Транспортер ABC

ABC Транспортер, НБД
Транспортер витамина В12 , BtuCD PDB 1l7v
Идентификаторы
Символ	ABC_tran
Пфам	PF00005
ИнтерПро	ИПР003439
PROSITE	PDOC00185
ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ 2	1b0u / SCOPe / СУПФАМ
TCDB	3.А.1
Суперсемейство OPM	17
белок OPM	3g5u
показывать Доступные белковые структуры: Pfam   structures / ECOD   PDB RCSB PDB; PDBe; PDBj PDBsum structure summary

Липидная флиппаза MsbA

Молибдатный транспортер AB ₂ C _{2 , открытое состояние} комплекс

Транспортеры ABC , кассетные транспортеры, связывающие АТФ-синтазу (АТФ), представляют собой суперсемейство транспортных систем, которое является одним из крупнейших и, возможно, одним из старейших семейств генов . Он представлен во всех современных типах , от прокариотов до человека . Транспортеры ABC относятся к транслоказам .

Транспортеры ABC часто состоят из множества субъединиц, одна или две из которых представляют собой трансмембранные белки , а одна или две из них представляют собой мембраносвязанные AAA- АТФазы . Субъединицы АТФазы используют энергию связывания и гидролиза аденозинтрифосфата (АТФ) для обеспечения энергии, необходимой для перемещения субстратов через мембраны либо для поглощения, либо для экспорта субстрата.

Большинство систем поглощения также имеют экстрацитоплазматический рецептор, белок, связывающий растворенные вещества. Некоторые гомологичные АТФазы участвуют в процессах, не связанных с транспортом, таких как трансляция РНК и репарация ДНК . Транспортеры ABC считаются суперсемейством ABC на основании сходства последовательности и организации их доменов АТФ-связывающей кассеты (ABC), хотя интегральные мембранные белки, по-видимому, несколько раз развивались независимо и, таким образом, включают разные семейства белков. Как и экспортеры ABC, вполне возможно, что интегральные мембранные белки систем поглощения ABC также эволюционировали по крайней мере три раза независимо, основываясь на их трехмерных структурах с высоким разрешением. Портеры поглощения ABC поглощают большое количество питательных веществ, предшественников биосинтеза, микроэлементов и витаминов , а экспортеры транспортируют липиды , стерины , лекарства и большое количество первичных и вторичных метаболитов. Некоторые из этих экспортеров в организме человека участвуют в резистентности опухолей, муковисцидозе и ряде других наследственных заболеваний человека. Высокий уровень экспрессии генов, кодирующих некоторые из этих экспортеров, как у прокариотических, так и у эукариотических организмов (включая человека), приводит к развитию устойчивости к множеству лекарств, таких как антибиотики и противораковые средства.

Сотни транспортеров ABC были охарактеризованы как у прокариот, так и у эукариот. Гены ABC необходимы для многих процессов в клетке, а мутации в генах человека вызывают или способствуют развитию некоторых генетических заболеваний человека. У человека обнаружено 48 генов ABC. Среди них многие из них были охарактеризованы и признаны причинно связанными с заболеваниями, присутствующими у человека, такими как муковисцидоз , адренолейкодистрофия , болезнь Штаргардта , лекарственно-устойчивые опухоли, синдром Дубина-Джонсона , болезнь Байлера, прогрессирующий знакомый внутрипеченочный холестаз, Х-сцепленный сидеробластный холестаз. анемия , атаксия , стойкая и гиперинсулиническая гипогликемия. Транспортеры ABC также участвуют в множественной лекарственной устойчивости , и именно так были впервые идентифицированы некоторые из них. Когда транспортные белки ABC сверхэкспрессируются в раковых клетках, они могут экспортировать противораковые лекарства и делать опухоли устойчивыми.

Функция

Транспортеры ABC используют энергию связывания и гидролиза АТФ для транспортировки различных субстратов через клеточные мембраны . Они разделены на три основные функциональные категории. У прокариот импортеры обеспечивают поступление питательных веществ в клетку. Субстраты, которые могут транспортироваться, включают ионы , аминокислоты , пептиды , сахара и другие молекулы, которые в основном гидрофильны . Мембранная область транспортера ABC защищает гидрофильные субстраты от липидов мембранного бислоя , обеспечивая тем самым путь через клеточную мембрану. У эукариот нет импортеров. Экспортеры или эффлюксеры , которые присутствуют как у прокариот, так и у эукариот, действуют как насосы, выталкивающие токсины и лекарства из клетки. У грамотрицательных бактерий экспортеры транспортируют липиды и некоторые полисахариды из цитоплазмы в периплазму . Третья подгруппа белков ABC не выполняет функции транспортеров, а скорее участвует в процессах трансляции и репарации ДНК.

Прокариотический

Бактериальные переносчики ABC необходимы для жизнеспособности, вирулентности и патогенности клеток. Например, системы поглощения железа ABC являются важными эффекторами вирулентности. Патогены используют сидерофоры , такие как энтеробактин , для удаления железа, которое находится в комплексе с высокоаффинными железосвязывающими белками или эритроцитами . Это молекулы, хелатирующие железо с высоким сродством, которые секретируются бактериями и реабсорбируют железо в комплексы железо-сидерофор. chvE-gguAB Ген у Agrobacterium tumefaciens кодирует импортеры глюкозы и галактозы , которые также связаны с вирулентностью. Транспортеры чрезвычайно важны для выживания клеток, поскольку они функционируют как белковые системы, противодействующие любым нежелательным изменениям, происходящим в клетке. Например, потенциальное летальное увеличение осмотической силы уравновешивается активацией осмочувствительных транспортеров ABC, которые опосредуют поглощение растворенных веществ. Помимо транспорта, некоторые бактериальные белки ABC также участвуют в регуляции ряда физиологических процессов.

В системах бактериального оттока определенные вещества, которые необходимо вытеснить из клетки, включают поверхностные компоненты бактериальной клетки (например, капсульные полисахариды, липополисахариды и тейхоевая кислота ), белки, участвующие в бактериальном патогенезе (например, гемолиз , гем -связывающий белок и щелочной белок). протеаза ), гем, гидролитические ферменты , белки S-слоя, факторы компетентности, токсины , антибиотики , бактериоцины , пептидные антибиотики , лекарства и сидерофоры. Они также играют важную роль в путях биосинтеза, включая внеклеточный биосинтез полисахаридов. и цитохромов . биогенез

Эукариотический

Хотя большинство эукариотических переносчиков ABC являются эффлюксорами, некоторые из них не участвуют непосредственно в транспортировке субстратов. В трансмембранном регуляторе муковисцидоза ( CFTR ) и рецепторе сульфонилмочевины (SUR) гидролиз АТФ связан с регуляцией открытия и закрытия ионных каналов, переносимых самим белком ABC или другими белками.

Транспортеры ABC человека участвуют в ряде заболеваний, которые возникают из-за полиморфизма генов ABC и редко из-за полной потери функции отдельных белков ABC. К таким заболеваниям относятся менделевские болезни и сложные генетические нарушения, такие как муковисцидоз, адренолейкодистрофия , болезнь Штаргардта , болезнь Танжера , иммунодефициты, прогрессирующий семейный внутрипеченочный холестаз , синдром Дубина-Джонсона , эластическая псевдоксантома , стойкая гиперинсулинемическая гипогликемия грудного возраста вследствие очаговой аденоматозной гиперплазии , Х -связанный сидеробластоз и анемия , возрастная макулярная дегенерация , семейная гипоапопротеинемия, пигментный ретинит, колбочковая дистрофия и другие. Семейство ABCB человека (MDR/TAP) отвечает за множественную лекарственную устойчивость (MDR) к множеству структурно неродственных лекарств. ABCB1 или MDR1 P-гликопротеин также участвует в других биологических процессах, основной функцией которых является транспорт липидов. Установлено, что он опосредует секрецию стероидного альдостерона надпочечниками, а его ингибирование блокирует миграцию дендритных иммунных клеток. возможно, связано с внешним транспортом липидного фактора активации тромбоцитов (PAF). Также сообщалось, что ABCB1 опосредует транспорт кортизола и дексаметазона , но не прогестерона в клетках, трансфицированных ABCB1. MDR1 также может транспортировать холестерин , короткоцепочечные и длинноцепочечные аналоги фосфатидилхолина (PC), фосфатидилэтаноламина (PE), фосфатидилсерина (PS), сфингомиелина (SM) и глюкозилцерамида (GlcCer). Мультиспецифический транспорт разнообразных эндогенных липидов через транспортер MDR1 может, возможно, влиять на трансбислойное распределение липидов, в частности видов, обычно преобладающих на внутреннем листке плазматической мембраны, таких как PS и PE.

Совсем недавно было показано, что ABC-транспортеры существуют в плаценте , что указывает на то, что они могут играть защитную роль для развивающегося плода от ксенобиотиков . Фактические данные показали, что плацентарная экспрессия ABC-транспортера P-гликопротеина (P-gp) и белка устойчивости к раку молочной железы (BCRP) увеличивается у недоношенных детей по сравнению с доношенными плацентами, при этом экспрессия P-gp еще больше увеличивается при преждевременных беременностях с хориоамнионитом. В меньшей степени увеличение ИМТ матери также связано с увеличением экспрессии плацентарного ABC-транспортера, но только у недоношенных детей.

