Хемопротеомика
Хемопротеомика (также известная как химическая протеомика ) включает в себя широкий спектр методов, используемых для идентификации и исследования взаимодействий белок - малые молекулы . [1] Хемопротеомика дополняет открытие фенотипических лекарств , парадигму, целью которой является обнаружение ведущих соединений на основе облегчения фенотипа заболевания , в отличие от открытия лекарств, основанного на мишени (обратная фармакология) , в которой ведущие соединения предназначены для взаимодействия с заранее определенными биологическими агентами , вызывающими заболевание. цели . [2] Поскольку фенотипические исследования соединения по открытию лекарств не обеспечивают подтверждения механизма действия , хемопротеомика обеспечивает ценные стратегии последующего наблюдения, позволяющие сузить потенциальные мишени и в конечном итоге подтвердить молекулы действия механизм . [2] Хемопротеомика также пытается решить проблему, присущую неразборчивости лекарств при низкомолекулярных открытии лекарств , путем анализа взаимодействий белка с малыми молекулами в масштабе всего протеома . Основная цель хемопротеомики — охарактеризовать интерактом потенциальных лекарств , чтобы получить представление о механизмах нецелевой токсичности и полифармакологии . [3]
Хемопротеомные анализы можно разделить на три основных типа. Подходы, основанные на растворах, включают использование аналогов лекарств, которые химически модифицируют целевые белки в растворе , помечая их для идентификации. Подходы, основанные на иммобилизации, направлены на изолирование потенциальных мишеней или лигандов путем прикрепления их партнеров по связыванию к неподвижной опоре. Подходы без дериватизации направлены на вывод о взаимодействии лекарственного средства с мишенью путем наблюдения за изменениями в стабильности белка или хроматографии лекарственного средства после связывания. Вычислительные методы дополняют набор хемопротеомных инструментов в качестве параллельных линий доказательств, подтверждающих потенциальные пары лекарство -мишень, и используются для создания структурных моделей , которые служат основой для оптимизации потенциальных клиентов . несколько мишеней для высококлассных лекарств С помощью хемопротеомики было идентифицировано масс-спектрометров , а продолжающееся улучшение чувствительности и технологии химических зондов указывает на то, что хемопротеомика будет играть большую роль в будущих открытиях лекарств .
Фон
[ редактировать ]Контекст
[ редактировать ]
За завершением проекта «Геном человека» последовала надежда на новую парадигму лечения болезней. Многие смертельные и трудноизлечимые заболевания удалось сопоставить с конкретными генами , что стало отправной точкой для лучшего понимания роли их белковых продуктов в заболевании. При открытии лекарств использовались модели нокаута на животных , которые подчеркивают влияние отсутствия белка , особенно на развитие заболеваний, а химики-медики использовали вычислительную химию для создания соединений с высоким сродством к белкам, вызывающим заболевания. [3] Тем не менее, FDA за последнее десятилетие уровень одобрения лекарств снизился. [4] Одним из потенциальных источников неудач в разработке лекарств является несоответствие между ранним и поздним открытием лекарств . [3] Раннее открытие лекарств сосредоточено на генетической проверке мишени, что является надежным предиктором успеха, но системы нокаута и сверхэкспрессии упрощены. Пространственно и во времени условные нокаут - нокаут- системы улучшили уровень нюансов in vivo анализа функций белков , но все еще не могут полностью соответствовать системной широте фармакологического действия. [3] Например, наркотики часто действуют через несколько механизмов и часто действуют лучше всего, если частично воздействовать на цель . [3] Хемопротеомные инструменты предлагают решение, позволяющее преодолеть разрыв между генетическим пониманием болезни и фармакологическим пониманием действия лекарств путем выявления множества белков, участвующих в терапевтическом успехе.
Основные инструменты
[ редактировать ]Набор хемопротеомных инструментов основан на , основанной на жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС или ЖХ-МС) количественной протеомике , которая позволяет практически полную идентификацию и относительную количественную оценку сложных протеомов в биологических образцах. [5] Помимо протеомного анализа, также возможно обнаружение посттрансляционных модификаций , таких как фосфорилирование , гликозилирование , ацетилирование и, в последнее время, убиквитинирование , которые дают представление о функциональном состоянии клетки. [5] Подавляющее большинство протеомных исследований анализируются с использованием высокого разрешения с орбитальной ловушкой масс-спектрометров , а образцы обрабатываются с использованием обобщаемого рабочего процесса. Стандартная процедура начинается с лизиса образца , при котором белки экстрагируются в денатурирующий буфер, содержащий соли , агент, восстанавливающий дисульфидные связи , такой как дитиотреитол , и алкилирующий агент , блокирующий тиоловые группы , такой как йодацетамид . Денатурированные белки подвергаются протеолизу , часто с помощью трипсина , а затем отделяются от других компонентов смеси перед анализом с помощью ЖХ-МС/МС . Для более точного количественного определения различные образцы можно подвергнуть реакции с изобарическими тандемными массовыми метками (TMT), формой химического штрих-кода, позволяющей мультиплексировать образцы , а затем объединить их. [5]
Подходы, основанные на решениях
[ редактировать ]
Широкое протеомное и транскриптомное профилирование привело к бесчисленным достижениям в биомедицинском пространстве, но характеристика экспрессии РНК и белков ограничена в своей способности предоставлять информацию о функциональных характеристиках белков . Учитывая, что информация об экспрессии транскриптов и белков оставляет пробелы в знаниях о влиянии посттрансляционных модификаций и белок-белковых взаимодействий на активность ферментов , и что активность ферментов варьируется в зависимости от типа клеток , болезненных состояний и физиологических состояний , необходимы специальные инструменты для профилирования. активность ферментов в разных контекстах. [6] Кроме того, многие идентифицированные ферменты недостаточно охарактеризованы, чтобы выявить действенные механизмы, на которых можно было бы основывать функциональные анализы. Без основы для функционального биохимического анализа необходимы химические инструменты для обнаружения взаимодействий лекарств и белков.
