Открытие и разработка ингибиторов АПФ

Открытие перорально неактивного пептида из змеиного яда установило важную роль ангиотензинпревращающего фермента (АПФ) ингибиторов в регулировании артериального давления . Это привело к разработке каптоприла . , первого АПФ ингибитора Когда побочные эффекты каптоприла стали очевидны, были разработаны новые производные. Затем, после открытия двух активных центров АПФ: N-домена и С-домена, началась разработка домен-специфических ингибиторов АПФ.

Разработка ингибиторов АПФ первого поколения

Разработка нонапептида тепротида ( Glu - Trp - Pro - Arg -Pro- Gln - Ile -Pro-Pro), который первоначально был выделен из яда бразильской гадюки Bothrops jararaca , значительно прояснила важность АПФ при гипертонии . Однако отсутствие пероральной активности ограничивало его терапевтическую полезность.

L- бензилянтарная кислота (2(R)-бензил-3-карбоксипионовая кислота) была описана как наиболее мощный ингибитор карбоксипептидазы А в начале 1980-х годов. Авторы группу назвали его аналогом продукта побочного и предположили, что он связывается с активным центром карбоксипептидазы А через сукцинилкарбоксильную и карбонильную группу . Их результаты установили, что L-бензилянтарная кислота связана в одном локусе активного сайта карбоксипептидазы А. Авторы обсудили, но отвергли предположение о том, что карбоксилатная функция может связываться с каталитически функциональным цинка ионом , присутствующим в активном сайте. Однако позже выяснилось, что это так.

Разработка лекарственного средства каптоприл (сульфгидрилы)

Каптоприл, сульфгидрильный ингибитор АПФ.

Более 2000 соединений были случайным образом протестированы в морских свинок тесте на подвздошной кишке , и было обнаружено, что сукцинил-L-пролин обладает свойствами специфического ингибитора АПФ. Он продемонстрировал ингибирующее действие ангиотензина I и брадикинина, не оказывая никакого влияния на ангиотензин II . Тогда исследователи начали поиск модели, которая могла бы объяснить ингибирование на основе специфического лекарственного взаимодействия соединений с активным центром АПФ. Предыдущие исследования субстратов и ингибиторов АПФ показали, что это цинксодержащий металлопротеин и карбоксипептидаза, сходная с карбоксипептидазой А поджелудочной железы Однако АПФ высвобождает дипептиды, а не отдельные аминокислоты с С-конца пептидных . субстратов. И предполагалось, что и механизм их действия , и активный центр могут быть схожими. Положительно заряженный Arg ¹⁴⁵ Считалось, что в активном центре связывается отрицательно заряженная С-концевая карбоксильная группа пептидного субстрата. Было также высказано предположение, что ACE связывается посредством водородной связи с концевой неразрывной пептидной связью субстрата.

Но поскольку АПФ является дипептидкарбоксипептидазой, в отличие от карбоксипептидазы А, расстояние между катионным карбоксильным центром и атомом цинка должно быть больше, примерно на длину одного аминокислотного остатка. Пролин был выбран в качестве аминокислотной группы из-за его присутствия в качестве карбокси-концевого аминокислотного остатка в тепротиде и других ингибиторах АПФ, обнаруженных в змеиных ядах. Были протестированы еще одиннадцать аминокислот, но ни одна из них не оказалась более ингибирующей. Поэтому было предложено, чтобы производное сукциниловой аминокислоты было ингибитором АПФ, и было обнаружено, что сукцинил-L-пролин является таким ингибитором.

Было также известно, что природа предпоследнего аминокислотного остатка пептидного субстрата АПФ влияет на связывание с ферментом. Ацильная группа карбоксиалканоиламинокислоты связывает ион цинка фермента и занимает в активном центре АПФ то же положение, что и предпоследняя. Следовательно, заместитель ацильной группы также может влиять на связывание с ферментом. Было обнаружено, что 2- метиловый заместитель с D-конфигурацией усиливает ингибирующую активность сукцинил-L-пролина примерно в 15 раз. Затем начались поиски лучшей группы, связывающей цинк. Замена сукцинилкарбоксильной группы азотсодержащими функциональными группами ( амином , амидом или гуанидином ) не усиливала ингибирующую активность. Однако прорыв в эффективности был достигнут за счет замены карбоксильной группы на сульфгидрильную функцию ( SH ), группу с большим сродством к иону цинка, связанному с ферментом. В результате был получен мощный ингибитор, который был в 1000 раз более мощным, чем сукцинил-L-пролин. меркаптоалканоилпроизводных . - Установлено, что оптимальная длина ацильной цепи для меркаптоалканоилпроизводных пролина равна 3-меркаптопропаноил-L-пролину, в 5 раз больше, чем у 2-меркаптоалканоилпроизводных, и в 50 раз больше, чем у 4 Таким образом, D-3-меркапто-2-метилпропаноил-L-пролин или каптоприл оказался наиболее мощным ингибитором. Позже исследователи сравнили несколько ингибиторов меркаптоацил-аминокислот и пришли к выводу, что связывание ингибитора с ферментом включает водородную связь между донорным сайтом фермента и кислородом амид-карбонила, как и предполагалось для субстратов.