Структура

Структура импортера ABC: BtuCD со связывающим белком ( PDB : 2qi9 )

Структура экспортера ABC: Sav1866 со связанным нуклеотидом ( PDB : 2onj )

Все транспортные белки ABC имеют общую структурную организацию, состоящую из четырех основных доменов. Эти домены состоят из двух трансмембранных (Т) доменов и двух цитозольных (А) доменов. Два Т-домена чередуются с ориентацией внутрь и наружу, и это чередование осуществляется за счет гидролиза аденозинтрифосфата или АТФ . АТФ связывается с субъединицами А и затем гидролизуется, обеспечивая чередование, но точный процесс, посредством которого это происходит, неизвестен. Четыре домена могут присутствовать в четырех отдельных полипептидах , которые встречаются в основном у бактерий, или присутствовать в одном или двух многодоменных полипептидах . Когда полипептиды представляют собой один домен, их можно назвать полным доменом, а когда они представляют собой два мультидомена, их можно назвать полудоменом. Каждый Т-домен обычно состоит из 10 мембранных альфа-спиралей, через которые транспортируемое вещество может проходить через плазматическую мембрану . Кроме того, структура Т-доменов определяет специфичность каждого белка ABC. В конформации, обращенной внутрь, сайт связывания в домене А открыт непосредственно для окружающих водных растворов. Это позволяет гидрофильным молекулам проникать в сайт связывания непосредственно из внутреннего листка фосфолипидного бислоя . Кроме того, разрыв в белке доступен непосредственно из гидрофобного ядра внутреннего листка бислоя мембраны. Это позволяет гидрофобным молекулам проникать в сайт связывания непосредственно из внутреннего листка фосфолипидного бислоя . После того, как АТФ перемещается в конформацию, обращенную наружу, молекулы высвобождаются из места связывания и могут выйти в экзоплазматический листок или непосредственно во внеклеточную среду .

Общей чертой всех транспортеров ABC является то, что они состоят из двух отдельных доменов: трансмембранного домена (TMD) и нуклеотидсвязывающего домена (NBD) . TMD, также известный как трансмембранный домен (MSD) или интегральный мембранный домен (IM), состоит из альфа-спиралей , встроенных в бислой мембраны. Он распознает множество субстратов и претерпевает конформационные изменения для транспортировки субстрата через мембрану. Последовательность и архитектура TMDs вариабельны, что отражает химическое разнообразие субстратов, которые могут быть транслоцированы. С другой стороны, домен NBD или АТФ-связывающей кассеты (ABC) расположен в цитоплазме и имеет высококонсервативную последовательность. NBD является местом связывания АТФ. У большинства экспортеров N-концевой трансмембранный домен и С-концевые домены ABC слиты в одну полипептидную цепь, организованную как TMD-NBD-TMD-NBD. Примером может служить экспортер гемолизина E. coli HlyB. Импортеры имеют перевернутую организацию, то есть NBD-TMD-NBD-TMD, где домен ABC является N-концевым, тогда как TMD является C-концевым, как, например, в белке MacB E. coli, ответственном за устойчивость к макролидам .

Структурная архитектура транспортеров ABC состоит как минимум из двух TMD и двух NBD. Четыре отдельные полипептидные цепи, включающие две субъединицы TMD и две субъединицы NBD, могут объединяться с образованием полного переносчика , например, в E. coli. BtuCD импортер, участвующий в потреблении витамина B ₁₂ . Большинство экспортеров, например, экспортер нескольких лекарств Sav1866 из Staphylococcus aureus , состоят из гомодимера, состоящего из двух полупереносчиков или мономеров TMD, слитых с нуклеотидсвязывающим доменом (NBD). Для достижения функциональности часто требуется полноценный транспортер. Некоторые транспортеры ABC имеют дополнительные элементы, которые способствуют регуляторной функции этого класса белков. В частности, импортеры имеют высокоаффинный связывающий белок (BP) , который специфически связывается с субстратом в периплазме для доставки к соответствующему транспортеру ABC. Экспортеры не имеют связывающего белка, но имеют внутриклеточный домен (ICD) , который соединяет трансмембранные спирали и домен ABC. Считается, что ICD отвечает за связь между TMD и NBD.

Трансмембранный домен (TMD)

Большинство транспортеров имеют трансмембранные домены, состоящие в общей сложности из 12 α-спиралей, по 6 α-спиралей на мономер. Поскольку TMD структурно разнообразны, некоторые транспортеры имеют разное количество спиралей (от шести до одиннадцати). Домены ТМ подразделяются на три отдельных набора складок: складки-импортеры ABC типа I , складки -импортеры ABC типа II и складки -экспортеры ABC . Классификация складок-импортеров основана на детальной характеристике последовательностей.

Складка-импортер ABC типа I первоначально наблюдалась в субъединице ModB TM переносчика молибдата . Эту диагностическую складку также можно найти в субъединицах MalF и MalG TM MalFGK _2. и транспортер Met MetI. В транспортере MetI эту складку составляет минимальный набор из 5 трансмембранных спиралей, в то время как дополнительная спираль присутствует как для ModB, так и для MalG. Общая организация складки представляет собой топологию «вверх-вниз» спиралей TM2-5, которая выстилает путь транслокации, а спираль TM1 обернута вокруг внешней, обращенной к мембране поверхности и контактирует с другими спиралями TM.

Складка-импортер ABC типа II наблюдается в спиральном домене из двадцати TM BtuCD. и в Hi1471, гомологичный переносчик Haemophilus influenzae . В BtuCD упаковка спиралей сложна. Заметной закономерностью является то, что спираль TM2 расположена через центр субъединицы, где она окружена в непосредственной близости от других спиралей. Между тем, спирали TM5 и TM10 расположены в интерфейсе TMD. Мембранная область экспортеров ABC организована в два «крыла», которые состоят из спиралей TM1 и TM2 одной субъединицы и TM3-6 другой, с заменой доменов. Характерной закономерностью является то, что спирали TM1-3 связаны с TM4-6 примерно двукратным вращением вокруг оси в плоскости мембраны.

Экспортерная складка изначально наблюдается в структуре Sav1866. Он содержит 12 спиралей ТМ, по 6 на мономер.

Нуклеотид-связывающий домен (NBD)

Структура NBD транспортеров ABC со связанным нуклеотидом ( PDB : 2onj ). Линейное представление белковой последовательности выше показывает относительное положение консервативных аминокислотных мотивов в структуре (цвета соответствуют трехмерной структуре).

Домен ABC состоит из двух доменов: каталитического корового домена , подобного RecA -подобным моторным АТФазам , и меньшего по размеру, структурно разнообразного α-спирального субдомена , уникального для транспортеров ABC. Более крупный домен обычно состоит из двух β-листов и шести α-спиралей, где каталитический мотив Уокера A (GXXGXGKS/T, где X представляет собой любую аминокислоту) или P-петлю и мотив Уокера B (ΦΦΦΦD, из которых Φ представляет собой гидрофобный остаток ) находится. Спиральный домен состоит из трех или четырех спиралей и сигнатурного мотива ABC , также известного как мотив LSGGQ , линкерный пептид или мотив C. Домен ABC также имеет остаток глутамина, расположенный в гибкой петле, называемой Q-петлей , крышкой или γ-фосфатным переключателем, которая соединяет TMD и ABC. Предполагается, что петля Q участвует во взаимодействии NBD и TMD, в частности, в сочетании гидролиза нуклеотидов с конформационными изменениями TMD во время транслокации субстрата. Мотив H или область переключения содержит высококонсервативный остаток гистидина , который также важен во взаимодействии домена ABC с АТФ. Название АТФ-связывающая кассета происходит от диагностического расположения складок или мотивов этого класса белков при образовании сэндвича АТФ и гидролизе АТФ.

Связывание и гидролиз АТФ

Для образования димеров двух ABC-доменов транспортеров требуется связывание АТФ. Обычно наблюдается, что связанное АТФ состояние связано с наиболее обширным интерфейсом между доменами ABC, тогда как структуры безнуклеотидных транспортеров демонстрируют конформации с большим разделением между доменами ABC. Сообщалось о структурах АТФ-связанного состояния изолированных NBD у импортеров, включая HisP, ГлкВ, MJ1267, E.coli MalK (EcMalK), Т. литоралис МалК (ТлМалК), и экспортеры, такие как TAP, HlyB, MJ0796, Сав1866, и MSbA. В этих транспортерах АТФ связан с доменом ABC. Две молекулы АТФ расположены на границе раздела димера, зажаты между мотивом Уокера А одной субъединицы и мотивом LSGGQ другой. Впервые это наблюдалось в Rad50. и сообщается в структурах MJ0796, субъединицы NBD транспортера LolD из Methanococcus jannaschii. и EcMalK переносчика мальтозы. Эти структуры также согласуются с результатами биохимических исследований, показывающих, что АТФ находится в тесном контакте с остатками P-петли и мотива LSGGQ во время катализа .