Профилирование белков на основе активности
[ редактировать ]Профилирование белков на основе активности ( ABPP , также протеомика на основе активности ) — это метод, который был разработан для мониторинга доступности ферментативных активных центров для их эндогенных лигандов . [5] ABPP использует специально разработанные зонды и образуют ковалентную связь с ним, что подтверждает, что фермент находится в активном состоянии. , которые входят в активный центр фермента [7] Зонд обычно является аналогом лекарства, механизм действия которого изучается, поэтому ковалентное мечение фермента указывает на связывание лекарства. Зонды ABPP имеют три ключевых функциональных блока: (1) ковалентная боеголовка направленного действия (реактивная группа); (2) репортерная метка, такая как биотин или родамин ; и (3) линкерную группу. [8] Ковалентная боеголовка направленного действия, также называемая ковалентным модификатором, представляет собой электрофил , который ковалентно модифицирует серина , цистеина или лизина остаток в активном центре фермента и предотвращает будущие взаимодействия с другими лигандами. [7] Зонды ABPP обычно разрабатываются против ферментных классов и, таким образом, могут предоставлять информацию на системном уровне о влиянии состояния клеток на ферментативные сети. Репортерная метка используется для подтверждения маркировки фермента реактивной группой и может варьироваться в зависимости от последующих показаний. Наиболее широко используемыми репортерами являются флуоресцентные фрагменты , которые позволяют визуализировать, и аффинные метки , такие как биотин, которые позволяют извлекать меченые ферменты и проводить анализ с помощью масс-спектрометрии . У каждой стратегии есть недостатки, а именно то, что флуоресцентные репортеры не позволяют осуществлять обогащение для протеомного анализа, в то время как аффинные метки на основе биотина очищаются совместно с эндогенно биотинилированными белками. [8] Линкерная группа используется для соединения реактивной группы с репортером, в идеале таким образом, чтобы не изменять активность зонда. Наиболее распространенными линкерными группами являются длинные алкильные цепи , производные ПЭГ и модифицированные полипептиды . [5]
состояния системы Если предположить, что ферменты различаются по своей структуре, функциям и связям в зависимости от физиологического или состояния развития, можно сделать вывод, что доступность активного центра фермента также будет различаться. [6] Следовательно, способность зонда ABPP метить фермент также будет варьироваться в зависимости от условий. Таким образом, связывание зонда может раскрыть информацию о функциональных характеристиках фермента в различных контекстах. Высокопроизводительный скрининг выиграл от ABPP, особенно в области анализов конкурентного ингибирования , в которых биологические образцы предварительно инкубируются с кандидатами на лекарственные средства, а затем заставляют конкурировать с зондами ABPP за связывание с целевыми ферментами. Соединения с высоким сродством к своим мишеням предотвращают связывание зонда, а степень связывания зонда можно использовать как показатель сродства соединения. Поскольку зонды ABPP маркируют классы ферментов, этот подход также можно использовать для определения селективности лекарств, поскольку высокоселективные соединения в идеале будут превосходить зонды только по небольшому количеству белков. [8]
Фотоаффинная маркировка
[ редактировать ]В отличие от ABPP, который приводит к мечению белка при связывании зонда, зонды для фотоаффинного мечения требуют активации путем фотолиза , прежде чем произойдет ковалентное связывание с белком. [7] Наличие фотореактивной группы делает это возможным. [7] Эти зонды состоят из трех связанных фрагментов : (1) каркаса лекарственного средства; (2) фотореактивная группа , такая как фенилазид , фенилдиазирин или бензофенон ; и (3) идентификационную метку, например биотин, флуоресцентный краситель или химическую ручку. [9] Каркас лекарства обычно представляет собой аналог лекарства, механизм которого изучается, и, что важно, обратимо связывается с мишенью , что лучше имитирует взаимодействие между большинством лекарств и их мишенями. [9] Существует несколько разновидностей фотореактивных групп, но они фундаментально отличаются от зондов ABPP: хотя ABPP специфически метит нуклеофильные аминокислоты в активном сайте мишени, фотоаффинное мечение неспецифично и, таким образом, применимо для мечения более широкого круга мишеней. [7] Идентификационная метка будет варьироваться в зависимости от типа проводимого анализа: биотиновые и химические ручки подходят для обогащения меченых белков перед идентификацией на основе масс-спектрометрии , а флуоресцентные красители используются при использовании метода визуализации на основе геля , такого как SDS. -PAGE для проверки взаимодействия с целью. [7] [9]
Поскольку фотоаффинные зонды многофункциональны, их сложно сконструировать. Химики включают в фотоаффинные зонды те же принципы моделирования отношений структура-активность , которые применяются к лекарствам, но должны делать это без ущерба для активности каркаса лекарства или способности фотореактивной группы связываться. [9] Поскольку фотореактивные группы связываются без разбора, неправильный дизайн может привести к тому, что зонд пометит себя или нецелевые белки. Зонд должен оставаться стабильным при хранении, в буферах , при различных уровнях pH и в живых системах, чтобы гарантировать, что маркировка происходит только при воздействии света. Активацию светом также необходимо точно настроить, поскольку излучение может повредить клетки. [9]
Подходы, основанные на иммобилизации
[ редактировать ]
Хемопротеомные методы, основанные на иммобилизации, включают в себя варианты аффинного понижения уровня на основе микрогранул , которое аналогично иммунопреципитации , и аффинной хроматографии . В обоих случаях в качестве поверхности иммобилизации, несущей молекулу приманки, используется твердая подложка. Молекула-приманка может быть потенциальным лекарством, если исследователь пытается идентифицировать цели, или мишенью, такой как иммобилизованный фермент , если исследователь проводит скрининг на малые молекулы. [10] Приманка подвергается воздействию смеси потенциальных связывающих партнеров, которые можно идентифицировать после удаления не связывающих компонентов.
