RecBCD
| Экзодезоксирибонуклеаза V | |||
|---|---|---|---|
 | |||
| Идентификаторы | |||
| Номер ЕС. | 3.1.11.5 | ||
| Номер CAS. | 37350-26-8 | ||
| Базы данных | |||
| ИнтЭнк | вид IntEnz | ||
| БРЕНДА | БРЕНДА запись | ||
| Экспаси | Просмотр NiceZyme | ||
| КЕГГ | КЕГГ запись | ||
| МетаЦик | метаболический путь | ||
| ПРЯМОЙ | профиль | ||
| PDB Структуры | RCSB PDB PDBe PDBsum | ||
| |||
Экзодезоксирибонуклеаза V (EC 3.1.11.5, RecBCD, экзонуклеаза V, экзонуклеаза V Escherichia coli , экзонуклеаза V E. coli , ген эндофермента RecBC, дезоксирибонуклеаза RecBC, ген ДНКаза RecBC, ген ферментов RecBCD ) представляет собой фермент , E. coli инициирующий рекомбинационную репарацию. потенциально смертельных двухцепочечных ДНК разрывов Это может быть результатом ионизирующего излучения , ошибок репликации, эндонуклеаз , окислительного повреждения и множества других факторов. [ 2 ] [ 3 ] Фермент RecBCD представляет собой одновременно хеликазу , которая раскручивает или разделяет цепи ДНК, и нуклеазу , которая делает одноцепочечные разрывы в ДНК. [ 1 ] Он катализирует экзонуклеолитическое расщепление (в присутствии АТФ) либо в направлении от 5'-к 3'-, либо от 3'-к 5'-направлению с образованием 5'-фосфоолигонуклеотидов.
Структура
[ редактировать ]Ферментный комплекс состоит из трех различных субъединиц, называемых RecB, RecC и RecD, поэтому комплекс получил название RecBCD (рис. 1). До открытия RecD гена [ 4 ] фермент был известен как «RecBC». Каждая субъединица кодируется отдельным геном:
| ген | цепь | белок | функция |
|---|---|---|---|
| RecB | б | P08394 | 3'-5'-геликаза, нуклеаза |
| запись | с | P07648 | Распознает Чи ( переходная горячая точка и инициатор ) |
| запись | а | P04993 | 5'-3' геликаза |
Функция
[ редактировать ]
Субъединицы RecD и RecB являются хеликазами, т.е. энергозависимыми молекулярными моторами, которые раскручивают ДНК (или РНК в случае других белков). Субъединица RecB, кроме того, выполняет нуклеазную функцию. [ 5 ] Наконец, фермент RecBCD (возможно, субъединица RecC) распознает специфическую последовательность в ДНК, 5'- GCTGGTGG -3' , известную как Chi (иногда обозначаемую греческой буквой χ).
RecBCD необычен среди геликаз, поскольку имеет две геликазы, которые движутся с разной скоростью. [ 6 ] и потому что он может распознавать и изменять последовательность ДНК Хи. [ 7 ] [ 8 ] RecBCD активно связывает конец линейной двухцепочечной (ds) ДНК. Хеликаза RecD перемещается по цепи с 5'-концом, на которой фермент инициирует раскручивание, а RecB - по цепи с 3'-концом. RecB медленнее, чем RecD, поэтому одноцепочечная (ss) петля ДНК накапливается перед RecB (рис. 2). В результате образуются структуры ДНК с двумя ss-хвостами (более коротким 3'-концевым хвостом и более длинным 5'-концевым хвостом) и одной ss-петлей (на 3'-концевой цепи), наблюдаемыми с помощью электронной микроскопии. [ 9 ] Хвосты из нержавеющей стали могут отжигаться с образованием второй петли из нержавеющей стали, дополнительной к первой; такие двухпетлевые структуры первоначально назывались «кроличьими ушами».