Связывание нуклеотидов необходимо для обеспечения электростатической и/или структурной целостности активного центра и содействия образованию активного димера NBD. Связывание АТФ стабилизируется за счет следующих взаимодействий: (1) взаимодействия кольца консервативного ароматического остатка, предшествующего мотиву Уокера А, и аденозиновому кольцу АТФ; (2) водородные связи между консервативным остатком лизина в мотиве Уокера А и атомами кислорода β- и γ-фосфатов АТФ и координация этих фосфатов и некоторых остатков в мотиве Уокера А с Mg ²⁺ ион, и (3) координация γ-фосфата с боковой цепью серина и основной амидной группой остатков глицина в мотиве LSGGQ. Кроме того, остатком, который предполагает тесную связь связывания и димеризации АТФ, является консервативный гистидин в Н-петле. Этот гистидин связывается с остатками на границе раздела димеров в мотиве Уокера A и петле D, консервативной последовательности, следующей за мотивом Уокера B.

Ферментативный гидролиз АТФ требует правильного связывания фосфатов и расположения γ-фосфата по отношению к атакующей воде. В сайте связывания нуклеотидов атомы кислорода β- и γ-фосфатов АТФ стабилизированы остатками мотива Уокера А. и согласовать с Mg ²⁺ . Это мг ²⁺ Ион также координируется с концевым остатком аспартата в мотиве Уокера B посредством атакующего H ₂ O. Общее основание, которое может представлять собой остаток глутамата, примыкающий к мотиву Уокера B, глютамин в Q-петле, или гистидин в области переключения, который образует водородную связь с γ-фосфатом АТФ, катализирует скорость гидролиза АТФ, способствуя атакующему H ₂ O. Точный молекулярный механизм гидролиза АТФ до сих пор остается спорным.

Механизм транспорта

Транспортеры ABC являются активными переносчиками , то есть они используют энергию в форме аденозинтрифосфата (АТФ) для перемещения субстратов через клеточные мембраны. Эти белки используют энергию связывания и/или гидролиза АТФ для управления конформационными изменениями в трансмембранном домене (TMD) и, следовательно, для транспорта молекул. Импортеры и экспортеры ABC имеют общий механизм транспортировки субстратов. Они схожи по своему строению. Модель, описывающая конформационные изменения, связанные со связыванием субстрата, представляет собой модель попеременного доступа . В этой модели сайт связывания субстрата чередуется между конформациями, обращенными наружу и внутрь . Относительное сродство связывания двух конформаций с субстратом в значительной степени определяет общее направление транспорта. Для импортеров, поскольку транслокация направлена ​​из периплазмы в цитоплазму, обращенная наружу конформация имеет более высокое сродство связывания с субстратом. Напротив, аффинность связывания субстрата у экспортеров выше в конформации, обращенной внутрь. Моделью, описывающей конформационные изменения нуклеотидсвязывающего домена (NBD) в результате связывания и гидролиза АТФ, является модель АТФ-переключения . Эта модель представляет две основные конформации NBD: образование закрытого димера при связывании двух молекул АТФ и диссоциацию в открытый димер, чему способствует гидролиз АТФ и высвобождение неорганического фосфата (P _i ) и аденозиндифосфата (АДФ). Переключение между открытой и закрытой конформациями димера вызывает конформационные изменения в TMD, приводящие к транслокации субстрата.

Общий механизм транспортного цикла переносчиков ABC полностью не выяснен, но накоплены существенные структурные и биохимические данные, подтверждающие модель, в которой связывание и гидролиз АТФ связаны с конформационными изменениями переносчика. В состоянии покоя всех транспортеров ABC NBD находятся в конфигурации открытого димера с низким сродством к АТФ. Эта открытая конструкция имеет камеру, доступную внутрь транспортера. Транспортный цикл инициируется связыванием субстрата с сайтом с высоким сродством на TMD, что вызывает конформационные изменения в NBD и усиливает связывание АТФ. Две молекулы АТФ совместно связываются, образуя закрытую конфигурацию димера. Закрытый димер NBD вызывает конформационные изменения в TMD, так что TMD открывается, образуя камеру с отверстием, противоположным тому, что было в исходном состоянии. Сродство субстрата к TMD снижается, в результате чего субстрат высвобождается. Далее следует гидролиз АТФ, а затем последовательное высвобождение P. _i, а затем ADP восстанавливает транспортер до его базовой конфигурации. Хотя был предложен общий механизм, порядок связывания субстрата, связывания и гидролиза нуклеотидов, а также конформационные изменения, а также взаимодействия между доменами все еще обсуждаются.

Несколько групп, изучающих транспортеры ABC, имеют разные предположения о движущей силе функции транспортера. Обычно предполагается, что гидролиз АТФ обеспечивает основной расход энергии или «рабочий ход» для транспорта и что NBD работают поочередно и, возможно, участвуют в разных этапах транспортного цикла. Однако недавние структурные и биохимические данные показывают, что связывание АТФ, а не гидролиз АТФ, обеспечивает «силовой удар». Возможно также, что, поскольку связывание АТФ запускает димеризацию NBD, образование димера может представлять собой «силовой удар». Кроме того, некоторые транспортеры имеют NBD, которые не обладают одинаковыми способностями связывать и гидролизовать АТФ, и то, что интерфейс димера NBD состоит из двух карманов связывания АТФ, предполагает одновременную функцию двух NBD в транспортном цикле.

Сообщалось о некоторых доказательствах того, что связывание АТФ действительно является движущей силой транспортного цикла. Было показано, что связывание АТФ вызывает изменения в субстратсвязывающих свойствах TMD. Сродство транспортеров ABC к субстратам трудно измерить напрямую, а косвенные измерения, например, посредством стимуляции активности АТФазы, часто отражают другие шаги, ограничивающие скорость. Недавно прямое измерение связывания винбластина с пермеазным -гликопротеином ( P-гликопротеином ) в присутствии негидролизуемых аналогов АТФ, например, 5'-аденилил-β-γ-имидодифосфата (AMP-PNP), показало, что связывание АТФ в отсутствие гидролиза достаточно для снижения аффинности связывания субстрата. Кроме того, связывание АТФ вызывает существенные конформационные изменения в TMD. Спектроскопические исследования , исследования доступности протеаз и сшивания показали, что связывание АТФ с NBD вызывает конформационные изменения в белке-1, ассоциированном с множественной лекарственной устойчивостью (MRP1). ЕгоPMQ, Лмра, и Пгп. Двумерные кристаллические структуры Pgp, связанного с AMP-PNP, показали, что основные конформационные изменения во время транспортного цикла происходят при связывании АТФ и что последующий гидролиз АТФ вносит более ограниченные изменения. Вращение и наклон трансмембранных α-спиралей могут способствовать этим конформационным изменениям. Другие исследования были сосредоточены на подтверждении того, что связывание АТФ индуцирует образование закрытого димера NBD. Биохимические исследования интактных транспортных комплексов позволяют предположить, что конформационные изменения в NBD относительно невелики. В отсутствие АТФ NBD могут быть относительно гибкими, но они не предполагают существенной переориентации NBD по отношению к другим доменам. Связывание АТФ вызывает жесткое вращение двух субдоменов ABC относительно друг друга, что обеспечивает правильное выравнивание нуклеотида в активном сайте и взаимодействие с указанными мотивами. Существуют убедительные биохимические доказательства того, что связывание двух молекул АТФ может быть кооперативным, то есть АТФ должен связываться с двумя карманами активного центра, прежде чем NBD смогут димеризоваться и сформировать закрытую каталитически активную конформацию.

Импортеры ABC

Большинство транспортеров ABC, которые опосредуют поглощение питательных веществ и других молекул бактериями, полагаются на высокоаффинный белок, связывающий растворенные вещества (BP). БП представляют собой растворимые белки, расположенные в периплазматическом пространстве между внутренней и внешней мембранами грамотрицательных бактерий . У грамположительных отсутствует микроорганизмов периплазма , поэтому их связывающий белок часто представляет собой липопротеин, связанный с внешней стороной клеточной мембраны . У некоторых грамположительных бактерий БП слиты с трансмембранным доменом самого транспортера. Первой успешной рентгеновской кристаллической структурой неповрежденного импортера ABC является переносчик молибдена (ModBC-A) из Archaeoglobus fulgidus . Структуры с атомным разрешением трех других импортеров бактерий, E. coli BtuCD, E. coli переносчик мальтозы (MalFGK ₂ -E), и предполагаемый металл-хелатный переносчик Haemophilus influenzae , HI1470/1, также были определены. Структуры предоставили подробную картину взаимодействия трансмембранного и ABC-доменов, а также выявили две разные конформации с отверстием в двух противоположных направлениях. Другая общая черта импортеров заключается в том, что каждый NBD связан с одним TMD преимущественно через короткую цитоплазматическую спираль TMD, «связывающую спираль». Эта часть петли EAA стыкуется с поверхностной щелью, образованной между RecA-подобным и спиральным субдоменами ABC, и лежит примерно параллельно бислою мембраны.

Крупные импортеры ABC

BtuCD и HI1470/1 классифицируются как крупные импортеры ABC (тип II). Трансмембранная субъединица импортера витамина B12 _, BtuCD, содержит 10 спиралей ТМ, а функциональная единица состоит из двух копий нуклеотидсвязывающего домена (NBD) и трансмембранного домена (TMD). TMD и NBD взаимодействуют друг с другом через цитоплазматическую петлю между двумя спиралями TM и петлю Q в ABC. В отсутствие нуклеотида два домена ABC свернуты, и интерфейс димера открыт. Сравнение структур со связывающим белком (BtuCDF) и без (BtuCD) показывает, что BtuCD имеет отверстие, обращенное к периплазме, тогда как у BtuCDF обращенная наружу конформация закрыта с обеих сторон мембраны. Структуры BtuCD и гомолога BtuCD, HI1470/1, представляют два разных конформационных состояния транспортера ABC. Предсказанный путь транслокации в BtuCD открыт в периплазму и закрыт на цитоплазматической стороне мембраны, тогда как путь HI1470/1 обращен в противоположном направлении и открыт только в цитоплазму. Разница в структурах заключается в повороте одной субъединицы ТМ на 9° относительно другой.