Разработка лекарств других ингибиторов АПФ первого поколения

Эналаприл.

Лизиниоприл.

Наиболее частые побочные эффекты каптоприла, кожная сыпь и потеря вкуса , такие же, как и при приеме меркаптосодержащего пеницилламина . Поэтому группа исследователей стремилась найти мощные селективные ингибиторы АПФ, которые не содержали бы меркапто (SH) функции и имели бы более слабую хелатирующую функцию. Они вернулись к работе с карбоксильными соединениями и начали работать с замещенными N -карбоксиметилдипептидами общей структуры (R-CHCOOH-A ₁ -A ₂ ). Согласно предыдущим исследованиям, они предположили, что циклические иминокислоты будут иметь хорошую эффективность, если их заменить на карбоксильном конце дипептида. Поэтому замена А ₂ на пролин дала хорошие результаты. Они также отметили, что согласно специфичности фермента иминокислоты в положении рядом с карбоксильным концом не дают сильнодействующего соединения. Замещение _{R и A 1} групп гидрофобными и основными остатками позволит получить сильнодействующее соединение. Замена –NH в общей структуре привела к потере активности, что соответствует потребности фермента в –NH в соответствующем положении на субстратах. В результате были получены 2 активных ингибитора: Эналаприлат и Лизиноприл . Оба этих соединения содержат фенилаланин в положении R, который занимает бороздку S1 _в ферменте. Результатом стали два новых мощных аналога трипептида с карбоксильной группой, координирующей цинк: эналаприлат и лизиноприл.

Обнаружение 2-х активных сайтов: C-домена и N-домена.

Большинство ингибиторов АПФ, представленных сегодня на рынке, неселективны по отношению к двум активным центрам АПФ, поскольку их связывание с ферментом основано главным образом на сильном фундаментальном взаимодействии между атомом цинка в ферменте и сильной хелатирующей группой ингибитора. Разрешение трехмерной структуры зародышевого АПФ, который имеет только один активный сайт, соответствующий С-домену соматического АПФ , предлагает структурную основу для структурного подхода к проектированию. Хотя N- и C-домен имеют сопоставимые скорости гидролиза АПФ in vitro , похоже, что in vivo С-домен в основном отвечает за регулирование артериального давления. Это указывает на то, что селективные ингибиторы С-домена могут иметь профиль, аналогичный профилю современных неселективных ингибиторов. Ангиотензин I в основном гидролизуется С-доменом in vivo, тогда как брадикинин гидролизуется обоими активными центрами. Таким образом, разработка селективного ингибитора С-домена позволит некоторую деградацию брадикинина за счет N-домена, и этой деградации может быть достаточно для предотвращения накопления избытка брадикинина, который наблюдается во время приступов ангионевротический отек . Избирательное ингибирование С-домена может привести к специализированному контролю артериального давления с меньшими вазодилататорами побочными эффектами, связанными с . С другой стороны, селективные ингибиторы N-домена открывают возможность открытия новых терапевтических областей. По-видимому, N-домен не играет большой роли в контроле артериального давления, но, по-видимому, является основным ферментом, метаболизирующим AcSDKP, естественный геморегуляторный гормон .