Механизм действия
[ редактировать ]
При раскручивании нуклеаза в RecB может действовать по-разному в зависимости от условий реакции, в частности соотношения концентраций Mg 2+ ионы и АТФ. (1) Если АТФ в избытке, фермент просто разрывает цепь с Chi (цепь с начальным 3'-концом) (рис. 2). [ 10 ] [ 11 ] Раскручивание продолжается и приводит к образованию хвоста длиной 3 фута, в конце которого находится Ци. Этот хвост может быть связан с белком RecA, который способствует обмену цепей с интактным гомологичным дуплексом ДНК. [ 12 ] Когда RecBCD достигает конца ДНК, все три субъединицы разбираются, и фермент остается неактивным в течение часа или более; [ 13 ] Молекула RecBCD, действовавшая на Chi, не атакует другую молекулу ДНК. (2) Если Мг 2+ ионов в избытке, RecBCD эндонуклеолитически расщепляет обе цепи ДНК, хотя 5'-хвост расщепляется реже (рис. 3). [ 14 ] Когда RecBCD встречает участок Chi на 3'-концевой цепи, паузы в раскручивании и переваривание 3'-конца замедляются. [ 15 ] Когда RecBCD возобновляет раскручивание, он теперь расщепляет противоположную цепь ( т. е. 5'-хвост). [ 16 ] [ 17 ] и загружает белок RecA на 3'-концевую цепь. [ 12 ] Завершив реакцию на одной молекуле ДНК, фермент быстро атакует вторую ДНК, на которой происходят те же реакции, что и на первой ДНК.
Хотя ни одна реакция не была подтверждена анализом внутриклеточной ДНК, из-за временного характера промежуточных продуктов реакции генетические данные указывают на то, что первая реакция более близко имитирует реакцию в клетках. [ 2 ] Например, на активность Chi влияют нуклеотиды с его 3'-стороны как в клетках, так и в реакциях с избытком АТФ, но не с Mg. 2+ в избытке [PMID 27401752, 27330137]. Мутанты RecBCD, лишенные обнаруживаемой экзонуклеазной активности, сохраняют высокую активность горячих точек Chi в клетках и разрывают Chi вне клеток. [ 18 ] Сайт Chi на одной молекуле ДНК в клетках снижает или устраняет активность Chi на другой ДНК, возможно, отражая Chi-зависимую разборку RecBCD, наблюдаемую in vitro в условиях избытка АТФ и разрыва ДНК по Chi. [ 19 ] [ 20 ]
В обоих условиях реакции 3'-цепь остается неповрежденной ниже Chi. Затем белок RecA активно загружается на 3'-хвост с помощью RecBCD. [ 12 ] В какой-то неопределенный момент RecBCD диссоциирует от ДНК, хотя RecBCD может раскрутить по крайней мере 60 т.п.н. ДНК, не отваливаясь. RecA инициирует замену цепи ДНК, с которой она связана, на идентичную или почти идентичную цепь в интактном дуплексе ДНК; в результате этого обмена цепями образуется совместная молекула ДНК, такая как D-петля (рис. 2). Считается, что совместная молекула ДНК разделяется либо путем репликации, инициируемой вторгающейся 3'-концевой цепью, содержащей Chi, либо путем расщепления D-петли и образования соединения Холлидея. Соединение Холлидея может быть преобразовано в линейную ДНК с помощью комплекса RuvABC или диссоциировано белком RecG . Каждое из этих событий может генерировать интактную ДНК с новыми комбинациями генетических маркеров, по которым родительские ДНК могут отличаться. Этот процесс, гомологичная рекомбинация , завершает восстановление двухцепочечного разрыва ДНК.
Приложения
[ редактировать ]RecBCD — это модельный фермент, позволяющий использовать флуоресценцию одиночных молекул в качестве экспериментального метода, используемого для лучшего понимания функции взаимодействий белок-ДНК. [ 21 ] Фермент также полезен для удаления линейной ДНК, как одно-, так и двухцепочечной, из препаратов кольцевой двухцепочечной ДНК, поскольку для активности ему требуется конец ДНК.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б Синглтон М.Р., Диллингем М.С., Годье М., Ковальчиковски С.К., Вигли Д.Б. (ноябрь 2004 г.). «Кристаллическая структура фермента RecBCD раскрывает механизм обработки разрывов ДНК». Природа . 432 (7014): 187–93. Бибкод : 2004Natur.432..187S . дои : 10.1038/nature02988 . ПМИД 15538360 . S2CID 2916995 .