Мелкие импортеры ABC

Структуры ModBC-A и MalFGK ₂ -E, находящиеся в комплексе со связывающим их белком, соответствуют небольшим (тип I) импортерам ABC. TMD ModBC-A и MalFGK ₂ -E имеют только шесть спиралей на субъединицу. Годимер ModBC-A находится в конформации, в которой субъединицы TM (ModB) ориентированы в перевернутой V-образной форме с полостью, доступной для цитоплазмы. Субъединицы ABC (ModC), с другой стороны, расположены в открытой, свободной от нуклеотидов конформации, в которой P-петля одной субъединицы обращена к мотиву LSGGQ другой, но отделена от него. Связывающий белок ModA находится в закрытой конформации с субстратом, связанным в щели между двумя его долями и прикрепленным к внеклеточным петлям ModB, при этом субстрат расположен непосредственно над закрытым входом транспортера. Структура MalFGK ₂ -E напоминает каталитическое переходное состояние гидролиза АТФ. Он находится в закрытой конформации, где содержит две молекулы АТФ, зажатые между мотивами Уокера A и B одной субъединицы и мотивом LSGGQ другой субъединицы. Белок, связывающий мальтозу (MBP или MalE), пристыкован к периплазматической стороне субъединиц TM (MalF и MalG), а на границе раздела MalF и MalG можно обнаружить большую закрытую полость. Спирали ТМ расположены в конформации, закрытой по отношению к цитоплазме, но с отверстием, обращенным наружу. Структура предполагает возможность того, что MBP может стимулировать АТФазная активность переносчика при связывании.

Механизм транспортировки для импортеров

Предлагаемый механизм транспортировки для импортеров ABC. Эта модель поочередного доступа была основана на кристаллических структурах ModBC-A. и HI1470/1.

Механизм транспортировки импортеров поддерживает модель поочередного доступа. В состоянии покоя импортеры обращены внутрь, при этом интерфейс димера нуклеотидсвязывающего домена (NBD) удерживается открытым благодаря TMD и обращен наружу, но закрыт от цитоплазмы. При стыковке закрытого связывающего белка, нагруженного субстратом, к периплазматической стороне трансмембранных доменов, АТФ связывается, и димер NBD закрывается. Это переключает состояние покоя транспортера в конформацию, обращенную наружу, в которой TMD переориентируются для получения субстрата от связывающего белка. После гидролиза АТФ димер NBD открывается и субстрат высвобождается в цитоплазму. Высвобождение ADP и Pi _{возвращает} транспортер в состояние покоя. Единственное несоответствие этого механизма модели АТФ-переключения состоит в том, что конформация в состоянии покоя, без нуклеотидов, отличается от ожидаемой конформации, обращенной наружу. Хотя это так, ключевым моментом является то, что NBD не димеризуется, если АТФ и связывающий белок не связаны с транспортером.

Экспортеры ABC

Прокариотические экспортеры ABC многочисленны и имеют близких гомологов у эукариот. Этот класс транспортеров изучается в зависимости от типа транспортируемого субстрата. Один класс участвует в экспорте белков (например, токсинов , гидролитических ферментов , белков S-слоя, лантибиотиков , бактериоцинов и факторов компетентности), а другой — в оттоке лекарств. Транспортеры ABC привлекли широкое внимание, поскольку они способствуют устойчивости клеток к антибиотикам и противораковым агентам, выкачивая лекарства из клеток. Общим механизмом является сверхэкспрессия экспортеров ABC, таких как P-гликопротеин (P-gp/ABCB1), белок 1, связанный с множественной лекарственной устойчивостью ( MRP1 / ABCC1 ), и белок устойчивости к раку молочной железы (BCRP/ABCG2) в раковых клетках, которые ограничивают воздействие. к противораковым препаратам.

У грамотрицательных организмов транспортеры ABC опосредуют секрецию белковых субстратов одновременно через внутреннюю и внешнюю мембраны, не проходя через периплазму. Этот тип секреции называется секрецией типа I , который включает в себя три компонента, которые функционируют согласованно: экспортер ABC , белок слияния мембран (MFP) и фактор внешней мембраны (OMF) . Примером является секреция гемолизина (HlyA) из E. coli , где транспортер ABC внутренней мембраны HlyB взаимодействует со слитым белком внутренней мембраны HlyD и фасилитатором внешней мембраны TolC. TolC позволяет гемолизину транспортироваться через две мембраны, минуя периплазму.

Устойчивость бактерий к лекарствам становится все более серьезной проблемой здравоохранения. Один из механизмов лекарственной устойчивости связан с увеличением оттока антибиотиков из бактериальной клетки. Лекарственная устойчивость, связанная с оттоком лекарственного средства, опосредованным P-гликопротеином , первоначально была обнаружена в клетках млекопитающих. У бактерий Леви и его коллеги представили первые доказательства того, что устойчивость к антибиотикам вызвана активным выбросом лекарства. P-гликопротеин является наиболее изученным эффлюксным насосом и, как таковой, позволил получить важную информацию о механизме бактериальных насосов. Хотя некоторые экспортеры перевозят определенный тип субстрата, большинство перевозчиков экспортируют наркотики разнообразного класса с различной структурой. Эти транспортеры обычно называют транспортерами ABC с множественной лекарственной устойчивостью (MDR) и иногда называют «гидрофобными пылесосами».

P-гликопротеин человека ABCB1/MDR1

Основная статья: P-гликопротеин

P-гликопротеин (3.A.1.201.1) представляет собой хорошо изученный белок, связанный с множественной лекарственной устойчивостью. Он принадлежит к семейству ABCB человека (MDR/TAP) и также известен как ABCB1 или MDR1 Pgp . MDR1 состоит из функционального мономера с двумя трансмембранными доменами (TMD) и двумя нуклеотидсвязывающими доменами (NBD). Этот белок может транспортировать преимущественно катионные или электронейтральные субстраты, а также широкий спектр амфифильных субстратов. Структура полноразмерного мономера ABCB1 была получена в присутствии и в отсутствие нуклеотида с помощью электронной криокристаллографии . Без нуклеотида TMD примерно параллельны и образуют бочонок, окружающий центральную пору, с отверстием, обращенным к внеклеточной стороне мембраны и закрытым на внутриклеточной стороне. В присутствии негидролизуемого аналога АТФ, AMP-PNP, TMD претерпевают существенную реорганизацию с появлением трех четко разделенных доменов. Центральная пора, заключенная между ВНЧС, слегка открыта по направлению к внутриклеточной поверхности с зазором между двумя доменами, обеспечивающим доступ субстрата из липидной фазы. Существенная переупаковка и возможное вращение спиралей ТМ при связывании нуклеотидов позволяют предположить модель вращения спирали для механизма транспорта.

Транспортеры растений

Геном модельного растения Arabidopsis thaliana способен кодировать 120 белков ABC по сравнению с 50-70 белками ABC, которые кодируются геномом человека и дрозофилы ( Drosophila melanogaster ). Растительные белки ABC подразделяются на 13 подсемейств на основе размера (полный, половинный или четверть), ориентации и общего сходства аминокислотных последовательностей. Гомологи с множественной лекарственной устойчивостью (MDR), также известные как P-гликопротеины, представляют собой самое большое подсемейство растений, состоящее из 22 членов, и второе по величине подсемейство ABC в целом. Подсемейство B растительных ABC-транспортеров (ABCB) характеризуется локализацией на плазматической мембране. Растительные транспортеры ABCB характеризуются гетерологичной экспрессией их в Escherichia coli , Saccharomyces cerevisiae , Schizosaccharomyces pombe (делящиеся дрожжи) и клетках HeLa для определения субстратной специфичности. Было показано, что растительные транспортеры ABCB транспортируют фитогормон индол-3-уксусную кислоту (IAA). также известный как ауксин , важный регулятор роста и развития растений. Направленный полярный транспорт ауксина опосредует реакцию растений на окружающую среду посредством таких процессов, как фототропизм и гравитропизм. Два наиболее изученных транспортера ауксина, ABCB1 и ABCB19, являются основными экспортерами ауксина. Другие транспортеры ABCB, такие как ABCB4, участвуют как в экспорте, так и в импорте ауксина. При низких внутриклеточных концентрациях ауксина ABCB4 импортирует ауксин до тех пор, пока не достигнет определенного порога, который затем меняет функцию на экспорт только ауксина.