Иммобилизация на основе микрошариков
[ редактировать ]Иммобилизация на основе микрогранул представляет собой модульную технику, позволяющую исследователю решать, хотят ли они искать белковые мишени из протеома или лекарствоподобные соединения из химических библиотек . Макроскопические . свойства микрошариков делают их пригодными для относительно небольших трудоемких применений, поскольку их легко визуализировать, а их объемная масса представляет собой легко удаляемые белковые растворы [11] Микрогранулы исторически изготавливались из инертных полимеров , таких как агароза и декстран , которые способны прикреплять выбранную приманку. В случае использования белков в качестве приманки аминные функциональные группы являются обычными линкерами, облегчающими прикрепление. Более современные подходы выиграли от популяризации dynabeads , типа магнитных микрошариков , которые позволяют магнитно отделять иммобилизованные шариками аналиты от обработанных образцов. Магнитные шарики обладают суперпарамагнитными свойствами, благодаря чему их очень легко извлечь из раствора с помощью внешнего магнита . [12] В упрощенном рабочем процессе магнитные шарики используются для иммобилизации белка- мишени, затем шарики смешиваются с химической библиотекой для выявления потенциальных лигандов . Лиганды с высоким сродством связываются с иммобилизованной мишенью и сопротивляются удалению при промывании, поэтому они обогащаются в образце. И наоборот, лиганд интересующий может быть иммобилизован и подвергнут скринингу против протеомных белков путем инкубации с лизатом . [12]
Были применены гибридные стратегии, основанные на растворе и иммобилизации, в которых лигандам, функционализированным обогащающей меткой, такой как биотин, позволяют свободно плавать в растворе и находить свои целевые белки. После инкубационного периода комплексы лиганд-белок могут взаимодействовать с шариками, покрытыми стрептавидином , которые связывают биотиновую метку и позволяют извлечь и идентифицировать партнеров по взаимодействию. Эта технология может быть расширена для помощи в подготовке образцов для ABPP и фотоаффинной маркировки . Несмотря на то, что подходы к иммобилизации были воспроизводимыми и успешными, невозможно избежать ограничения стерических затруднений , вызванных иммобилизацией , которые мешают индуцированному прилеганию . Еще одним недостатком является неспецифическая адсорбция как белков, так и малых молекул на поверхности гранул, что может привести к ложноположительным результатам. [10]
Аффинная хроматография
[ редактировать ]Аффинная хроматография возникла в 1950-х годах как редко используемый метод очистки ферментов; с тех пор он получил широкое распространение и является старейшим среди химиопротеомных подходов. [13] Аффинная хроматография выполняется в одном из двух основных форматов: иммобилизация лиганда или иммобилизация мишени. В формате иммобилизации лиганда интересующий лиганд - часто лекарственный препарат - иммобилизуется внутри хроматографической колонки и действует как неподвижная фаза . Сложный образец, состоящий из множества белков, таких как клеточный лизат , пропускают через колонку, и интересующая мишень связывается с иммобилизованным лигандом, в то время как другие компоненты образца проходят через колонку не удерживаясь. В формате целевой иммобилизации интересующая мишень - часто белок, имеющий отношение к заболеванию - иммобилизуется внутри хроматографической колонки и действует как стационарная фаза . Объединенные библиотеки соединений затем пропускают через колонку в прикладном буфере , лиганды сохраняются за счет связывания с неподвижной фазой , а другие соединения проходят через колонку не удерживаемыми. [14] В обоих случаях оставшиеся аналиты можно элюировать из колонки и идентифицировать с помощью масс-спектрометрии. Таблица стратегий элюирования представлена ниже.
| Стратегия | Описание | Механизм(ы) | Преимущества | Недостатки |
|---|---|---|---|---|
| Неспецифическое элюирование | Связанные лиганды высвобождаются после того, как изменение состава подвижной фазы смещает местное химическое окружение неподвижной фазы; конформация белка изменяется, вызывая высвобождение лигандов; в качестве альтернативы полярность растворителя уменьшается, в результате чего связанные лиганды преимущественно распределяются в подвижной фазе . | рН ; ионная сила ; полярность . | Можно точно настроить элюировать определенные белки или лиганды. | Условия элюирования могут быть недостаточно сильными для элюирования неоптимизированных соединений. |
| Изократическое элюирование | Буфер для элюирования идентичен буферу для нанесения, лиганды легко перемещаются по колонке, но с разной скоростью в зависимости от их основного сродства к мишени. | Переходные взаимодействия со стационарной фазой . | Позволяет сравнивать сходство соединений. | Может занять много времени; требует непрерывного сбора фракций . |
| Биоспецифическое элюирование | Аналиты элюируются путем добавления высокой концентрации партнера по связыванию с высоким сродством к подвижной фазе, связанные аналиты отделяются от стационарной фазы; добавкой может быть либо белок, который удаляет связанные лиганды, либо небольшая молекула, которая их замещает. | Конкурсная вязка . | Позволяет концентрировать аналиты с немедленным элюированием ; высокое восстановление. | Соединения, ранее не тестированные, могут иметь более высокое сродство, чем элюирующая добавка. |
Подходы без дериватизации
[ редактировать ]
Хотя описанные выше подходы показали успех, они по своей сути ограничены необходимостью дериватизации , что ставит под угрозу близость взаимодействия, которое, дериватизированные как говорят, имитируют соединения, и создает стерические препятствия . [10] Иммобилизованные лиганды и мишени ограничены в своей способности свободно перемещаться в пространстве таким образом, который воспроизводит нативное взаимодействие белок-лиганд, а конформационные изменения по сравнению с индуцированным соответствием часто ограничиваются, когда белки или лекарства иммобилизованы. Подходы, основанные на зондах, также изменяют трехмерную природу взаимодействия лиганд-белок путем введения функциональных групп в лиганд , что может изменить активность соединения. Подходы, не требующие дериватизации, направлены на выявление взаимодействий косвенно, часто путем наблюдения за изменениями стабильности белка при связывании, а иногда и посредством хроматографического совместного элюирования . [15]
Считается, что описанные ниже методы, основанные на стабильности, работают благодаря лиганд белка -индуцированным сдвигам в равновесных концентрациях конформационных состояний . Один тип белка в растворе может быть представлен отдельными молекулами в различных конформациях , многие из которых отличаются друг от друга, несмотря на идентичность аминокислотной последовательности. При связывании лекарственного средства большая часть белка, связанного с лигандом, переходит в энергетически выгодную конформацию и уходит от непредсказуемого распределения менее стабильных конформеров. [16] Таким образом, считается, что связывание лиганда стабилизирует белки, делая их устойчивыми к термической , ферментативной и химической деградации. Ниже приведены некоторые примеры подходов, основанных на стабильности и не требующих дериватизации.