Разработка лекарственного средства кето-АПФ и его кетометиленовых производных

Было обнаружено, что другие карбонилсодержащие группы, такие как кетоны, могут заменять амидную связь, связывающую Phe и Gly в ингибиторах АПФ. Кето-АПФ, впервые описанный в 1980 году, стал потенциальным ведущим соединением для ингибиторов АПФ, специфичных для С-домена. Кето-АПФ, трипептидный аналог Phe-Gly-Pro, содержит объемистые _{кольца P 1} и P ₂ бензильные и, как было показано, ингибирует гидролиз ангиотензина I и брадикинина через C-домен. Синтез аналогов кето-АПФ с Trp или Phe в положении P ₂ ' привел к заметному увеличению селективности C-домена , но введение алифатической группы P ₂ обеспечило селективность N-домена. Ингибирующая активность может быть дополнительно усилена путем включения гидрофобного заместителя, такого как фенильная группа, в положение P ₁ '. заместители P ₁ ' с S- стереохимией обладают большей ингибирующей способностью, чем их R-аналоги. Также было показано, что

Кето-АПФ был использован в качестве основы для создания производных кетометилена. кетометилена Его аналоги содержат замену изостера в разрезаемой связи которая, как полагают, имитирует тетраэдра переходное состояние протеолитической , реакции в активном центре. Основное внимание было уделено простому трипептиду Phe-Ala-Pro, который в более ранних ферментных анализах показал ингибирующую активность. Замена аланина глицином дала трипептид с 1/14 ингибирующей активностью Phe-Ala-Pro. Бензоилированное производное Phe-Gly-Pro, Bz-Phe-Gly-Pro, было в два раза активнее. Чтобы уменьшить пептидную природу ингибиторов кетометилена, заместители P ₁ ' и P ₂ ' могут быть циклизованы с образованием лактама , где существует корреляция между ингибирующей активностью и размером кольца. В 2001 году было высказано предположение, что замена α на азот и создание 3-метилзамещенного аналога А58365А, пиридоновой кислоты, выделенной из ферментационного бульона бактерии Streptomyces с ингибирующей АПФ активностью , chromofuscus может влиять на уровень биологическая активность за счет стерического или гидрофобного эффекта и/или за счет предотвращения реакций на С3. также было замечено, Во время синтетической работы над A58365A что потенциальные предшественники чувствительны к окислению пятичленного кольца, и поэтому 3-метиловый аналог может быть более стабильным в этом отношении.

Дизайн препарата силандиола

Тот факт, что углерод и силикон имеют схожие, но в то же время и разные характеристики, вызвал интерес к замене углерода силандиолом в качестве центральной группы, хелатирующей цинк. Силикон образует соединение диалкилсиландиола, которое достаточно затруднено, поэтому образование силоксанового полимера не происходит. Силандиолы более стабильны, чем углеродные диолы , поэтому ожидается, что они будут иметь более длительный период полураспада . Силандиолы также нейтральны при физиологическом pH (не ионизируются ). Четыре стереоизомера силандиола Phe-Ala сравнили с ингибиторами на основе кетонов, и выяснилось, что силандиол в четыре раза менее эффективен, чем кетоновый аналог. Это связано с тем, что силандиолы являются более слабыми хелаторами цинка по сравнению с кетонами. Замена силандиола на метилсиланогруппу приводила к незначительному ингибированию ферментов . Это подтверждает, что силандиоловая группа взаимодействует с АПФ как аналог переходного состояния и взаимодействие происходит аналогично кетону. Если бензильную группу силандиола заменить на изобутильную группу , получится более слабый ингибитор АПФ. Введение гидрофобного метилфенила дает немного большую эффективность, чем аналог с трет-бутильной группой в положении P ₁ . Это говорит о том, что метилфенил лучше распознает S1, чем трет-бутильная группа.

Фосфиновые пептиды

Фосфиновые пептиды представляют собой псевдопептиды, в которых связь фосфиновой кислоты (PO ₂ -CH-) заменила пептидную связь в последовательности пептидного аналога. В некоторой степени химическая структура фосфиновых пептидов аналогична структуре промежуточных продуктов , образующихся при гидролизе пептидов протеолитическими ферментами. Была выдвинута гипотеза , что эти псевдопептиды имитируют структуру субстратов ферментов в их переходном состоянии, и кристаллография цинковых протеаз в комплексе с фосфиновыми пептидами подтверждает эту гипотезу.