Сав1866

Первой структурой высокого разрешения, о которой сообщалось для экспортера ABC, была структура Sav1866 (3.A.1.106.2) из ​​Staphylococcus aureus . Sav1866 является гомологом мультилекарственных переносчиков ABC. Он демонстрирует значительное сходство последовательностей с человеческими транспортерами ABC подсемейства B, которое включает MDR1 и TAP1/TAP2. Известно, что АТФазная активность Sav1866 стимулируется противораковыми препаратами, такими как доксорубицин , винбластин и другие. что предполагает сходную субстратную специфичность с P-гликопротеином и, следовательно, возможный общий механизм транслокации субстрата. Sav1866 представляет собой гомодимер полупереносчиков, каждая субъединица содержит N-концевой TMD с шестью спиралями и C-концевой NBD. NBD по структуре аналогичны структурам других транспортеров ABC, в которых два сайта связывания АТФ образуются на границе димера между мотивом Walker A одного NBD и мотивом LSGGQ другого. Связанная с ADP структура Sav1866 показывает, что NBDs находятся в закрытом димере, а спирали TM разделены на два «крыла», ориентированных к периплазме, образуя обращенную наружу конформацию. Каждое крыло состоит из спиралей ТМ1-2 одной субъединицы и ТМ3-6 другой субъединицы. Он содержит длинные внутриклеточные петли (ICL или ICD), соединяющие TMD, которые выходят за пределы липидного бислоя в цитоплазму и взаимодействуют с 8 = D. В то время как импортеры содержат короткую спираль сцепления, которая контактирует с одним NBD, Sav1866 имеет две внутриклеточные спирали сцепления: одна (ICL1) контактирует с NBD обеих субъединиц, а другая (ICL2) взаимодействует только с противоположной субъединицей NBD.

МсбА

MsbA (3.A.1.106.1) представляет собой транспортер ABC с множественной лекарственной устойчивостью (MDR) и, возможно, липидную флиппазу . Это АТФаза , которая транспортирует липид А , гидрофобную часть липополисахарида (ЛПС), сахаролипида на основе глюкозамина, который составляет внешний монослой внешних мембран большинства грамотрицательных бактерий. Липид А является эндотоксином , поэтому потеря MsbA из клеточной мембраны или мутации , нарушающие транспорт, приводят к накоплению липида А во внутренней клеточной мембране, что приводит к гибели клетки. Он является близким бактериальным гомологом P-гликопротеина (Pgp) по гомологии белковых последовательностей и имеет перекрывающуюся субстратную специфичность с транспортером MDR-ABC LmrA из Lactococcus Lactis . MsbA из E. coli на 36% идентичен NH2 _- концевой половине человеческого MDR1, что указывает на общий механизм транспорта амфифатических и гидрофобных субстратов. Ген MsbA кодирует полупереносчик, содержащий трансмембранный домен (TMD), слитый с нуклеотидсвязывающим доменом (NBD). Он собран в виде гомодимера с общей молекулярной массой 129,2 кДа. MsbA содержит 6 TMD на периплазматической стороне, NBD, расположенный на цитоплазматической стороне клеточной мембраны, и внутриклеточный домен (ICD), соединяющий TMD и NBD. Эта консервативная спираль, идущая от сегментов ВНЧС в активный сайт НБД или рядом с ним, в значительной степени ответственна за перекрестные помехи между ВНЧС и НБД. В частности, ICD1 служит консервативной опорой, вокруг которой может вращаться NBD, что позволяет NBD диссоциировать и димеризоваться во время связывания и гидролиза АТФ.

Структуры MsbA, изображающие три конформационных состояния: открытое апо ( PDB : 3b5w ), закрытое апо ( PDB : 3b5x ) и связанное с нуклеотидом ( PDB : 3b60 ) .

Ранее опубликованные (а теперь отозванные) рентгеновские структуры MsbA не соответствовали бактериальному гомологу Sav1866. Структуры были повторно исследованы и обнаружена ошибка в назначении руки, что привело к неверным моделям MsbA. Недавно ошибки были исправлены и появились сообщения о новых структурах. В состоянии покоя E. coli MsbA имеет перевернутую V-образную форму с камерой, доступной внутрь транспортера, что указывает на открытую, обращенную внутрь конформацию . Контакты димера сосредоточены между внеклеточными петлями, и хотя NBD находятся на расстоянии ≈50 Å друг от друга, субъединицы обращены друг к другу. Расстояние между остатками в месте контакта димера подтверждено по сшиванию . экспериментами и исследования ЭПР-спектроскопии . Относительно большая камера позволяет вмещать большие группы головок сахара, такие как те, которые присутствуют в липиде А. Для перемещения больших групп сахарных головок через мембрану необходимы значительные конформационные изменения. Разница между двумя безнуклеотидными (апо) структурами заключается в повороте спиралей TM4/TM5 на ≈30° относительно спиралей TM3/TM6. В закрытом состоянии апо (из V. cholerae MsbA) NBD выровнены и хотя и ближе, но не образуют АТФ-сэндвич, а P-петли противоположных мономеров расположены рядом друг с другом. По сравнению с открытой конформацией, димерный интерфейс TMD в закрытой, обращенной внутрь конформации имеет обширные контакты. Для обеих апо-конформаций MsbA отверстие камеры обращено внутрь. Структура MsbA-AMP-PNP (5'-аденилил-β-γ-имидодифосфат), полученного из S. typhimurium , аналогична Sav1866. NBD в этой связанной с нуклеотидами, обращенной наружу конформации собираются вместе, образуя канонический сэндвич с димером АТФ, то есть нуклеотид расположен между P-петлей и мотивом LSGGQ. Конформационный переход от MsbA-закрытого-апо к MsbA-AMP-PNP включает два этапа, которые, скорее всего, являются согласованными: поворот на ≈10° спиралей TM4/TM5 по направлению к TM3/TM6, что приводит к сближению NBD, но не к выравниванию, за которым следует наклон спиралей ТМ4/ТМ5 из плоскости на ≈20°. Скручивающее движение приводит к отделению спиралей TM3/TM6 от TM1/TM2, что приводит к изменению конформации с внутренней на обращенную наружу. Таким образом, изменения как в ориентации, так и в расположении NBD резко перестраивают упаковку трансмембранных спиралей и эффективно переключают доступ к камере с внутреннего листка мембраны на внешний. Структуры, определенные для MsbA, являются основой для наклонной модели транспорта. Описанные структуры также подчеркивают динамическую природу экспортеров ABC, о чем также свидетельствуют исследования флуоресценции и ЭПР. Недавние работы привели к открытию ингибиторов MsbA.

Механизм транспорта для экспортеров

Предлагаемый механизм транспортировки для экспортеров ABC. Эта модель была основана на структурных и биохимических исследованиях MsbA.

Экспортеры ABC имеют транспортный механизм, который соответствует как модели попеременного доступа, так и модели ATP-переключения. В апо-состояниях экспортеров конформация обращена внутрь, а TMD и NBD расположены относительно далеко друг от друга, что позволяет разместить амфифильные или гидрофобные субстраты. В частности, для MsbA размер камеры достаточно велик, чтобы вместить группы сахаров из липополисахаридов (ЛПС). Как предположили несколько групп, связывание субстрата инициирует транспортный цикл. «Силовой удар», то есть связывание АТФ, которое вызывает димеризацию NBD и образование сэндвича АТФ, вызывает конформационные изменения в ДВНЧС. В MsbA группы сахарных головок изолируются внутри камеры во время «рабочего хода». Полость выстлана заряженными и полярными остатками, которые, вероятно, сольватируются, создавая энергетически невыгодную среду для гидрофобных субстратов и энергетически выгодную для полярных фрагментов амфифильных соединений или сахарных групп ЛПС. Поскольку липид не может быть стабильным в течение длительного времени в среде камеры, липид А и другие гидрофобные молекулы могут «перевернуться» в энергетически более выгодное положение внутри листка внешней мембраны. «Переворот» также может быть вызван сдвигом твердого тела TMD, в то время как гидрофобные хвосты LPS протаскиваются через липидный бислой. Переупаковка спиралей переводит конформацию во внешнее состояние. Гидролиз АТФ может расширить периплазматическое отверстие и подтолкнуть субстрат к внешнему листку липидного бислоя. Гидролиз второй молекулы АТФ и высвобождение P _i отделяет НБД с последующим восстановлением состояния покоя, открывая камеру в сторону цитоплазмы для следующего цикла.

Роль в множественной лекарственной устойчивости

Известно, что транспортеры ABC играют решающую роль в развитии множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). При МЛУ у пациентов, принимающих лекарства, в конечном итоге развивается устойчивость не только к препарату, который они принимают, но и к нескольким различным типам лекарств. Это вызвано несколькими факторами, одним из которых является усиленное выведение препарата из клетки транспортерами ABC. Например, белок ABCB1 ( P-гликопротеин ) участвует в выкачивании из клетки препаратов, подавляющих опухоль. Pgp, также называемый MDR1, ABCB1, является прототипом транспортеров ABC, а также наиболее широко изученным геном. Известно, что Pgp переносит органические катионные или нейтральные соединения. Также было продемонстрировано, что несколько членов семейства ABCC, также известных как MRP, придают МЛУ органическим анионным соединениям. Наиболее изученным членом семейства ABCG является ABCG2, также известный как BCRP (белок устойчивости к раку молочной железы), который обеспечивает устойчивость к большинству ингибиторов топоизомеразы I или II, таких как топотекан, иринотекан и доксорубицин.

Неясно, как именно эти белки могут перемещать такое большое количество лекарств, однако одна модель (модель гидрофобного пылесоса) утверждает, что в P-гликопротеине лекарства без разбора связываются с липидной фазой на основании их гидрофобности.