- ^ Jump up to: а б Смит, Г. Р. (июнь 2012 г.). «Как фермент RecBCD и Chi способствуют восстановлению и рекомбинации разрывов ДНК: взгляд молекулярного биолога» . Микробиол Мол Биол Rev. 76 (2): 217–28. дои : 10.1128/MMBR.05026-11 . ПМЦ 3372252 . ПМИД 22688812 .
- ^ Шпионы М., Ковальчиковский СК (2003). «Гомологичная рекомбинация по путям RecBCD и RecF». В Хиггинсе П. (ред.). Бактериальные хромосомы . Вашингтон, округ Колумбия: ASM Press. стр. 389–403. ISBN 1-55581-232-5 .
- ^ Амундсен С.К., Тейлор А.Ф., Чаудхури А.М., Смит Г.Р. (август 1986 г.). « recD : ген незаменимой третьей субъединицы экзонуклеазы V». Proc Natl Acad Sci США . 83 (15): 5558–62. Бибкод : 1986PNAS...83.5558A . дои : 10.1073/pnas.83.15.5558 . ПМК 386327 . ПМИД 3526335 .
- ^ Ю М., Суая Дж., Жюлин Д.А. (февраль 1998 г.). «С-концевой домен белка RecB массой 30 кДа имеет решающее значение для нуклеазной активности, но не геликазной активности фермента RecBCD из Escherichia coli » . Proc Natl Acad Sci США . 95 (3): 981–6. Бибкод : 1998PNAS...95..981Y . дои : 10.1073/pnas.95.3.981 . ЧВК 18645 . ПМИД 9448271 .
- ^ Тейлор А.Ф., Смит Г.Р. (июнь 2003 г.). «Фермент RecBCD представляет собой ДНК-геликазу с быстрым и медленным моторами противоположной полярности». Природа . 423 (6942): 889–93. Бибкод : 2003Natur.423..889T . дои : 10.1038/nature01674 . ПМИД 12815437 . S2CID 4302346 .
- ^ Тейлор А.Ф., Смит Г.Р. (июнь 1992 г.). «Фермент RecBCD изменяется при разрезании ДНК в горячей точке рекомбинации Чи» . Proc Natl Acad Sci США . 89 (12): 5226–30. Бибкод : 1992PNAS...89.5226T . дои : 10.1073/pnas.89.12.5226 . ПМК 49264 . ПМИД 1535156 .
- ^ Амундсен С.К., Тейлор А.Ф., Редди М., Смит Г.Р. (декабрь 2007 г.). «Межсубъединичная передача сигналов в ферменте RecBCD, сложной белковой машине, регулируемой горячими точками Чи» . Генс Дев . 21 (24): 3296–307. дои : 10.1101/gad.1605807 . ПМК 2113030 . ПМИД 18079176 .
- ^ Тейлор А., Смит Г.Р. (ноябрь 1980 г.). «Раскручивание и перемотка ДНК ферментом RecBC». Клетка . 22 (2, часть 2): 447–57. дои : 10.1016/0092-8674(80)90355-4 . ПМИД 6256081 . S2CID 22123298 .
- ^ Понтичелли, А.С.; Шульц, Д.В.; Тейлор, А.Ф.; Смит, Г. Р. (май 1985 г.). «Хи-зависимое расщепление цепи ДНК ферментом RecBC». Клетка . 41 (1): 145–151. дои : 10.1016/0092-8674(85)90069-8 . ПМИД 3888404 . S2CID 38361329 .
- ^ Тейлор А.Ф., Шульц Д.В., Понтичелли А.С., Смит Г.Р. (май 1985 г.). «Фермент RecBC, разрезающий сайты Chi во время раскручивания ДНК: расположение и зависимость от ориентации разреза». Клетка . 41 (1): 153–63. дои : 10.1016/0092-8674(85)90070-4 . ПМИД 3888405 . S2CID 8551482 .
- ^ Jump up to: а б с Андерсон Д.Г., Ковальчиковски СК (июль 1997 г.). «Транлоцирующий фермент RecBCD стимулирует рекомбинацию, направляя белок RecA на оцДНК Chi-регулируемым способом» . Клетка . 90 (1): 77–86. дои : 10.1016/S0092-8674(00)80315-3 . ПМИД 9230304 .
