молочной железы снижает уровень кальция внутри злокачественных клеток, позволяя им избежать апоптоза. Эти опухоли также обычно положительны по белку HER2 , имеют тенденцию вовлекать лимфатические узлы и чаще встречаются среди молодых женщин, что может помочь объяснить их худший прогноз по сравнению с женщинами в постменопаузе. ^{[ 15 ]}

Куркумин может связываться с PMCA, вызывая конформационные изменения , которые препятствуют АТФ . связыванию ^{[ 16 ]}

История

PMCA были впервые обнаружены в 1960-х годах в мембранах эритроцитов . ^{[ 2 ]} Присутствие АТФазы в мембранах было обнаружено в 1961 году, а затем в 1966 году было обнаружено, что эти АТФазы перекачивают Са ²⁺ из цитозоля . ^{[ 3 ]}

PMCA был впервые очищен из мембран эритроцитов в 1979 году. ^{[ 17 ]}^{[ 18 ]}

Ссылки

^ Дженсен, Томас П.; Бакби, Люси Э.; Эмпсон, Рут М. (2004). «Экспрессия плазматической мембраны Ca ²⁺ Члены семейства АТФаз и связанные с ними синаптические белки в острых и культивируемых органотипических срезах гиппокампа крысы». Developmental Brain Research . 152 (2): 129–136. doi : 10.1016/j.devbrainres.2004.06.004 . PMID 15351500 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час ^я ^дж Стрелер, Эмануэль Э.; Захариас, Дэвид А. (2001). «Роль альтернативного сплайсинга в создании разнообразия изоформ среди кальциевых насосов плазматической мембраны». Физиол. Откр. 81 (1): 21–50. дои : 10.1152/physrev.2001.81.1.21 . ПМИД 11152753 . S2CID 9062253 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж Карафоли, Э. (1991). «Кальциевый насос плазматической мембраны». Физиол. Откр. 71 (1): 129–153. дои : 10.1152/physrev.1991.71.1.129 . ПМИД 1986387 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д Таларико, Эрнест Ф. младший; Кеннеди, Брайан Г.; Марфурт, Карл Ф.; Леффлер, Карин У.; Манджини, Нэнси Дж. (2005). «Экспрессия и иммунолокализация изоформ кальциевой АТФазы плазматической мембраны в эпителии роговицы человека» . Мол. Вис. 11 : 169–178. ПМИД 15765049 . Проверено 25 декабря 2013 г.
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и Дженсен, Томас П.; Филотео, Аделаида Г.; Кнопфель, Томас; Эмпсон, Рут М. (2006). «Изоформа 2а пресинаптической плазматической мембраны регулирует возбуждающую синаптическую передачу в СА3 гиппокампа крысы» . Дж. Физиол. 579 (1): 85–99. дои : 10.1113/jphysicalol.2006.123901 . ПМК 2075377 . ПМИД 17170045 . Проверено 13 января 2007 г.
^ Jump up to: ^а ^б ^с Альберс, Р. Уэйн; Сигел, Джордж Дж. (1999). «5. Мембранный транспорт» . В Сигеле, Джордже Дж.; и др. (ред.). Базовая нейрохимия: молекулярные, клеточные и медицинские аспекты (6-е изд.). Филадельфия: Липпинкотт-Рэйвен. АТФ-зависимые Ca2+-насосы. ISBN 978-0-397-51820-3 . ОСЛК 39013748 . Проверено 25 декабря 2013 г.
^ Бюретт, Ален; Вайнберг, Ричард Дж. (февраль 2007 г.). «Перисинаптическая организация кальциевых насосов плазматической мембраны в коре мозжечка». Дж. Комп. Нейрол. 500 (6) (опубликовано 20 декабря 2006 г.): 1127–1135. дои : 10.1002/cne.21237 . ПМИД 17183553 . S2CID 22110231 .
^ Иванников Максим Владимирович; Сугимори, Муцуюки; Ллинас, Родольфо Р. (2010). «Клиренс кальция и его энергетические потребности в нейронах мозжечка» . Клеточный кальций . 47 (6): 507–513. дои : 10.1016/j.ceca.2010.04.004 . ПМЦ 2900537 . ПМИД 20510449 .