Открытие первого эукариотического белка-переносчика ABC произошло в результате исследований опухолевых клеток и культивируемых клеток, которые проявляли устойчивость к нескольким лекарствам с несвязанной химической структурой. Было показано, что эти клетки экспрессируют повышенные уровни транспортного белка множественной лекарственной устойчивости (MDR), который первоначально назывался P-гликопротеином (P-gp), но его также называют белком 1 множественной лекарственной устойчивости (MDR1) или ABCB1. Этот белок использует гидролиз АТФ , как и другие транспортеры ABC, для экспорта большого количества лекарств из цитозоля во внеклеточную среду. В клетках с множественной лекарственной устойчивостью ген MDR1 часто амплифицируется. Это приводит к значительному перепроизводству белка MDR1. Субстраты ABCB1 млекопитающих представляют собой в основном плоские жирорастворимые молекулы с одним или несколькими положительными зарядами. Все эти субстраты конкурируют друг с другом за транспорт, что позволяет предположить, что они связываются с одними и теми же или перекрывающимися сайтами белка. Многие из лекарств, транспортируемых ABCB1, представляют собой небольшие неполярные лекарства, которые диффундируют через из внеклеточной среды в цитозоль, где они блокируют различные клеточные функции. Такие лекарства, как колхицин и винбластин , которые блокируют сборку микротрубочек, свободно проникают через мембрану в цитозоль, но экспорт этих препаратов с помощью ABCB1 снижает их концентрацию в клетке. Следовательно, для уничтожения клеток, экспрессирующих ABCB1, требуется более высокая концентрация лекарств, чем для тех, которые не экспрессируют этот ген.

Другими переносчиками ABC, которые способствуют множественной лекарственной устойчивости, являются ABCC1 (MRP1) и ABCG2 (белок устойчивости к раку молочной железы).

Для решения проблем, связанных с множественной лекарственной устойчивостью MDR1, можно использовать разные типы лекарств или необходимо ингибировать сами ABC-транспортеры. Чтобы другие типы лекарств подействовали, они должны обойти механизм резистентности, которым является транспортер ABC. Для этого можно использовать другие противораковые препараты, такие как алкилирующие препараты ( циклофосфамид ), антиметаболиты ( 5-фторурацил ) и модифицированные антрациклином препараты ( аннамицин и доксорубицин -пептид). Эти лекарства не будут функционировать в качестве субстрата транспортеров ABC и, следовательно, не будут транспортироваться. Другой вариант — одновременное использование комбинации препаратов, ингибирующих ABC, и противораковых препаратов. Это могло бы обратить вспять резистентность к противораковым препаратам, чтобы они могли функционировать по назначению. Субстраты, которые обращают устойчивость к противораковым препаратам, называются химиосенсибилизаторами.

Обращение множественной лекарственной устойчивости

Лекарственная устойчивость — распространенная клиническая проблема, возникающая у пациентов с инфекционными заболеваниями и у больных раком. Прокариотические и эукариотические микроорганизмы, а также неопластические клетки часто оказываются устойчивыми к лекарствам. МЛУ часто связана со сверхэкспрессией транспортеров ABC. Ингибирование транспортеров ABC низкомолекулярными соединениями широко исследовалось у онкологических больных; однако клинические результаты оказались разочаровывающими. Недавно различные стратегии RNAi были применены для обращения вспять MDR в различных моделях опухолей, и эта технология эффективна в обращении вспять MDR, опосредованной ABC-транспортером, в раковых клетках и, следовательно, является многообещающей стратегией для преодоления MDR с помощью генной терапии. Технологию РНКи также можно рассматривать для преодоления МЛУ при инфекционных заболеваниях, вызванных микробными патогенами.

Физиологическая роль

Помимо обеспечения МЛУ в опухолевых клетках, транспортеры ABC также экспрессируются в мембранах здоровых клеток, где они облегчают транспорт различных эндогенных веществ, а также веществ, чужеродных для организма. Например, транспортеры ABC, такие как Pgp, MRP и BCRP, ограничивают всасывание многих лекарств из кишечника и перекачивают лекарства из клеток печени в желчь. как средство выведения инородных веществ из организма. Большое количество наркотиков либо транспортируются самими транспортерами ABC, либо влияют на транспортировку других наркотиков. Последний сценарий может привести к лекарственному взаимодействию . иногда это приводит к изменению действия лекарств.

Методы характеристики взаимодействия транспортеров ABC

Существует ряд типов анализов, которые позволяют обнаружить взаимодействие транспортера ABC с эндогенными и ксенобиотическими соединениями. Сложность анализа варьируется от относительно простых мембранных анализов. например, анализ везикулярного транспорта, анализ АТФазы и более сложные клеточные анализы, вплоть до сложных in vivo. Джеффри П., Саммерфилд С.Г. (2007). «Проблемы скрининга гематоэнцефалического барьера (ГЭБ)». Ксенобиотика . 37 (10–11): 1135–51. дои : 10.1080/00498250701570285 . ПМИД   17968740 . S2CID   25944548 . методологии обнаружения.

Мембранные анализы

Анализ везикулярного транспорта обнаруживает транслокацию молекул транспортерами ABC. Мембраны, приготовленные в подходящих условиях, содержат ориентированные изнутри наружу везикулы, причем сайт связывания АТФ и сайт связывания субстрата транспортера обращены к буферу снаружи. Субстраты транспортера поглощаются пузырьками АТФ-зависимым образом. Для отделения везикул от инкубационного раствора используют быструю фильтрацию с использованием фильтров из стекловолокна или нитроцеллюлозных мембран, а тестируемое соединение, захваченное внутри везикул, удерживается на фильтре. Количество транспортированных немеченых молекул определяют методами ВЭЖХ, ЖХ/МС, ЖХ/МС/МС. Альтернативно, соединения имеют радиоактивную метку, флуоресцируют или имеют флуоресцентную метку, так что радиоактивность или флуоресценцию, сохраняемую на фильтре, можно определить количественно.

В исследованиях везикулярного транспорта используются различные типы мембран из разных источников (например, клетки насекомых, трансфицированные или выбранные клеточные линии млекопитающих). Мембраны коммерчески доступны или могут быть получены из различных клеток или даже тканей, например мембран канальцев печени. Преимущество этого типа анализа заключается в измерении фактического распределения субстрата через клеточную мембрану. Его недостатком является то, что соединения со средней и высокой пассивной проницаемостью не удерживаются внутри везикул, что затрудняет проведение прямых измерений транспорта с этим классом соединений.

Анализ везикулярного транспорта можно проводить в «непрямом» режиме, когда взаимодействующие тестируемые лекарственные средства модулируют скорость транспорта репортерного соединения. Этот тип анализа особенно подходит для обнаружения возможных взаимодействий лекарственного средства и эндогенного субстрата. Он не чувствителен к пассивной проницаемости соединений и поэтому обнаруживает все взаимодействующие соединения. Тем не менее, он не дает информации о том, является ли тестируемое соединение ингибитором переносчика или субстратом переносчика, конкурентно ингибирующим его функцию. Типичным примером непрямого анализа везикулярного транспорта является обнаружение ингибирования транспорта таурохолата с помощью ABCB11 ( BSEP ).

Цельноклеточные анализы

Клетки, экспрессирующие транспортер оттока, активно выкачивают субстраты из клетки, что приводит к более низкой скорости накопления субстрата, более низкой внутриклеточной концентрации в равновесном состоянии или более быстрой скорости элиминации субстрата из клеток, нагруженных субстратом. Переносимые радиоактивные субстраты или меченые флуоресцентные красители можно измерить напрямую, или косвенно можно определить модуляцию накопления субстрата-зонда (например, флуоресцентных красителей, таких как родамин 123 или кальцеин) в присутствии тестируемого лекарственного средства.

Кальцеин-АМ. Высокопроницаемое производное кальцеина легко проникает в интактные клетки, где эндогенные эстеразы быстро гидролизуют его до флуоресцентного кальцеина. В отличие от кальцеина-АМ, кальцеин имеет низкую проницаемость и поэтому задерживается в клетке и накапливается. Поскольку кальцеин-AM является отличным субстратом отходящих транспортеров MDR1 и MRP1, клетки, экспрессирующие транспортеры MDR1 и/или MRP1, выкачивают кальцеин-AM из клетки до того, как эстеразы смогут его гидролизовать. Это приводит к снижению скорости клеточного накопления кальцеина. Чем выше активность MDR в клеточной мембране, тем меньше кальцеина накапливается в цитоплазме. В клетках, экспрессирующих MDR, добавление в избытке ингибитора MDR или субстрата MDR резко увеличивает скорость накопления кальцеина. Активность мультилекарственного переносчика отражается в разнице между количеством красителя, накопленного в присутствии и в отсутствие ингибитора. Используя селективные ингибиторы, можно легко различить транспортную активность MDR1 и MRP1. Этот анализ можно использовать для проверки лекарств на взаимодействие с транспортерами, а также для количественной оценки активности клеток с МЛУ. Анализ кальцеина является запатентованным анализом компании SOLVO Biotechnology.

Подсемейства

Подсемейства млекопитающих

У человека имеется 49 известных транспортеров ABC, которые Организация генома человека классифицирует на семь семейств.