Термическое профилирование протеома (TPP)
[ редактировать ]Термическое профилирование протеома (также «Анализ температурного сдвига клеток ») — это недавно популяризированная стратегия, позволяющая сделать вывод о взаимодействиях лиганд - белок на основе изменений термической стабильности белка, вызванных связыванием лиганда. В типичной установке анализа образцы, содержащие белок, подвергаются воздействию выбранного лиганда, затем эти образцы отбираются на аликвоты и нагреваются до отдельных температурных точек. белка Ожидается, что при связывании с лигандом термическая стабильность увеличится, поэтому белки, связанные с лигандом, будут более устойчивы к термической денатурации. После нагревания количество оставшегося неденатурированного белка анализируют с помощью количественной протеомики и строят кривые стабильности. Ожидается, что при сравнении с необработанной кривой стабильности обработанная кривая сместится вправо, что указывает на то, что произошла стабилизация, индуцированная лигандом. Исторически сложилось так, что термическое профилирование протеома оценивалось с использованием вестерн-блоттинга против известной интересующей цели. С появлением масс-спектрометров Orbitrap высокого разрешения. , этот тип эксперимента может быть выполнен в масштабе всего протеома , и кривые стабильности могут быть созданы для тысяч белков одновременно. Термическое профилирование протеома было успешно выполнено in vitro , situ и in in vivo . В сочетании с масс-спектрометрией этот метод называется масс-спектрометрическим анализом температурного сдвига клеток (MS- CETSA ). [17]
Целевая стабильность, реагирующая на сродство к лекарственному средству (DARTS)
[ редактировать ]целевой стабильности, реагирующий на сродство к лекарственному средству, Анализ основан на том же базовом предположении, что и TPP: стабильность белка увеличивается за счет связывания лиганда. Однако в DARTS стабильность белка оценивается в ответ на расщепление протеазой . Вкратце, образец клеточного лизата инкубируют с интересующей небольшой молекулой, образец разделяют на аликвоты, и каждая аликвота подвергается ограниченному протеолизу после добавления протеазы . Ограниченный протеолиз имеет решающее значение, поскольку полный протеолиз приведет к лигандом даже связанного с белка полному перевариванию . Затем образцы анализируются с помощью SDS-PAGE для оценки различий в степени переваривания, затем полосы вырезаются и анализируются с помощью масс-спектрометрии для подтверждения идентичности белков, устойчивых к протеолизу . В качестве альтернативы, если мишень уже подозревается и проходит проверку на предмет проверки, вестерн-блоттинга можно использовать протокол для непосредственной идентификации белка . [18]
Стабильность белков от скорости окисления (SPROX)
[ редактировать ]Стабильность белков по скорости окисления также основана на предположении, что связывание лигандов обеспечивает защиту белков от деградации, на этот раз от окисления метионина остатков . В SPROX лизат разделяется и обрабатывается лекарственным средством или контролем ДМСО, затем каждая группа далее разделяется на отдельные образцы с возрастающими концентрациями хаотропа и денатурирующего гидрохлорида гуанидиния (GuHCl). В зависимости от концентрации GuHCl белки будут разворачиваться в разной степени. Затем каждый образец подвергается реакции с перекисью водорода , которая окисляет остатки метионина . Белки, стабилизированные препаратом, останутся свернутыми при более высоких концентрациях GuHCl и будут подвергаться меньшему окислению метионина. Окисленные остатки метионина можно определить количественно с помощью ЖХ-МС/МС и использовать для создания кривых стабильности метионина, которые являются показателем связывания лекарственного средства. У анализа SPROX есть недостатки, а именно то, что единственными значимыми пептидами из образцов SPROX являются пептиды с остатками метионина, которые составляют примерно одну треть пептиды , для которых в настоящее время не существует эффективных методов обогащения. Только те метионины , которые подвергаются окислению, предоставляют значимую информацию, и не все различия в окислении метионина согласуются со стабилизацией белка. Без обогащения методом ЖХ-МС/МС анализ этих пептидов затруднителен, поскольку вклад других компонентов образца в шум масс-спектрометра может заглушить соответствующий сигнал. Поэтому образцы SPROX требуют фракционирования для концентрации представляющих интерес пептидов перед анализом ЖХ-МС/МС . [16]
Масс-спектрометрия с аффинной селекцией
[ редактировать ]Хотя внедрение масс-спектрометрии с аффинной селекцией (AS-MS) привело к расширению форматов анализа, [19] Общая техника следует простой схеме. Белковые мишени инкубируют с небольшими молекулами , чтобы обеспечить образование стабильных лиганд - белковых комплексов, несвязанные малые молекулы удаляют из смеси, а компоненты оставшихся лиганд - белковых комплексов анализируют с помощью масс-спектрометрии . [19] Идентифицированные связанные лиганды затем классифицируются как совпадения и могут быть использованы в качестве отправной точки для генерации лидов . Поскольку AS-MS измеряет связывание беспристрастно, попадание не обязательно должно быть привязано к функциональным показаниям, что открывает возможность идентификации лекарств , которые действуют за пределами активных центров, таких как аллостерические модуляторы и химические шапероны , и все это в одном анализе. [20] Поскольку малые молекулы можно напрямую идентифицировать по их точной массе , никакой дериватизации . для подтверждения достоверности результата не требуется [20] Среди подходов, не требующих дериватизации и меток, AS-MS имеет уникальное преимущество, заключающееся в том, что он позволяет оценивать несколько тестируемых соединений о 20 000 соединений за эксперимент - в литературе сообщается за эксперимент, а одна группа сообщила об анализе химических веществ. библиотеки против гетерогенных пулов белков . [20] Основные этапы AS-MS описаны более подробно ниже.