^ Лопес, Хосе Р.; Аллен, Пол Д. (1 января 2012 г.), Хилл, Джозеф А.; Олсон, Эрик Н. (ред.), «Глава 56. Контроль концентрации Ca2+ в состоянии покоя в скелетных мышцах» , Muscle , Boston/Waltham: Academic Press, стр. 801–810, doi : 10.1016/b978-0-12-381510 -1.00056-9 , ISBN 978-0-12-381510-1 , получено 8 ноября 2020 г.
^ Эдес, Иштван; Краниас, Евангелия Г. (1995-01-01), Сперелакис, НИКОЛАС (редактор), «13-Ca2+-АТФазы» , Справочник по клеточной физиологии , Academic Press, стр. 156–165, doi : 10.1016/b978-0 -12-656970-4.50019-1 , ISBN 978-0-12-656970-4 , получено 8 ноября 2020 г.
^ Фресу, Луиджия; Дехпур, Ахмед; Дженаццани, Армандо А.; Карафоли, Эрнесто; Герини, Данило (ноябрь 1999 г.). «Изоформы кальциевой АТФазы плазматической мембраны в астроцитах» . Глия . 28 (2) (опубликовано 22 октября 1999 г.): 150–155. doi : 10.1002/(SICI)1098-1136(199911)28:2<150::AID-GLIA6>3.0.CO;2-7 . ПМИД 10533058 . S2CID 44343760 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с Шу, Кай; Ульдриан, Степан; Телькамп, Мириам; Ретляйн, Никола; Нейсес, Людвиг (2001). «Плазмембранный кальмодулин-зависимый кальциевый насос: основной регулятор синтазы оксида азота I» . Дж. Клеточная Биол. 155 (2): 201–205. дои : 10.1083/jcb.200104131 . ПМК 2198825 . ПМИД 11591728 .
^ Верма, Анил К.; Филотео, Аделаида Г.; Стэнфорд, Дэвид Р.; Вибен, Эрик Д.; Пеннистон, Джон Т. (1988). «Полная первичная структура плазматической мембраны человека Ca». ²⁺ Pump» . J. Biol. Chem. 263 (28): 14152–14159. doi : 10.1016/S0021-9258(18)68198-0 . PMID 2844759. Проверено 25 декабря 2013 г.
^ Граф, Эрнст; Верма, Анил К.; Горски, Джеффри П.; Лопащук, Гэри; Ниггли, Верена; Зурини, Мауро; Карафоли, Э.; Пеннистон, Джон Т. (1982). «Молекулярные свойства АТФазы, перекачивающей кальций, из эритроцитов человека». Биохимия . 21 (18): 4511–4516. дои : 10.1021/bi00261a049 . ПМИД 6215062 .
^ ВанХаутен, Джошуа; Салливан, Кэтрин; Базине, Кэролайн; Рю, Том; Кэмп, Роберт; Римм, Дэвид Л.; Чанг, Джина; Высолмерски, Джон (22 июня 2010 г.). «PMCA2 регулирует апоптоз во время инволюции молочной железы и предсказывает исход рака молочной железы» . Учеб. Натл. акад. наук. США 107 (25) (опубликовано 4 июня 2010 г.): 11405–11410. Бибкод : 2010PNAS..10711405V . дои : 10.1073/pnas.0911186107 . ПМК 2895115 . ПМИД 20534448 .
^ Шехзад, Адиб; Шахзад, Рахим; Ли, Янг Суп (01 января 2014 г.), Батаи, С. Зара; Таманои, Фуюхико (ред.), «Глава восьмая - Куркумин: мощный модулятор нескольких ферментов при множественном раке» , Ферменты , натуральные продукты и передача сигналов рака: изопреноиды, полифенолы и флавоноиды, 36 , Academic Press: 149–174, doi : 10.1016/b978-0-12-802215-3.00008-2 , PMID 27102703 , получено 8 ноября 2020 г.
^ Ниггли, Верена; Пеннистон, Джон Т.; Карафоли, Эрнесто (1979). «Очистка (Ca ²⁺-Мг ²⁺) АТФаза из мембран эритроцитов человека с использованием аффинной колонки с кальмодулином» . J. Biol. Chem. 254 (20): 9955–9958. doi : 10.1016/S0021-9258(19)86652-8 . PMID 158595. Получено. 25 декабря 2013 г. .
^ Пеннистон, Джон Т.; Гфилотео, Аделаида; Макдонаф, Кэрол С.; Карафоли, Эрнесто (1988). «Очистка, восстановление и регуляция плазматической мембраны Ca ₂⁺-насосы». Биомембраны. Часть Q: Насосы, управляемые АТФ, и связанный с ними транспорт: кальциевые, протонные и калиевые насосы . Методы энзимологии. Том 157. Стр. 340–351. doi : 10.1016/0076-6879(88)57089- 1 . 978-0-12-182058-9 . ПМИД 2976465 . .