Семья	Члены	Функция	Примеры
АБКА	Это семейство содержит одни из крупнейших переносчиков (длиной более 2100 аминокислот). Пять из них расположены кластером в хромосоме 17q24.	Отвечает, среди прочего, за транспортировку холестерина и липидов.	АБСА12 АБСА1
АВСВ	Состоит из 4 полных и 7 половинных транспортеров.	Некоторые из них расположены, например, в гематоэнцефалическом барьере, печени, митохондриях, транспортируют пептиды и желчь.	АВСВ5
АВСС	Состоит из 12 полноценных транспортеров.	Используется в транспорте ионов, рецепторах клеточной поверхности, секреции токсинов. Включает белок CFTR, которого вызывает муковисцидоз . дефицит	АВСС6
АВСD	Состоит из 4 полутранспортеров.	Все они используются в пероксисомах .	ABCD1
ABCE/ABCF	Состоит из 1 белка ABCE и 3 белков ABCF.	На самом деле это не транспортеры, а просто АТФ-связывающие домены, происходящие из семейства ABC, но без трансмембранных доменов. Эти белки в основном регулируют синтез или экспрессию белков.	ABCE1 , ABCF1 , ABCF2
АБЦГ	Состоит из 6 «реверсивных» полутранспортеров, с НБФ на НХ 3. + конец и TM на конце COO-.	Транспортирует липиды, различные лекарственные субстраты, желчь, холестерин и другие стероиды.	АВСG2 АВСG1

Полный список человеческих переносчиков ABC можно найти на сайте .

АБКА

Подсемейство ABCA состоит из 12 полноценных транспортеров, разделенных на две подгруппы. Первая подгруппа состоит из семи генов, которые соответствуют шести различным хромосомам . Это ABCA1 , ABCA2 , ABCA3 и ABCA4 , ABCA7 , ABCA12 и ABCA13 . Другая подгруппа состоит из ABCA5 и ABCA6 , а также ABCA8 , ABCA9 и ABCA10 . А8-10. Вся подгруппа 2 организована в кластер хромосом от головы до хвоста на хромосоме 17q 24. Гены этой второй подгруппы отличаются от ABCA1-подобных генов наличием 37-38 экзонов в отличие от 50 экзонов в ABCA1. Подгруппа ABCA1 участвует в развитии генетических заболеваний. При рецессивной болезни Танжера белок ABCA1 мутирует. Кроме того, ABCA4 соответствует участку хромосомы 1p21, который содержит ген болезни Штаргардта. Обнаружено, что этот ген высоко экспрессируется в палочковидных фоторецепторах и мутирует при болезни Штаргардта, рецессивном пигментном ретините и большинстве случаев рецессивной колбочко-палочковидной дистрофии.

АВСВ

Подсемейство ABCB состоит из четырех полных транспортеров и двух полутранспортеров. Это единственное человеческое подсемейство, имеющее как половинные, так и полные типы транспортеров. ABCB1 был обнаружен как белок, сверхэкспрессируемый в некоторых опухолевых клетках, устойчивых к лекарствам. Он экспрессируется в первую очередь в гематоэнцефалическом барьере и печени и, как полагают, участвует в защите клеток от токсинов. Клетки, которые сверхэкспрессируют этот белок, обладают множественной лекарственной устойчивостью .

АВСС

Подсемейство ABCC содержит тринадцать членов, и девять из этих переносчиков называются белками множественной лекарственной устойчивости (MRP). Белки MRP встречаются повсюду в природе и выполняют множество важных функций. Известно, что они участвуют в транспорте ионов, секреции токсинов и передаче сигналов. Из девяти белков MRP четыре из них, MRP4, 5, 8, 9 (ABCC4, 5, 11 и 12), имеют типичную структуру ABC с четырьмя доменами, состоящими из двух перекрывающих мембрану доменов, за каждым протягивающим доменом следует нуклеотидсвязывающий домен. Их называют короткими MRP. Остальные 5 MRP (MRP1, 2, 6, 7) (ABCC1, 2, 3, 6 и 10) известны как длинные MRP и имеют дополнительный пятый домен на своем N-конце .

CFTR , транспортер, участвующий в заболевании муковисцидозом , также считается частью этого подсемейства. Муковисцидоз возникает при мутации и потере функции CFTR.

Рецепторы сульфонилмочевины (SUR) , участвующие в секреции инсулина, функциях нейронов и мышцах, также являются частью этого семейства белков. Мутации в белках SUR являются потенциальной причиной неонатального сахарного диабета . SUR также является местом связывания таких препаратов, как сульфонилмочевины и активаторов открытия калиевых каналов, таких как диазоксид .

АВСD

Подсемейство ABCD состоит из четырех генов, которые кодируют полупереносчики, экспрессируемые исключительно в пероксисоме . ABCD1 отвечает за Х-сцепленную форму адренолейкодистрофии (АЛД), которая представляет собой заболевание, характеризующееся нейродегенерацией и недостаточностью надпочечников, которое обычно начинается в позднем детстве. В клетках больных АЛД наблюдается накопление неразветвленных насыщенных жирных кислот, однако точная роль ABCD1 в этом процессе до сих пор не определена. Кроме того, функция других генов ABCD еще не определена, но считается, что они оказывают сходные функции в метаболизме жирных кислот .

ABCE и ABCF

Обе эти подгруппы состоят из генов, которые имеют АТФ-связывающие домены, тесно связанные с другими транспортерами ABC, но эти гены не кодируют трансмембранные домены. ABCE состоит только из одного члена, OABP или ABCE1 , который, как известно, распознает определенные олигодендроциты, образующиеся в ответ на определенные вирусные инфекции. Каждый член подгруппы ABCF состоит из пары доменов связывания АТФ.

АБЦГ

Шесть полупереносчиков с сайтами связывания АТФ на N-конце и трансмембранными доменами на C-конце составляют подсемейство ABCG. Эта ориентация противоположна всем другим генам ABC. В геноме человека всего 5 генов ABCG, но в геноме дрозофилы их 15, а в дрожжах — 10. Ген ABCG2 был обнаружен в клеточных линиях, отобранных по высокому уровню устойчивости к митоксантрону и отсутствию экспрессии ABCB1 или ABCC1 . ABCG2 может экспортировать противораковые препараты антрациклина , а также топотекан , митоксантрон или доксорубицин в качестве субстратов. хромосомные транслокации вызывают амплификацию или перестройку ABCG2, обнаруженную в устойчивых клеточных линиях. Было обнаружено, что

Межвидовые подсемейства

В TCDB построена следующая система классификации трансмембранных переносчиков растворенных веществ.

Три семьи экспортеров ABC определяются своим эволюционным происхождением. Экспортеры ABC1 эволюционировали путем внутригенного трипликации предшественника 2 TMS (TMS = трансмембранный сегмент. Белок «2 TMS» имеет 2 трансмембранных сегмента), чтобы дать 6 белков TMS. Экспортеры ABC2 возникли в результате внутригенного дупликации предшественника 3 TMS, а экспортеры ABC3 произошли от предшественника 4 TMS, который дублировался либо экстрагенно, чтобы дать два белка 4 TMS, оба необходимые для транспортной функции, либо внутригенно, чтобы дать 8 или 10 белков TMS. По-видимому, 10 белков TMS имеют два дополнительных TMS между двумя 4 повторными единицами TMS. Большинство систем поглощения (все, кроме 3.A.1.21) относятся к типу ABC2, разделенному на тип I и тип II по способу обращения с нуклеотидами. Особое подсемейство импортеров ABC2, называемое ECF, использует отдельную подъединицу для распознавания субстрата.

ABC1 ( ИнтерПро : IPR036640 ):

• 3.A.1.106 Семейство экспортеров липидов (LipidE)
• 3.A.1.108 Семейство экспортеров β-глюканов (GlucanE)
• 3.A.1.109 Семейство экспортеров белка-1 (Prot1E)
• 3.A.1.110 Семейство экспортеров белка-2 (Prot2E)
• 3.A.1.111 Семейство экспортеров пептида-1 (Pep1E)
• 3.A.1.112 Семейство экспортеров пептида-2 (Pep2E)
• 3.A.1.113 Семейство экспортеров пептида-3 (Pep3E)
• 3.A.1.117 Семья экспортеров наркотиков-2 (DrugE2)
• 3.A.1.118 Семейство экспортеров Microcin J25 (McjD)
• 3.A.1.119 Семейство экспортеров лекарств/сидерофоров-3 (DrugE3)
• 3.A.1.123 Семейство экспортеров пептида-4 (Pep4E)
• 3.A.1.127 Семейство экспортеров пептидов AmfS (AmfS-E)
• 3.A.1.129 Семейство экспортеров цистеина CydDC (CydDC-E)
• 3.A.1.135 Семья экспортеров наркотиков-4 (DrugE4)
• 3.A.1.139 Семейство экспортеров UDP-глюкозы (U-GlcE) (семейство UPF0014)
• 3.A.1.201 Семейство экспортеров множественной лекарственной устойчивости (MDR) (ABCB)
• 3.A.1.202 Семейство экспортеров трансмембранной проводимости муковисцидоза (CFTR) (ABCC)
• 3.A.1.203 Семейство пероксисомальных транспортеров жирных ацил-КоА (P-FAT) (ABCD)
• 3.A.1.206 Семейство экспортеров половых феромонов (STE) a-фактора (ABCB)
• 3.A.1.208 Семейство переносчиков лекарственных конъюгатов (DCT) (ABCC) (Dębska et al., 2011)
• 3.A.1.209 Семейство переносчиков пептидов MHC (TAP) (ABCB)
• 3.A.1.210 Семейство транспортеров тяжелых металлов (HMT) (ABCB)
• 3.A.1.212 Семейство экспортеров митохондриальных пептидов (MPE) (ABCB)
• сидерофор-Fe3+ 3.A.1.21 Семейство переносчиков поглощения (SIUT)