Выбор по родству
[ редактировать ]Обобщенный рабочий процесс AS-MS начинается с предварительной инкубации очищенных белков растворов (т.е. целевых белков ) с химическими библиотеками в микропланшетах . Анализы могут быть разработаны так, чтобы содержать достаточно высокие концентрации белка , чтобы предотвратить конкуренцию за сайты связывания между структурными аналогами , гарантируя, что совпадения по диапазону сродства могут быть идентифицированы; И наоборот, анализы могут содержать низкие концентрации белка , чтобы можно было различать аналоги с высоким и низким сродством и определять взаимосвязи структура-активность . [20] Выбор химической библиотеки менее строгий, чем другие стратегии высокопроизводительного скрининга , из-за отсутствия функциональных показателей, которые в противном случае потребовали бы деконволюции исходного соединения, генерирующего биологическую активность . Таким образом, типичный диапазон для AS-MS составляет 400–3000 соединений на пул. [20] Другие соображения по скринингу более практичны, например, необходимость сбалансировать желаемую концентрацию соединения, которая обычно находится в микромолярном диапазоне, с тем фактом, что исходные растворы соединений обычно хранятся в виде 10- миллимолярных растворов , что эффективно ограничивает количество проверяемых соединений в тысячи. [20] После того как соответствующие тестируемые соединения и мишени выбраны и инкубированы, комплексы лиганд - белок можно разделить различными способами. [19]
Разделение несвязанных малых молекул и лиганд-белковых комплексов
[ редактировать ]За аффинным отбором следует удаление несвязанных малых молекул с помощью ультрафильтрации или эксклюзионной хроматографии , что делает доступными для последующего анализа только белками связанные с лиганды . [19] нескольких типах ультрафильтрации Сообщалось о с различной степенью производительности давлением, центробежную и осаждающую , включая ультрафильтрацию под ультрафильтрацию . [19] Как при использовании давления, так и при центрифугировании несвязанные малые молекулы проталкиваются через полупроницаемую мембрану , которая не пропускает белки в зависимости от их размера. требуется несколько этапов промывки После ультрафильтрации , чтобы обеспечить полное удаление несвязанных малых молекул . [19] Ультрафильтрация также может быть затруднена неспецифической адсорбцией несвязанных малых молекул на мембране . [19] Группа из Университета Иллинойса опубликовала стратегию скрининга бета-амилоида , в которой лиганды использовались для стабилизации белка и предотвращения его агрегации. Ультрафильтрацию использовали для осаждения агрегированного бета-амилоида и удаления несвязанных лигандов , в то время как белок, стабилизированный лигандом, обнаруживали и количественно определяли с помощью масс-спектрометрии . [19]
Эксклюзионная хроматография (SEC) более широко используется при разработке промышленных лекарств и имеет преимущество более эффективного удаления несвязанных соединений по сравнению с ультрафильтрацией . [19] Подходы исключения размера были описаны как в высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), так и в формате спин-колонок. формате [19] В любом случае смесь несвязанных лигандов , белков , лиганд-белковых комплексов пропускают через колонку пористых шариков. Лиганд - белковые комплексы исключаются из попадания в шарики и быстро покидают колонку, тогда как несвязанные лиганды должны проходить через шарики и удерживаться на колонке более длительное время. Таким образом, предполагается, что лиганды , которые элюируются из колонки на ранних стадиях, связаны с белком . [19] Автоматизированная система идентификации лигандов (ALIS), разработанная Schering-Plough , использует комбинированную ВЭЖХ и основе систему SEC на жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС), которая отделяет лиганд - белок комплексы от несвязанных лигандов с помощью SEC и направляет комплекс в сторону система ЖХ -МС для онлайн-анализа связанных лигандов. [19] Novartis ' SpeedScreen использует SEC в формате 96-луночной спин-колонки, также известный как гель-фильтрационная хроматография , которая позволяет одновременно удалять несвязанные лиганды из 96 образцов. [21] Образцы также пропускают через пористые шарики, но центрифугирование . для перемещения образца через колонку используется [21] SpeedScreen не подключен к системе ЖХ-МС и требует дальнейшей обработки перед окончательным анализом. В этом случае лиганды необходимо освободить от мишеней и проанализировать отдельно.
Анализ связанных лигандов
[ редактировать ]Последний этап требует биоаналитического отделения связанных лигандов от их мишеней и последующей идентификации лигандов с помощью жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии . [20] AS-MS предлагает средства для идентификации взаимодействий малых молекул с белком либо напрямую - посредством протеомного обнаружения сверху вниз интактных комплексов - либо косвенно - посредством денатурации комплексов малых молекул с белком с последующей идентификацией малых молекул с использованием масс-спектрометрии . [19] Подход «сверху вниз» требует прямого введения комплекса в с ионизацией электрораспылением источник масс-спектрометрии в условиях, достаточно мягких, чтобы сохранить взаимодействие и сохранить его целостность при переходе из жидкости в газ . [19] Хотя Ганем и Хенион показали, что это возможно в 1991 году, это не подходит для высокой пропускной способности . [19] Интересно, что диссоциация с электронным захватом , которая обычно используется при структуры выяснении пептидов , использовалась для идентификации сайтов связывания лигандов во время нисходящего анализа. [19] Более простой метод анализа связанных лигандов использует экстракцию преципитатов белков для денатурации белков и высвобождения лигандов в раствор осаждения, который затем можно разбавить и идентифицировать с помощью системы ЖХ-МС .
Идентификация мишени методом хроматографического совместного элюирования (TICC)
[ редактировать ]Идентификация мишени путем хроматографического совместного элюирования не зависит от различий в стабильности белка после лечения лекарственным средством. Вместо этого он основан на предположении, что лекарства образуют стабильные комплексы с белками- мишенями и что эти комплексы достаточно прочны, чтобы выдержать хроматографическое разделение . В типичном рабочем процессе клеточный лизат инкубируют с лекарственным средством, затем лизат вводят в систему ионообменной хроматографии и фракционируют . Белки лизата элюируются по градиенту ионной силы , и фракции собираются за короткие интервалы времени. Каждую фракцию анализируют методом ЖХ-МС/МС на содержание белка и лекарственного средства . Отдельные белки элюируются с характерными профилями, а предварительно инкубированные лекарства должны отражать профили элюирования мишеней, с которыми они образуют комплексы. Корреляция профилей элюирования лекарственного средства и белка позволяет сузить и определить цели. [22]