Внешние ссылки

Плазма + мембрана + транспортирующий кальций + АТФазы в Национальной медицинской библиотеке США по медицинским предметным рубрикам (MeSH)

[1] Дженсен, Томас П.; Бакби, Люси Э.; Эмпсон, Рут М. (2004). «Экспрессия плазматической мембраны Ca ²⁺ Члены семейства АТФаз и связанные с ними синаптические белки в острых и культивируемых органотипических срезах гиппокампа крысы». Developmental Brain Research . 152 (2): 129–136. doi : 10.1016/j.devbrainres.2004.06.004 . PMID 15351500 .

[Strehler-2] Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час ^я ^дж Стрелер, Эмануэль Э.; Захариас, Дэвид А. (2001). «Роль альтернативного сплайсинга в создании разнообразия изоформ среди кальциевых насосов плазматической мембраны». Физиол. Откр. 81 (1): 21–50. дои : 10.1152/physrev.2001.81.1.21 . ПМИД 11152753 . S2CID 9062253 .

[Carafoli-3] Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж Карафоли, Э. (1991). «Кальциевый насос плазматической мембраны». Физиол. Откр. 71 (1): 129–153. дои : 10.1152/physrev.1991.71.1.129 . ПМИД 1986387 .

[Talarico-4] Jump up to: ^а ^б ^с ^д Таларико, Эрнест Ф. младший; Кеннеди, Брайан Г.; Марфурт, Карл Ф.; Леффлер, Карин У.; Манджини, Нэнси Дж. (2005). «Экспрессия и иммунолокализация изоформ кальциевой АТФазы плазматической мембраны в эпителии роговицы человека» . Мол. Вис. 11 : 169–178. ПМИД 15765049 . Проверено 25 декабря 2013 г.

[Jensen06-5] Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и Дженсен, Томас П.; Филотео, Аделаида Г.; Кнопфель, Томас; Эмпсон, Рут М. (2006). «Изоформа 2а пресинаптической плазматической мембраны регулирует возбуждающую синаптическую передачу в СА3 гиппокампа крысы» . Дж. Физиол. 579 (1): 85–99. дои : 10.1113/jphysicalol.2006.123901 . ПМК 2075377 . ПМИД 17170045 . Проверено 13 января 2007 г.

[Siegel-6] Jump up to: ^а ^б ^с Альберс, Р. Уэйн; Сигел, Джордж Дж. (1999). «5. Мембранный транспорт» . В Сигеле, Джордже Дж.; и др. (ред.). Базовая нейрохимия: молекулярные, клеточные и медицинские аспекты (6-е изд.). Филадельфия: Липпинкотт-Рэйвен. АТФ-зависимые Ca2+-насосы. ISBN 978-0-397-51820-3 . ОСЛК 39013748 . Проверено 25 декабря 2013 г.

[7] Бюретт, Ален; Вайнберг, Ричард Дж. (февраль 2007 г.). «Перисинаптическая организация кальциевых насосов плазматической мембраны в коре мозжечка». Дж. Комп. Нейрол. 500 (6) (опубликовано 20 декабря 2006 г.): 1127–1135. дои : 10.1002/cne.21237 . ПМИД 17183553 . S2CID 22110231 .

[8] Иванников Максим Владимирович; Сугимори, Муцуюки; Ллинас, Родольфо Р. (2010). «Клиренс кальция и его энергетические потребности в нейронах мозжечка» . Клеточный кальций . 47 (6): 507–513. дои : 10.1016/j.ceca.2010.04.004 . ПМЦ 2900537 . ПМИД 20510449 .

[9] Лопес, Хосе Р.; Аллен, Пол Д. (1 января 2012 г.), Хилл, Джозеф А.; Олсон, Эрик Н. (ред.), «Глава 56. Контроль концентрации Ca2+ в состоянии покоя в скелетных мышцах» , Muscle , Boston/Waltham: Academic Press, стр. 801–810, doi : 10.1016/b978-0-12-381510 -1.00056-9 , ISBN 978-0-12-381510-1 , получено 8 ноября 2020 г.

[10] Эдес, Иштван; Краниас, Евангелия Г. (1995-01-01), Сперелакис, НИКОЛАС (редактор), «13-Ca2+-АТФазы» , Справочник по клеточной физиологии , Academic Press, стр. 156–165, doi : 10.1016/b978-0 -12-656970-4.50019-1 , ISBN 978-0-12-656970-4 , получено 8 ноября 2020 г.