ABC2 ( InterPro : IPR000412 [частично]):

• 3.A.1.101 Семейство экспортеров капсульных полисахаридов (CPSE)
• 3.A.1.102 Семейство экспортеров липоолигосахаридов (LOSE)
• 3.A.1.103 Семейство экспортеров липополисахаридов (LPSE)
• 3.A.1.104 Семья экспортеров тейхоевой кислоты (TAE)
• 3.A.1.105 Семья экспортеров наркотиков-1 (DrugE1)
• 3.A.1.107 Семейство предполагаемых экспортеров гема (HemeE)
• 3.A.1.115 Семейство экспортеров Na+ (NatE)
• 3.A.1.116 Семейство экспортеров Microcin B17 (McbE)
• 3.A.1.124 Семейство трехкомпонентных экспортеров пептида-5 (Pep5E)
• 3.A.1.126 Семейство экспортеров β-экзотоксина I (βETE)
• 3.A.1.128 Семейство экспортеров пептидов SkfA (SkfA-E)
• 3.A.1.130 Семейство экспортеров нескольких лекарств/гемолизина (MHE)
• 3.A.1.131 Семейство резистентности к бацитрацину (Bcr)
• 3.A.1.132 Семейство транспортеров ABC Gliding Motility (Gld)
• 3.A.1.133 Семейство экспортеров пептида-6 (Pep6E)
• 3.A.1.138 Неизвестное семейство типа ABC-2 (ABC2-1).
• 3.A.1.141 Семейство экспортеров этилвиологена (EVE) (семейство DUF990; InterPro : IPR010390 )
• 3.A.1.142 Семейство гликолипид-флиппаз (GLFlippase)
• 3.A.1.143 Система секреции экзопротеинов (EcsAB(C))
• 3.A.1.144: Функционально нехарактеризованное семейство ABC2-1 (ABC2-1)
• 3.A.1.145: Слитое с пептидазой функционально неохарактеризованное семейство ABC2-2 (ABC2-2)
• 3.A.1.146: Семейство экспортеров актинородина (ACT) и ундецилпродигиозина (RED) (ARE).
• 3.A.1.147: Функционально нехарактеризованное семейство ABC2-2 (ABC2-2)
• 3.A.1.148: Функционально нехарактеризованное семейство ABC2-3 (ABC2-3)
• 3.A.1.149: Функционально нехарактеризованное семейство ABC2-4 (ABC2-4)
• 3.A.1.150: Функционально нехарактеризованное семейство ABC2-5 (ABC2-5)
• 3.A.1.151: Функционально нехарактеризованное семейство ABC2-6 (ABC2-6)
• 3.A.1.152: Семейство экспортных липополисахаридов (LptBFG) ( InterPro : IPR005495 )
• 3.A.1.204 Семейство транспортеров предшественников глазного пигмента (EPP) (ABCG)
• 3.A.1.205 Семейство плейотропной лекарственной устойчивости (PDR) (ABCG)
• 3.A.1.211 Семейство холестерин/фосфолипид/ретиналь (CPR) флиппаз (ABCA)
• 9.B.74 Семейство белков фаговой инфекции (PIP)
• все системы поглощения (3.A.1.1 – 3.A.1.34, кроме 3.A.1.21)
  • 3.A.1.1 Транспортер поглощения углеводов-1 (CUT1)
  • 3.A.1.2 Транспортер поглощения углеводов-2 (CUT2)
  • 3.A.1.3 Транспортер поглощения полярных аминокислот (PAAT)
  • 3.A.1.4 Гидрофобный переносчик поглощения аминокислот (HAAT)
  • 3.A.1.5 Транспортер поглощения пептидов/опинов/никеля (PepT)
  • 3.A.1.6 Сульфат/вольфраматный переносчик поглощения (SulT)
  • 3.A.1.7 Транспортер поглощения фосфата (PhoT)
  • 3.A.1.8 Транспортер поглощения молибдата (MolT)
  • 3.A.1.9 Транспортер поглощения фосфоната (PhnT)
  • 3.A.1.10 Транспортер поглощения трехвалентного железа (FeT)
  • 3.A.1.11 Транспортер поглощения полиаминов/опинов/фосфонатов (POPT)
  • 3.A.1.12 Транспортер поглощения четвертичного амина (QAT)
  • 3.A.1.13 Транспортер поглощения витамина B12 ₍ B12T)
  • 3.A.1.14 Транспортер поглощения хелата железа (FeCT)
  • 3.A.1.15 Хелатный переносчик марганца/цинка/железа (MZT)
  • 3.A.1.16 Транспортер поглощения нитратов/нитритов/цианатов (NitT)
  • 3.A.1.17 Транспортер поглощения таурина (TauT)
  • 3.A.1.19 Транспортер захвата тиамина (ThiT)
  • 3.A.1.20 Транспортер железа Brachyspira (BIT)
  • 3.A.1.21 Транспортер поглощения сидерофора-Fe3+ (SIUT)
  • 3.A.1.24 Семейство транспортеров захвата метионина (MUT) (аналогично 3.A.1.3 и 3.A.1.12)
  • 3.A.1.27 Семейство γ-гексахлорциклогексана (ГХГ) (аналогично 3.A.1.24 и 3.A.1.12)
  • 3.A.1.34 Семейство триптофана (TrpXYZ)
  • Системы поглощения ECF
    • 3.A.1.18 Семейство транспортеров поглощения кобальта (CoT)
    • 3.A.1.22 Семейство транспортеров поглощения никеля (NiT)
    • 3.A.1.23 Семейство переносчиков поглощения никеля/кобальта (NiCoT)
    • 3.A.1.25 Семейство транспортеров поглощения биотина (BioMNY)
    • 3.A.1.26 Семейство предполагаемых транспортеров захвата тиамина (ThiW)
    • 3.A.1.28 Семейство кевозина (кеуозин)
    • 3.A.1.29 Семейство предшественников метионина (Met-P)
    • 3.A.1.30 Семейство предшественников тиамина (Thi-P)
    • 3.A.1.31 Семейство Unknown-ABC1 (U-ABC1)
    • 3.A.1.32 Семейство предшественников кобаламина (B12-P)
    • 3.A.1.33 Семейство метилтиоаденозина (МТА)

ABC3 ( ИнтерПро : IPR003838 ):

• 3.A.1.114 Семейство вероятных экспортеров гликолипидов (DevE)
• 3.A.1.122 Семейство экспортеров макролидов (MacB)
• 3.A.1.125 Семейство липопротеинтранслоказ (LPT)
• 3.A.1.134 Семейство экспортеров пептида-7 (Pep7E)
• 3.A.1.136 Неохарактеризованное семейство типа ABC-3 (U-ABC3-1)
• 3.A.1.137 Неохарактеризованное семейство типа ABC-3 (U-ABC3-2)
• 3.A.1.140 Семейство септаций FtsX/FtsE (FtsX/FtsE)
• 3.A.1.207 Семейство эукариот ABC3 (E-ABC3)

Изображения

В последние годы создано множество структур водорастворимых доменов белков ABC.

См. также

• АТФ-связывающий домен транспортеров ABC
• Трансмембранный домен транспортеров ABC
• Элизабет П. Карпентер , британский структурный биолог, первой описавшая структуру человеческого ABC-транспортера ABC10.

Дальнейшее чтение

• Сентпетери З, Керн А, Лилиом К, Саркади Б, Варади А, Бакос Э (октябрь 2004 г.). «Роль консервативных глицинов сигнатурных мотивов АТФ-связывающей кассеты MRP1 в связи между сайтом связывания субстрата и каталитическими центрами» . Журнал биологической химии . 279 (40): 41670–8. дои : 10.1074/jbc.M406484200 . ПМИД   15252017 .
• Фицджеральд М.Л., Окухира К., Шорт Г.Ф., Мэннинг Дж.Дж., Белл С.А., Фриман М.В. (ноябрь 2004 г.). «АТФ-связывающий кассетный транспортер А1 содержит новый С-концевой мотив VFVNFA, который необходим для оттока холестерина и активности связывания ApoA-I» . Журнал биологической химии . 279 (46): 48477–85. дои : 10.1074/jbc.M409848200 . ПМИД   15347662 .
• Линтон К.Дж. (2011). ABC-переносчики физиологии и болезней человека: генетика и биохимия АТФ-связывающей кассеты . Всемирная научная. ISBN  978-981-4280-06-8 . Архивировано из оригинала 11 мая 2012 г. Проверено 16 мая 2012 г.

Внешние ссылки

• Классификация транспортеров ABC в TCDB
• ABCdb База данных архейных и бактериальных систем ABC, ABCdb
• АТФ-связывание + кассета + транспортеры в Национальной медицинской библиотеке США по медицинским предметным рубрикам (MeSH)