Дизайн препарата RXP 407

RXP 407 является первым фосфиновым пептидом, селективным по N-домену, и был обнаружен путем скрининга библиотек фосфиновых пептидов. До открытия RXP 407 долгое время утверждалось, что свободная C-концевая карбоксилатная группа в положении P ₂ ' важна для эффективности ингибитора АПФ, поэтому можно предположить, что это отложило открытие селективных ингибиторов АПФ с N-доменом. . Когда был открыт RXP 407, исследователи изучили фосфиновые пептиды с тремя различными общими формулами, каждая из которых содержит 2 неопознанные аминокислоты, только одна из этих общих формул показала сильное ингибирование (Ac-Yaa-Pheψ(PO ₂ -CH ₂ )Ala-Yaa'- НХ ₂ ). Были приготовлены пептидные смеси, заменяющие Yaa и Yaa' разными аминокислотами, пытаясь установить, существует ли мощный ингибитор, который мог бы ингибировать либо N-домен, либо C-домен фермента. В результате соединение Ac- Asp _(L) -Pheψ(PO ₂ -CH ₂ ) _(L) Ala-Ala-NH ₂ активно ингибировало N-домен и получило название RXP 407. Взаимосвязь структура-функция показала, что карбоксамидная группа С-конца играла решающую роль в селективности N-домена АПФ. Кроме того, N-ацетильная группа и боковая цепь аспарагиновой кислоты в P _2- положение способствует селективности ингибитора в отношении N-домена. Эти особенности делают ингибитор недоступным для С-домена, но дают хорошую эффективность для N-домена, что приводит к разнице в ингибирующей способности активных центров на три порядка. Эти результаты также указывают на то, что N-домен обладает более широкой селективностью, чем C-домен. Еще одно различие между более старыми ингибиторами АПФ и RXP 407 заключается в молекулярном размере соединения. Старые ингибиторы АПФ в основном взаимодействовали с субсайтами S1 _' , S2 _' и S1, _но RXP 407 взаимодействует дополнительно с _{субсайтом S2} . Это также важно для селективности ингибитора, поскольку боковая цепь аспарагиновой кислоты и N-ацетильная группа расположены в положении P ₂ .

Лекарственная конструкция RXPA 380

RXPA380 был первым ингибитором, обладающим высокой селективностью в отношении C-домена АПФ. Он имеет формулу Phe-Phe-Pro-Trp. Разработка этого соединения была основана на исследованиях, которые показали, что некоторые пептиды, усиливающие брадикинин, проявляют селективность в отношении С-домена и все имеют в своей структуре несколько пролинов. Эти наблюдения побудили исследователей синтезировать фосфиновые пептиды, содержащие остаток пролина в положении P ₁ ', и оценка этих соединений привела к открытию RXPA380. Чтобы изучить роль остатков RXPA380, исследователи создали 7 аналогов RXPA380. Все полученные соединения были получены в виде смеси двух или четырех диастереоизомеров, но все они легко растворялись, и только одно из них было активным. Это согласуется с первоначальными исследованиями моделирования RXPA380, которые показали, что только один диастереомер может размещаться в активном центре зародышевого АПФ. Аналоги, в которых были заменены остатки псевдопролина или триптофана, показали меньшую селективность, чем RXPA380. Вероятно, это связано с тем, что эти два аналога обладают большей эффективностью в отношении N-домена, чем RXPA380. Замена обоих этих остатков дает большую эффективность, но не селективность. Это показывает, что остатки псевдопролина и триптофана хорошо приспосабливаются в C-домене, но не в N-домене. Еще два аналога, содержащие как псевдопролин, так и триптофан, но лишенные остатка псевдофенилаланина в положении P1, _{показали} низкую активность в отношении N-домена, подобно RXPA380. Это подтверждает значительную роль этих двух остатков в селективности в отношении С-домена. Эти два аналога также обладают меньшей активностью в отношении C-домена, что показывает, что C-домен предпочитает псевдофенилаланиновую группу в P. ₁ позиция. Моделирование комплекса RXPA380-ACE показало, что псевдопролиновый остаток ингибитора окружен аминокислотами, аналогичными аминокислотам N-домена, поэтому взаимодействия с доменом S ₂ ' не могут быть ответственны за селективность RXPA380. Семь из 12 аминокислот, окружающих триптофан, одинаковы в C- и N-домене, самая большая разница заключается в том, что 2 объемные и гидрофобные аминокислоты в C-домене были заменены двумя меньшими и полярными аминокислотами в N-домене. Это указывает на то, что низкая активность RXPA380 в отношении N-домена обусловлена ​​не тем, что полость S ₂ ' не вмещает боковую цепь триптофана, а, скорее, тем, что отсутствуют важные взаимодействия между боковой цепью триптофана и аминокислотами C-домена. На основании близости между боковой цепью триптофана и Asp. ¹⁰²⁹ возможна также водородная связь между карбоксилатом Asp. ¹⁰²⁹ кольцо NH и индольное в C-домене, но в N-домене это взаимодействие гораздо слабее.