- ^ Тейлор А.Ф., Смит Г.Р. (апрель 1999 г.). «Регуляция гомологичной рекомбинации: Chi инактивирует фермент RecBCD путем разборки трех субъединиц» . Генс Дев . 13 (7): 890–900. дои : 10.1101/gad.13.7.890 . ПМК 316601 . ПМИД 10197988 .
- ^ Диксон Д.А., Ковальчиковски СК (апрель 1993 г.). «Горячая точка рекомбинации Chi представляет собой регуляторную последовательность, которая действует путем ослабления нуклеазной активности фермента RecBCD E. coli ». Клетка . 73 (1): 87–96. дои : 10.1016/0092-8674(93)90162-J . ПМИД 8384931 . S2CID 19718817 .
- ^ Спайс М., Амитани И., Баскин Р.Дж., Ковальчиковски С.К. (ноябрь 2007 г.). «Ферментные переключатели RecBCD приводят моторные субъединицы в ответ на распознавание Ци» . Клетка . 131 (4): 694–705. дои : 10.1016/j.cell.2007.09.023 . ПМК 2151923 . ПМИД 18022364 .
- ^ Тейлор А.Ф., Смит Г.Р. (октябрь 1995 г.). «Специфичность цепи разрыва ДНК в сайтах Chi ферментом RecBCD. Модуляция за счет уровня АТФ и магния» . J Биол Хим . 270 (41): 24459–67. дои : 10.1074/jbc.270.41.24459 . ПМИД 7592661 .
- ^ Андерсон Д.Г., Ковальчиковски СК (март 1997 г.). «Горячая точка рекомбинации ци является регуляторным элементом, который переключает полярность деградации ДНК ферментом RecBCD» . Генс Дев . 11 (5): 571–81. дои : 10.1101/gad.11.5.571 . ПМИД 9119222 .
- ^ Амундсен С.К., Смит Г.Р. (январь 2007 г.). «Активность горячей точки Chi в Escherichia coli без активности экзонуклеазы RecBCD: значение для механизма рекомбинации» . Генетика . 175 (1): 41–54. дои : 10.1534/genetics.106.065524 . ПМК 1774988 . ПМИД 17110484 .
- ^ Кеппен А., Кробич С., Томс Б., Вакернагель В. (июль 1995 г.). «Взаимодействие с горячей точкой рекомбинации Chi in vivo превращает фермент RecBCD Escherichia coli в Chi-независимую рекомбиназу путем инактивации субъединицы RecD» . Proc Natl Acad Sci США . 92 (14): 6249–53. Бибкод : 1995PNAS...92.6249K . дои : 10.1073/pnas.92.14.6249 . ПМК 41495 . ПМИД 7541534 .
- ^ Майерс Р.С., Кузьминов А., Шталь Ф.В. (июль 1995 г.). «Горячая точка рекомбинации Chi активирует рекомбинацию RecBCD, превращая Escherichia coli в мутантную фенокопию RecD» . Proc Natl Acad Sci США . 92 (14): 6244–8. Бибкод : 1995PNAS...92.6244M . дои : 10.1073/pnas.92.14.6244 . ПМК 41494 . ПМИД 7603978 .
- ^ Бьянко П.Р., Брюэр Л.Р., Корзетт М., Балхорн Р., Йех Ю., Ковальчиковски С.К., Баскин Р.Дж. (январь 2001 г.). «Процессивная транслокация и раскручивание ДНК отдельными молекулами фермента RecBCD». Природа . 409 (6818): 374–8. Бибкод : 2001Natur.409..374B . дои : 10.1038/35053131 . ПМИД 11201750 . S2CID 4399125 .
Внешние ссылки
[ редактировать ]- Экзодезоксирибонуклеаза + V в Национальной медицинской библиотеке США по медицинским предметным рубрикам (MeSH)
- Экзодезоксирибонуклеаза + V, + E + coli в Национальной медицинской библиотеке США по медицинским предметным рубрикам (MeSH)
- ЭК 3.1.11.5