Вычислительные подходы
[ редактировать ]Моделирование молекулярной стыковки
[ редактировать ]Разработка и применение лабораторных химиопротеомных анализов часто требует много времени и непомерных затрат. Моделирование молекулярного стыковки стало относительно дешевым и высокопроизводительным средством ранжирования силы взаимодействий малых молекул с белками. Молекулярный докинг требует точного моделирования конформации как лиганда, так и белка с атомным разрешением, и поэтому ему помогает эмпирическое определение структуры белка, часто с помощью ортогональных методов, таких как рентгеновская кристаллография и криогенная электронная микроскопия . Стратегии молекулярного стыковки классифицируются по типу информации, которая уже известна об интересующем лиганде и белке. [23]
Лигандные методы
[ редактировать ]
Когда биоактивный лиганд с известной структурой необходимо проверить на белок с ограниченной структурной информацией, моделирование проводится с учетом структуры лиганда. Моделирование фармакофоров идентифицирует ключевые электронные и структурные особенности, которые связаны с терапевтической активностью аналогичных по биоактивности структурных аналогов , и, соответственно, требует больших библиотек с соответствующими экспериментальными данными для повышения прогностической способности. Сложные структуры виртуально накладываются друг на друга, а общие элементы оцениваются на основе их склонности к биологической активности. [24] Переход от моделирования на основе замка и ключа к моделированию на основе индуцированной подгонки улучшил прогнозы связывания, но также привел к возникновению проблемы моделирования гибкости лигандов, что требует создания базы данных конформационных моделей и использует большие объемы пространства для хранения данных. . Другой подход - это так называемый метод «на лету», при котором конформационные модели проверяются в процессе моделирования фармакофора без базы данных; этот метод требует значительно меньше места для хранения за счет большого времени вычислений. [24] Вторая проблема возникает при решении вопроса о том, как накладывать аналоговые структуры. Распространенным подходом является использование регрессии наименьших квадратов для наложения, но это требует выбираемых пользователем опорных точек и, следовательно, вносит в процесс человеческую предвзятость. Модели фармакофоров требуют наборов обучающих данных, что порождает еще одну проблему — выбор соответствующей библиотеки соединений для адекватного обучения моделей. Размер набора данных и химическое разнообразие существенно влияют на производительность конечного продукта. [25]
Структурные методы
[ редактировать ]В идеале структура мишени лекарственного средства известна, что позволяет моделировать фармакофоры на основе структуры . Модель, основанная на структуре, объединяет ключевые структурные свойства сайта связывания белка, такие как пространственное распределение точек взаимодействия, с особенностями, выявленными на основе фармакофорных моделей на основе лигандов, для создания целостного моделирования взаимодействия лиганд-белок. Основная проблема структурного моделирования состоит в том, чтобы сузить характеристики фармакофора, многие из которых изначально идентифицированы, до набора высокоприоритетных функций, поскольку моделирование слишком большого количества функций представляет собой вычислительную проблему. Еще одной проблемой является несовместимость моделирования фармакофоров с количественным профилированием зависимости структура-активность (QSAR) . Точные модели QSAR основаны на включении многих потенциальных целей, а не только терапевтической цели. Например, важные фармакофоры могут обеспечивать высокоаффинное взаимодействие с терапевтическими мишенями, но они также могут приводить к нежелательной нецелевой активности. и они также могут быть субстратами метаболических ферментов, таких как цитохром P450 . Таким образом, фармакофорное соединения моделирование терапевтических целей является лишь одним из компонентов общей взаимосвязи структура-активность . [24]
Приложения
[ редактировать ]Наркозависимость
[ редактировать ]
Хемопротеомные стратегии использовались для расширения круга целей , поддающихся лечению . [26] Хотя исторически успешные лекарства нацелены на четко определенные участки связывания белков, пригодных для приема лекарств, они определяют только около 15% аннотированного протеома . [26] Чтобы продолжать расширять нашу фармакопею , необходимы смелые подходы к открытию лигандов. Использование ABPP случайно активизировало поиск новых сайтов, пригодных для лигирования. Было обнаружено, что зонды ABPP, намеренно используемые для маркировки активных участков ферментов, непреднамеренно метят многие нуклеофильные области многих различных белков. Первоначально считавшиеся экспериментальным шумом, эти непреднамеренные реакции подсказали исследователям о наличии участков, которые потенциально могут быть нацелены на новые ковалентные лекарства . Это особенно заметно в случае белков, не обладающих ферментативной активностью, которую можно было бы ингибировать, или белков с мутированной лекарственной устойчивостью. В любом из этих случаев белки потенциально могут быть направлены на деградацию с использованием новой лекарственной модальности химер, нацеленных на протеолиз (PROTAC) . [26] PROTAC представляют собой гетеробифункциональные небольшие молекулы, которые предназначены для взаимодействия с мишенью и убиквитинлигазой E3 . В результате взаимодействия убиквитинлигаза E3 приближается к мишени настолько, что мишень становится меткой для деградации. Существование потенциальных сайтов ковалентного связывания в протеоме предполагает, что многие лекарства могут быть ковалентно направлены с использованием такого метода. [26]
Перепрофилирование лекарств
[ редактировать ]Хемопротеомика находится на переднем крае перепрофилирования лекарств . Это особенно актуально в эпоху COVID-19 , когда возникла острая необходимость быстро идентифицировать FDA одобренные лекарства, обладающие противовирусной активностью. [27] В этом контексте обычно используется фенотипический скрининг для идентификации препаратов с желаемым эффектом in vitro , например, ингибированием образования вирусных бляшек . Если препарат дает положительный результат теста, следующим шагом будет определение того, действует ли он на известную или новую мишень. Таким образом, химиопротеомика является продолжением фенотипического скрининга. В случае с COVID-19 Фриман и др. исследовали нецелевые эффекты противовирусного препарата широкого спектра действия Ремдесивир , который был одним из первых перепрофилированных препаратов, которые использовались во время пандемии . [27] Ремдесивир был протестирован посредством термического протеомного профилирования в HepG2 анализе теплового сдвига клеток вместе со спорным препаратом гидроксихлорохином , и исследователи обнаружили, что TRIP13 является потенциально нецелевым для Ремдесивира. [27]