[Fresu-11] Фресу, Луиджия; Дехпур, Ахмед; Дженаццани, Армандо А.; Карафоли, Эрнесто; Герини, Данило (ноябрь 1999 г.). «Изоформы кальциевой АТФазы плазматической мембраны в астроцитах» . Глия . 28 (2) (опубликовано 22 октября 1999 г.): 150–155. doi : 10.1002/(SICI)1098-1136(199911)28:2<150::AID-GLIA6>3.0.CO;2-7 . ПМИД 10533058 . S2CID 44343760 .

[Schuh-12] Jump up to: ^а ^б ^с Шу, Кай; Ульдриан, Степан; Телькамп, Мириам; Ретляйн, Никола; Нейсес, Людвиг (2001). «Плазмембранный кальмодулин-зависимый кальциевый насос: основной регулятор синтазы оксида азота I» . Дж. Клеточная Биол. 155 (2): 201–205. дои : 10.1083/jcb.200104131 . ПМК 2198825 . ПМИД 11591728 .

[13] Верма, Анил К.; Филотео, Аделаида Г.; Стэнфорд, Дэвид Р.; Вибен, Эрик Д.; Пеннистон, Джон Т. (1988). «Полная первичная структура плазматической мембраны человека Ca». ²⁺ Pump» . J. Biol. Chem. 263 (28): 14152–14159. doi : 10.1016/S0021-9258(18)68198-0 . PMID 2844759. Проверено 25 декабря 2013 г.

[14] Граф, Эрнст; Верма, Анил К.; Горски, Джеффри П.; Лопащук, Гэри; Ниггли, Верена; Зурини, Мауро; Карафоли, Э.; Пеннистон, Джон Т. (1982). «Молекулярные свойства АТФазы, перекачивающей кальций, из эритроцитов человека». Биохимия . 21 (18): 4511–4516. дои : 10.1021/bi00261a049 . ПМИД 6215062 .

[15] ВанХаутен, Джошуа; Салливан, Кэтрин; Базине, Кэролайн; Рю, Том; Кэмп, Роберт; Римм, Дэвид Л.; Чанг, Джина; Высолмерски, Джон (22 июня 2010 г.). «PMCA2 регулирует апоптоз во время инволюции молочной железы и предсказывает исход рака молочной железы» . Учеб. Натл. акад. наук. США 107 (25) (опубликовано 4 июня 2010 г.): 11405–11410. Бибкод : 2010PNAS..10711405V . дои : 10.1073/pnas.0911186107 . ПМК 2895115 . ПМИД 20534448 .

[16] Шехзад, Адиб; Шахзад, Рахим; Ли, Янг Суп (01 января 2014 г.), Батаи, С. Зара; Таманои, Фуюхико (ред.), «Глава восьмая - Куркумин: мощный модулятор нескольких ферментов при множественном раке» , Ферменты , натуральные продукты и передача сигналов рака: изопреноиды, полифенолы и флавоноиды, 36 , Academic Press: 149–174, doi : 10.1016/b978-0-12-802215-3.00008-2 , PMID 27102703 , получено 8 ноября 2020 г.

[17] Ниггли, Верена; Пеннистон, Джон Т.; Карафоли, Эрнесто (1979). «Очистка (Ca ²⁺-Мг ²⁺) АТФаза из мембран эритроцитов человека с использованием аффинной колонки с кальмодулином» . J. Biol. Chem. 254 (20): 9955–9958. doi : 10.1016/S0021-9258(19)86652-8 . PMID 158595. Получено. 25 декабря 2013 г. .

[18] Пеннистон, Джон Т.; Гфилотео, Аделаида; Макдонаф, Кэрол С.; Карафоли, Эрнесто (1988). «Очистка, восстановление и регуляция плазматической мембраны Ca ₂⁺-насосы». Биомембраны. Часть Q: Насосы, управляемые АТФ, и связанный с ними транспорт: кальциевые, протонные и калиевые насосы . Методы энзимологии. Том 157. Стр. 340–351. doi : 10.1016/0076-6879(88)57089- 1 . 978-0-12-182058-9 . ПМИД 2976465 . .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]

[ 11 ]

[ 12 ]

[ 13 ]

[ 14 ]

[ 15 ]

[ 16 ]

[ 17 ]

[ 18 ]