Высокопроизводительный скрининг
[ редактировать ]Утвержденные препараты никогда не идентифицируются как хиты в ходе высокопроизводительного скрининга , поскольку химические библиотеки, используемые при скрининге, не оптимизированы по каким-либо целям. Однако такие методы, как аффинная хроматография и масс-спектрометрия с аффинной селекцией, являются «рабочими лошадками» фармацевтической промышленности , и, в частности, было документально подтверждено, что AS-MS дает значительное количество совпадений во многих классах белков , трудно поддающихся лекарственному лечению . [20] Во многом это связано с огромным объемом лигандов , которые можно проверить в одном анализе. Исследователи из Института iHuman при Шанхайском технологическом университете использовали схему, в которой 20 000 соединений на пул проверялись на A 2AR , сложный рецептор, связанный с G-белком , с лекарством, с коэффициентом попадания 0,12%, что привело к получению нескольких лигандов с высоким сродством. [20]
| Техника | Биоактивный лиганд | Цель | Описание | Ссылка |
|---|---|---|---|---|
| Профилирование белков на основе активности | ABX1431 | ЛОВУШКА | Cesar и др. оптимизировали ингибитор MAGL ABX1431, используя систему конкурентного ингибирования. | [28] |
| Фотоаффинная маркировка | хлорохин | ПфКРТ | Лекостай и др. идентифицировали сайт связывания хлорохина на Plasmodium переносчике устойчивости к хлорохину с помощью фотоаффинной маркировки. | [7] |
| Аффинная хроматография | Пурванолол | CDK , СК1 | Knockaert и др. подтвердили наличие CDK и обнаружили CK1 как мишень пурванолола; CK1 представляет собой белок Plasmodium, а аналоги пурванолола обладают активностью против Plasmodium. | [29] |
| Термическое профилирование протеома ( CETSA ) | Ремдесивир | ТРИП13 | Фриман и др. определили TRIP13 как нецелевой препарат Ремдесивира после исследования нецелевых эффектов перепрофилированных препаратов от COVID-19. | [27] |
| Целевая стабильность, реагирующая на сродство к лекарственному средству | Ресвератрол | EIF4A | Ломеник и др. обнаружили EIF4A как мишень для небольшой молекулы ресвератрола , связанной с долголетием . | [18] |
| Стабильность белков от скорости окисления | Манассанти А | ЭЭФ1А1 | Гир Уоллес и др. обнаружили EEF1A1 как мишень мощного противоопухолевого природного продукта манассантина А. | [15] |
| Масс-спектрометрия с аффинной селекцией | Скрининговые соединения | ЖАЛО | Компания Merck & Co. использовала AS-MS для успешного скрининга лигандов против трудно поддающегося лекарственному воздействию белка STING , который имеет большой сайт связывания и сильный конкурирующий эндогенный лиганд. | [20] |
| Идентификация мишени методом хроматографического совместного элюирования | 4513-0042 | ЭРГ6П | Чен и др. определили дрожжевой белок ERG6P как мишень противогрибкового природного продукта 4513-0042 и провели проверочные эксперименты. | [22] |
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Ван, Лэй (21 августа 2020 г.). «Химические инструменты и подходы на основе масс-спектрометрии для изучения реакционной способности и селективности малых молекул в сложных протеомах» . Докторские диссертации .
- ^ Jump up to: а б Конвей Л.П., Ли В., Паркер К.Г. (март 2021 г.). «Хемопротеомный фенотипический скрининг» . Клеточная химическая биология . 28 (3): 371–393. doi : 10.1016/j.chembiol.2021.01.012 . ПМИД 33577749 . S2CID 231910437 .
- ^ Jump up to: а б с д и Мёллеринг Р.Э., Краватт Б.Ф. (январь 2012 г.). «Как хемопротеомика может способствовать открытию и разработке лекарств» . Химия и биология . 19 (1): 11–22. doi : 10.1016/j.chembiol.2012.01.001 . ПМК 3312051 . ПМИД 22284350 .
- ^ Дауден Х., Манро Дж. (июль 2019 г.). «Тенденции в области клинических успехов и терапевтической направленности». Обзоры природы. Открытие наркотиков . 18 (7): 495–496. дои : 10.1038/d41573-019-00074-z . ПМИД 31267067 . S2CID 164564888 .
- ^ Jump up to: а б с д и Яо, Сюдун, изд. (2021). Достижения в области химической протеомики (1-е изд.). Эльзевир . дои : 10.1016/C2019-0-03583-2 . ISBN 978-0-12-821433-6 . S2CID 243825970 .
- ^ Jump up to: а б Номура Д.К., Дикс М.М., Краватт Б.Ф. (сентябрь 2010 г.). «Профилирование белков на основе активности для открытия биохимических путей рака» . Обзоры природы. Рак . 10 (9): 630–638. дои : 10.1038/nrc2901 . ПМК 3021511 . ПМИД 20703252 .
- ^ Jump up to: а б с д и ж г Геогеган К.Ф., Джонсон Д.С. (2010). «Химико-протеомные технологии идентификации мишеней лекарственных средств». Годовые отчеты по медицинской химии . 45 . Эльзевир: 345–360. дои : 10.1016/s0065-7743(10)45021-6 . ISBN 9780123809025 .
- ^ Jump up to: а б с Ван С., Тянь Ю, Ван М., Ван М., Сунь ГБ, Сан XB (09 апреля 2018 г.). «Продвинутые стратегии применения профилирования белков на основе активности для разработки лекарств» . Границы в фармакологии . 9 : 353. дои : 10.3389/fphar.2018.00353 . ПМК 5900428 . ПМИД 29686618 .
- ^ Jump up to: а б с д и Смит Э., Коллинз I (февраль 2015 г.). «Фотоаффинная маркировка при идентификации мишени и сайта связывания» . Будущая медицинская химия . 7 (2): 159–183. дои : 10.4155/fmc.14.152 . ПМЦ 4413435 . ПМИД 25686004 .
- ^ Jump up to: а б с Чен X, Ван Ю, Ма Н, Тянь Дж, Шао Ю, Чжу Б и др. (май 2020 г.). «Целевая идентификация натуральных лекарств с использованием подхода химической протеомики: синтез зондов, целевая ловля и идентификация белков» . Сигнальная трансдукция и таргетная терапия . 5 (1): 72. doi : 10.1038/s41392-020-0186-y . ПМЦ 7239890 . ПМИД 32435053 .
- ^ Хоу X, Сунь М, Бао Т, Се X, Вэй Ф, Ван С (октябрь 2020 г.). «Последние достижения в области скрининга активных компонентов натуральных продуктов на основе методов биоаффинности» . Акта Фармацевтика Синика Б. 10 (10): 1800–1813. дои : 10.1016/j.apsb.2020.04.016 . ПМК 7606101 . ПМИД 33163336 .
- ^ Jump up to: а б Чжуо Р., Лю Х, Лю Н, Ван Ю (ноябрь 2016 г.). «Ловля лигандов: замечательная стратегия обнаружения биоактивных соединений из сложной смеси натуральных продуктов» . Молекулы . 21 (11): 1516. doi : 10,3390/molecules21111516 . ПМК 6274472 . ПМИД 27845727 .
- ^ Турков Ю. (1978). Аффинная хроматография . Эльзевир. ISBN 978-0-08-085812-8 . OCLC 476215351 .
- ^ Jump up to: а б Родригес Э.Л., Поддар С., Ифтехар С., Сух К., Вулфорк А.Г., Овбуде С. и др. (ноябрь 2020 г.). «Аффинная хроматография: обзор тенденций и событий за последние 50 лет» . Журнал хроматографии. Б. Аналитические технологии в биомедицине и науках о жизни . 1157 : 122332. doi : 10.1016/j.jchromb.2020.122332 . ПМЦ 7584770 . ПМИД 32871378 .
- ^ Jump up to: а б Ха Дж, Пак Х, Пак Дж, Пак СБ (март 2021 г.). «Последние достижения в определении белков-мишеней при открытии лекарств» . Клеточная химическая биология . 28 (3): 394–423. doi : 10.1016/j.chembiol.2020.12.001 . ПМИД 33357463 . S2CID 229693161 .
- ^ Jump up to: а б Ломеник Б., Олсен Р.В., Хуан Дж. (январь 2011 г.). «Идентификация прямых белковых мишеней малых молекул» . АКС Химическая биология . 6 (1): 34–46. дои : 10.1021/cb100294v . ПМК 3031183 . ПМИД 21077692 .
- ^ Матеус А., Курзава Н., Бехер И., Шридхаран С., Хелм Д., Штейн Ф. и др. (март 2020 г.). «Термическое профилирование протеома для изучения белковых взаимодействий» . Молекулярная системная биология . 16 (3): e9232. дои : 10.15252/msb.20199232 . ПМК 7057112 . ПМИД 32133759 .
- ^ Jump up to: а б Ломеник Б., Хао Р., Джонай Н., Чин Р.М., Агаджан М., Уорбертон С. и др. (декабрь 2009 г.). «Идентификация цели с использованием целевой стабильности, реагирующей на сродство лекарственного средства (DARTS)» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 106 (51): 21984–21989. Бибкод : 2009PNAS..10621984L . дои : 10.1073/pnas.0910040106 . ПМЦ 2789755 . ПМИД 19995983 .
- ^ Jump up to: а б с д и ж г час я дж к л м н тот п Аннис Д.А., Никбарг Э., Ян X, Зибелл М.Р., Уайтхерст CE (октябрь 2007 г.). «Методы масс-спектрометрического скрининга с аффинной селекцией для открытия низкомолекулярных лекарств». Современное мнение в области химической биологии . 11 (5): 518–526. дои : 10.1016/j.cbpa.2007.07.011 . ПМИД 17931956 .
- ^ Jump up to: а б с д и ж г час я дж Прудент Р., Аннис Д.А., Дандликер П.Дж., Ортоланд Дж.Й., Рош Д. (21 октября 2020 г.). «Исследование новых целей и химического пространства с помощью масс-спектрометрии с аффинной селекцией». Обзоры природы Химия . 5 (1): 62–71. дои : 10.1038/s41570-020-00229-2 . ПМИД 37118102 . S2CID 224811862 .
- ^ Jump up to: а б Зехендер Х., Ле Гофф Ф., Леманн Н., Филипуцци И., Майр Л.М. (сентябрь 2004 г.). «SpeedScreen: «недостающее звено» между геномикой и открытием свинца» . Журнал биомолекулярного скрининга . 9 (6): 498–505. дои : 10.1177/1087057104267605 . ПМИД 15452336 . S2CID 7135803 .
- ^ Jump up to: а б Чан Дж.Н., Вукович Д., Слено Л., Олсен Дж.Б., Погуце О., Хавугимана П. и др. (июль 2012 г.). «Идентификация мишени методом хроматографического совместного элюирования: мониторинг взаимодействий лекарственного средства и белка без иммобилизации или химической дериватизации» . Молекулярная и клеточная протеомика . 11 (7): М111.016642. дои : 10.1074/mcp.M111.016642 . ПМЦ 3394955 . ПМИД 22357554 .
- ^ Мэн XY, Чжан ХХ, Мезей М, Цуй М (июнь 2011 г.). «Молекулярный стыковка: мощный подход к открытию лекарств на основе структуры» . Современный компьютерный дизайн лекарств . 7 (2): 146–157. дои : 10.2174/157340911795677602 . ПМК 3151162 . ПМИД 21534921 .
- ^ Jump up to: а б с Ян С.Ю. (июнь 2010 г.). «Моделирование фармакофоров и их применение при открытии лекарств: проблемы и последние достижения». Открытие наркотиков сегодня . 15 (11–12): 444–450. дои : 10.1016/j.drudis.2010.03.013 . ПМИД 20362693 . S2CID 12843569 .
- ^ Хедкар С.А., Малде А.К., Коутиньо ЕС, Шривастава С. (март 2007 г.). «Фармакофорное моделирование при открытии и разработке лекарств: обзор». Медицинская химия . 3 (2): 187–197. дои : 10.2174/157340607780059521 . ПМИД 17348856 .
- ^ Jump up to: а б с д Спрэдлин Дж. Н., Чжан Э., Номура Д. К. (апрель 2021 г.). «Переосмысление возможности применения лекарств с использованием хемопротеомных платформ». Отчеты о химических исследованиях . 54 (7): 1801–1813. doi : 10.1021/acs.accounts.1c00065 . ПМИД 33733731 . S2CID 232303398 .
- ^ Jump up to: а б с д Хаас П., Муралидхаран М., Кроган Н.Дж., Кааке Р.М., Хюттенхайн Р. (февраль 2021 г.). «Протеомные подходы к изучению биологии SARS-CoV-2 и патологии COVID-19» . Журнал исследований протеома . 20 (2): 1133–1152. doi : 10.1021/acs.jproteome.0c00764 . ПМЦ 7839417 . ПМИД 33464917 .
- ^ Дэн Х., Лэй Ц., Ву Ю., Хэ Ю., Ли В. (апрель 2020 г.). «Профилирование белков на основе активности: последние достижения медицинской химии». Европейский журнал медицинской химии . 191 : 112151. doi : 10.1016/j.ejmech.2020.112151 . ПМИД 32109778 . S2CID 211564093 .
- ^ Нокарт М., Грей Н., Дэмиенс Э., Чанг Ю.Т., Греллиер П., Грант К. и др. (июнь 2000 г.). «Внутриклеточные мишени ингибиторов циклинзависимых киназ: идентификация методом аффинной хроматографии с использованием иммобилизованных ингибиторов» . Химия и биология . 7 (6): 411–422. дои : 10.1016/s1074-5521(00)00124-1 . ПМИД 10873834 .
Отрасли химии | |
|---|---|
| Аналитический | |
| Теоретический | |
| Физический | |
| Неорганический | |
| Органический | |
| Биологический | |
| Междисциплинарность | |
| См. также | |
